BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN Validasi merupakan proses penilaian terhadap parameter analitik tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa metode tersebut memenuhi syarat sesuai tujuan penggunaannya. Pengujian parameter kecermatan dilakukan metode spikedplacebo recovery dengan menggunakan 3 plasebo dan 3 larutan baku. Sampel yang digunakan memiliki kandungan zat aktif sebesar 0,02% sehingga kriteria kecermatan yang diperbolehkan untuk rata-rata persen perolehan kembali sebesar 90-107%. Dari hasil pengukuran larutan baku dan sampel serta koreksi dari plasebo, diperoleh rata-rata persen perolehan kembali sebesar 99.49 ± 1.59%. Berdasarkan parameter kecermatan, pengukuran sampel dengan rata-rata perolehan kembali 99.49 ± 1.59% memenuhi syarat rentang persen perolehan kembali. Dari data tersebut dapat diketahui bahwa larutan baku dan larutan sampel setelah penyaringan memiliki konsentrasi diklazuril yang hampir sama dan terjadi pemisahan sempurna antara diklazuril dengan β karoten, zeaxantin, dan xantofil yang diduga dapat mengganggu pengukuran. Hal ini karena silika gel memiliki sifat yang polar sehingga dapat mengikat atau menahan senyawa-senyawa yang terdapat dalam bahan pembawa tersebut dan diklazuril dapat secara langsung dilewatkan karena bersifat lebih nonpolar. Selain itu, fungsi kromatografi kolom ini adalah untuk menyaring partikelpartikel yang besar agar tidak dapat melewati kolom dan tidak terelusi. 16
17 Tabel 1. Pengukuran Kecermatan Baku Sampel Rata-rata Konsentrasi Kadar Perolehan Serapan Serapan (mg/ml) Kembali 0.2464 0.2533 0.2462 0.2499 0.016 0.016 0,016mg/mL 0.2443 0.2492 0.016 0.2479 0.2457 0.015 98.4% 0.2478 0.24794±(0.0032) 0.2447 0.24714±(0.0022) 0.015 0.016 0.3231 0.3211 0.3142 0.3178 0,02mg/mL 0.3255 0.3228 0.3043 0.3222 100.07% 0.3120 0.31720±(0.0084) 0.3259 0.32058±(0.0044) 0.021 0.4414 0.4496 0.4347 0.4389 0,028mg/mL 0.4276 0.4382 0.4232 0.4366 99.99% 0.4313 0.43462±(0.0100) 0.4403 0.43774±(0.0020) Keterangan : nilai rata-rata serapan blanko sebesar 0.00316±(0.0003) digunakan sebagai koreksi dari sampel Pengujian parameter keseksamaan sistem atau keseksamaan sistem dilakukan untuk pengujian sistem yang digunakan yaitu spektrofotometer ultraviolet Beckmann DU-600 dan dilakukan pengukuran berulang sebanyak 6 kali pengukuran menggunakan baku mg/ml pada λ 282 nm. Hasil pengukuran memiliki rataan serapan sebesar 0.27475 ± 0.0015 dan koefisien variansi sebesar 0,673%. Kriteria koefisien variansi yang diperbolehkan untuk konsentrasi 0,020 mg/ml adalah kurang dari 2%. Dari hasil pengujian Keseksamaan sistem menunjukkan bahwa alat spektrofotometri ultraviolet Beckmann DU-600 yang digunakan memenuhi persyaratan dan memiliki ketertiruan dan keterulangan yang tinggi. Keterulangan ini diperlukan dalam pengukuran analit dalam jumlah yang besar.
18 Tabel 2. Pengukuran Keseksamaan Sistem Pengukuran 1 0.2764 2 0.2774 3 0.2745 4 0.2743 5 0.2724 6 0.2735 Rataan 0.27475±(0.0015) SB 0.00185 KV 0.673% Kriteria KV 2% Pengujian keseksamaan metode yang digunakan untuk mengetahui keterulangan metode yang dilakukan yaitu dengan pengukuran sebanyak 6 sampel mg/ml pada λ 282 nm. Hasil pengujian diperoleh rataan sebesar 0.274 ± 0.0009 dengan koefisien variansi 0.415%. Kriteria kofisien variansi yang diperbolehkan untuk konsentrasi 0,020 mg/ml adalah kurang dari 2%. Hasil pengujian keseksamaan metode menunjukkan bahwa metode yang digunakan memenuhi persyaratan keseksamaan dan dapat digunakan untuk sampel dalam jumlah besar.
19 Tabel 3. Pengukuran Keseksamaan Metode Pengukuran 1 0.2754 2 0.2737 3 0.2744 4 0.2748 5 0.2725 6 0.2755 Rataan 0.27438±(0.0009) SB 0.00114 KV 0.415% Kriteria KV 2% Kelinieran adalah kemampuan metode analisis menunjukkan respon secara langsung atau matematis, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel pada rentang tertentu. (Ibrahim, 2005). Penentuan kurva kalibrasi dilakukan dengan menggunakan 5 larutan baku dengan konsentrasi 0.012mg/mL; 0.016mg/mL; mg/ml; 0.024mg/mL dan 0,028 mg/ml pada λ 282 nm. Dari pengukuran diperoleh persamaan garis linear Y = 0.004844 + 15.505 X dengan koefisien korelasi (r) 0.999 dan nilai koefisien variasi fungsi regresi (V x0 ) yang diperoleh adalah 1.725%. Hasil percobaan menunjukkan V x0 masih berada dalam batas yang diperbolehkan. Nilai V x0 yang kecil menandakan kelinieran yang cukup, biasanya V x0 2.0% digunakan untuk kurva baku penetapan kadar obat dalam sediaan atau bahan baku (Ibrahim,2005). Untuk mengetahui adanya korelasi antara konsentrasi dan hasil pengukuran absorbansi dilakukan pengujian t gawat. Hasil pengujian t gawat menunjukkan t hitung 36.637 jauh lebih besar daripada t tabel untuk aras keberartian 0.05 dan derajat kebebasan 4 yaitu sebesar 2.132 dan hasil ini menunjukkan terdapatnya korelasi antara konsentrasi dan hasil pengukuran absorbansi.
