UJI SITOTOKSISITAS FRAKSI ETANOL DARI EKSTRAK ETANOL 70% BUAH PARE (Momordica charantia L.) TERHADAP SEL HeLa Cytotoxicity assay ethanol fraction of ethanol 70% extract of bitter melon fruit (Momordica charantia L.) on HeLa cell Gandes Kusuma Ningrum, Kusmardi dan Hadi Sunaryo Fakultas Farmasi dan Sains Universitas Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka Abstract In a previous research ethanol 70% extract of bitter melon fruit against HeLa cells had LC 50 values of 51.56 µg / ml. According to this research aimed at determining the cytotoxic effect of ethanol fraction of ethanol 70% extract of bitter melon fruit the HeLa cells. Cytotoxicity assay performed in vitro by viable cell count. Fraction of ethanol from ethanol 70% extract of bitter melon fruit Five concentrations for the assay solution was 130; 81.89; 51.58; 32.49; 20.46 µg / ml. Cells mix to Cisplatin as a positive control with five concentration was 3; 2;, 1; 0.5; and 0.25 µg / ml. Cells mix to media as a negative control, cells mix to DMSO as a solvent control. And then the test was performed of HeLa cells with incubation for 24 and 48 hours. Results obtained LC 50 Cisplatin 24 hour incubation at 0.4075 µg / ml, the ethanol fraction LC 50 of ethanol 70% extract of 24 and 48 hour incubation at 48.5736 and 32.87 µg / ml. It can be concluded that ethanol fraction of ethanol 70% extract bitter melon fruit (Momordica charantia L.) have cytotoxic effect of HeLa cells are included in the range are extremely toxic 5-50 µg/ml and has the potential for anticancer drug. Keywords: Momordica charantia L., Cytotoxicity, HeLa cell Abstrak Pada penelitian sebelumnya dengan menggunakan ekstrak etanol 70% buah pare terhadap sel HeLa memiliki nilai LC 50 51,56 μg/ml. Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan penelitian ini yang bertujuan untuk mengetahui efek sitotoksik fraksi etanol dari ekstrak etanol 70% buah pare terhadap sel HeLa sehingga diketahui nilai LC 50. Uji sitotoksisitas dilakukan secara in vitro dengan metode perhitungan langsung. Fraksi etanol dari ekstrak etanol 70% sebagai larutan uji dibuat 5 konsentrasi yaitu 130; 81,89; 51,58; 32,49; 20,46; μg/ml. Sel ditambah Cisplatin sebagai kontrol positif dibuat 5 konsentrasi yaitu 3; 2; 1; 0,5; dan 0,25 µg/ml. Sel ditambah media sebagai kontrol negatif, sel ditambah DMSO sebagai kontrol pelarut. Kemudian dilakukan pengujian terhadap sel HeLa dengan masa inkubasi dilakukan dalam waktu 24 jam dan 48 jam. Hasil didapatkan LC 50 Cisplatin inkubasi 24 jam sebesar 0,4075 µg/ml, LC 50 Fraksi etanol dari ekstrak etanol 70% inkubasi 24 dan 48 jam sebesar 48,5736 dan 32,87 µg/ml. Dapat disimpulkan bahwa fraksi etanol dari ekstrak etanol 70% buah pare (Momordica charantia L.) memiliki sifat sitotoksik terhadap sel HeLa yang masuk dalam rentang amat sangat toksik yaitu 5-50 µg/ml dan memiliki potensi untuk obat antikanker. Kata kunci : Momordica charantia L., Sitotoksisitas, Sel HeLa
PENDAHULUAN Sel HeLa diturunkan dari sel epitel kanker leher rahim manusia. Tahap awal munculnya kanker rahim dimulai dengan terjadinya mutasi sel secara bertahap, tetapi progresif dan akhirnya berkembang menjadi karsinoma. Kanker atau karsinoma adalah setiap pembentukan jaringan baru yang abnormal dan bersifat ganas (maligne). Suatu komplek sel yang mendadak menjadi liar dan memperbanyak diri secara pesat dan terus menerus (proliferasi) (Direktorat pengendalian penyakit tidak menular, 2009). Salah satu masalah yang mempersulit upaya pengobatan kanker adalah kondisi sosial ekonomi sebagian