20 Tabel 4. Pengukuran Linieritas Konsentrasi 0.012mg/mL 0.016mg/mL mg/ml 0.024mg/mL mg/ml 0.1882 0.1901 0.1894 0.1946 0.1978 0.19202±(0.0034) 0.2464 0.2533 0.2443 0.2479 0.2478 0.24794±(0.0028) 0.3231 0.3211 0.3255 0.3043 0.3120 0.31720±(0.0075) 0.3794 0.3827 0.3853 0.3854 0.3819 0.38294±(0.0024) 0.4414 0.4496 0.4276 0.4232 0.4313 0.43462±(0.0092) Kurva Kalibrasi 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 y = 15.505x + 0.0048 R 2 = 0.998 0 0.01 0.02 0.03 Konsentrasi (mg/ml) Gambar 2. Hubungan konsentrasi terhadap absorbansi
21 3.3S 3 y x 3.3 5.35 10 LOD = = = b 15.505 10S 3 y x 10 5.35 10 LOQ = = = b 15.505 3 1.14 10 mg/ml 3 3.45 10 mg/ml Kepekaan hasil analisis ditunjukkan oleh parameter batas deteksi dan batas kuantisasi. Batas deteksi adalah konsentrasi analit terkecil yang memberi sinyal instrumen yang berbeda secara nyata dari sinyal blanko dan sinyal latar belakang. Sedangkan batas kuantisasi adalah konsentrasi analit terkecil yang masih dapat dikuantisasi secara cermat dan seksama (Ibrahim, 2004). Batas deteksi dan batas kuantisasi metode perlu ditentukan kalau metode tersebut digunakan untuk menganalisis sampel yang mengandung analit berkadar rendah. Batas deteksi dan kuantisasi ini ditentukan dari data kurva kalibrasi. Hasil perhitungan menunjukkan batas deteksi 1.14 µg/ml dan batas kuantisasi 3.45 µg/ml dan semua konsentrasi baku yang digunakan untuk kurva kalibrasi berada di atas batas kuantisasi. Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analis, instrumen lot pereaksi, waktu, suhu, hari yang berbeda. Untuk uji ketangguhan pada penelitian ini dilakukan pengujian dalam hari dan pengujian antar hari. Pada pengujian dalam hari, pengujian dilakukan pada pagi hari dan sore hari untuk baku mg/ml pada λ 282 nm dan dihitung koefisien variansinya. Dari pengukuran yang dilakukan pada pagi hari memiliki koevisien variansi 2.21% sedangkan pada sore hari, koefisien variansinya adalah 1.40%. Koefisien variansi pada pagi hari dan sore hari memenuhi kriteria koefisien variansi untuk larutan dengan konsentrasi 9.028 mg/ml sebesar 3.426% sehingga keseksamaan dalam hari tinggi, dan pengujian dalam hari tidak berbeda bermakna. Pada pengujian antar hari, dilakukan pengukuran baku mg/ml yang sama selama 3 hari dan hasil pengukuran yang telah dianalisis variansinya, nilai F hitung sebesar 1 lebih kecil dari F tabel sebesar 3.87 untuk aras 0.05 maupun 7.19 untuk aras 0.01. F hitung < F tabel, maka keseksamaan antar hari tinggi, dan pengujian antar hari tidak berbeda bermakna.
22 Tabel 5. Pengukuran Keseksamaan Dalam Hari Pengukuran Pagi Sore 1 0.4414 0.4237 2 0.4496 0.4312 3 0.4276 0.4152 4 0.4232 0.4179 5 0.4313 0.4167 Rataan 0.43462±(0.0092) 0.42094±(0.0056) SB 0.0096 0.0059 KV 2.21% 1.40% Tabel 6. Pengukuran Keseksamaan Antar Hari Pengukuran Hari ke 1 Hari ke 3 1 0.2764 0.2761 2 0.2774 0.2899 3 0.2745 0.2945 4 0.2743 0.2993 5 0.2724 0.2753 6 0.2735 0.2839 7 0.2789 0.2831 Rataan 0.27534±(0.0018) 0.2860±(0.0032) SB 0.00249 0.00836 KV 0.904% 2.920%
23 JK = total x 2 ( x) 2 n 15.4410 JK total = 1.1038- =0.00087 14 JK = perlakuan T ( x1) ( x2) ( x) 2 2 2 + n n n 1 2 3.7149 4.0084 15.4410 JK perlakuan = + - =0.0004 7 7 14 JK = JK JK JK galat Total Perlakuan galat = 0.00087 0.0004 = 0.00047 T Tabel 7. Perhitungan Uji F Sumber JK dk KR (JK/dk) Perlakuan 0.0004 6 0.000067 Galat 0.00047 7 0.000067 Total 0.001 13 F hitung KR = F = = perlakuan 1 6,7 KRgalat ( ) Untuk Aras 0.05; F tabel = 3.87 Untuk Aras 0.01; F tabel = 7.19 F hitung < F tabel, maka presisi antar hari tinggi, antar hari tidak berbeda bermakna.