besar masyarakat yang belum memadai. Maka perlu dilakukan alternatif lain yaitu dengan menggunakan senyawa bahan alam. Tanaman pare merupakan jenis tanaman yang banyak terdapat di daerah semak, semusim menjalar atau merambat. Buah Pare mengandung beberapa senyawa aktif yang sudah diketahui antara lain saponin, flavonoid, alkaloid dan triterpenoid yang bersifat toksik (Subahar, TS, 2004). Untuk uji sitotoksisitas penggunaan kultur sel (sel mamalia) pada hewan semakin disenangi karena berbagai alasan, diantaranya mampu menurunkan mahalnya biaya percobaan menggunakan hewan secara konvensial, selain dengan menggunakan kultur sel mekanisme toksisitas biokimia dapat dikerjakan dengan lebih efektif karena kondisi lingkungan sel lebih mudah dikontrol dan dimodifikasi (Nefrialdi dan Gan, S, 1995). Ekstrak etanol 70% buah pare (Momordica charantia. L) telah dilaporkan memiliki efek sitotoksik dengan nilai LC50 51,56 µg/ml (Martini, dkk, 2005). Penelitian ini merupakan rangkaian penelitian untuk mengetahui apakah fraksi etanol dari ekstrak etanol 70% buah pare (Momordica charantia. L) dapat memiliki efek sitotoksik terhadap sel HeLa. METODOLOGI PENELITIAN Alat Toples kaca, timbangan analitik, gelas ukur, rotary evaporator, lemari es, oven, corong pisah, cawan petri, labu kultur jaringan, plate kultur jaringan, LAF, inkubator sel CO2 5%, pendingin, alat suntik, tabung Eppendorf, tabung dan alat sentrifuse, mikropipet, syringe filter 0,2µm, alat-alat gelas, timbangan analitik, ph mater, mikroskop, haemocytometer, tabung conical, flask kultur, kamera digital. Bahan Buah pare segar, kultur sel HeLa, etanol 70%, etilasetat, dimetil sulfoksida (DMSO), medium kultur Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640), Fetal Bovine Serum (FBS) 10%, alkohol, fungizon, Phospat Buffer Salina (PBS), natrium bikarbonat, dinatrium hidrogen fosfat, natrium klorida (NaCl), biru tripan, akuabides, cisplatin. Prosedur Ekstraksi Buah Pare Buah pare segar diambil, dikumpulkan dan dibersihkan dari kotoran yang melekat kemudian dicuci dengan air bersih dan dibuang bijinya, lalu dirajang kecil-kecil kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di udara terbuka terlindung dari sinar matahari. Simplisia yang sudah kering kemudian diserbukkan dan diayak. Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi yaitu dengan memasukkan 1,1 kg serbuk kering simplisia kedalam maserator kemudian tambahkan etanol 70% ke dalam botol sampai seluruh simplisia terendam, botol ditutup rapat. Rendam selama 6 jam pertama sambil sesekali diaduk, kemudian didiamkan selama 18 jam. Dipisahkan maserat dengan menggunakan kertas saring, diulangi proses penyarian sekurang-kurangnya dua kali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama.
Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan vakum rotary evaporator pada suhu 50 C hingga kental tetapi masih bisa dituang. Kemudian dikeringkan di dalam oven pada suhu 40 C (Farmakope Herbal, 2008). Fraksinasi Buah Pare Masukkan ekstrak etanol 70% buah pare ke dalam corong pisah. Kemudian di fraksinasi dengan pelarut n-heksan dengan perbandingan (1:1), kocok selama ± 15 menit. Setelah didiamkan beberapa lama terbentuk 2 lapisan, yaitu lapisan n-heksan dengan lapisan etanol 70%. Lapisan n-heksan ( bagian atas ) dipisahkan dengan membuka kran (corong) pisah sampai lapisan etanol habis. Diambil lapisan n-heksan kemudian dipisahkan sebagai fraksi n-heksan. Lapisan etanol kemudian difraksinasi kembali dengan pelarut etil asetat dengan perbandingan (1:1), kocok selama ± 15 menit. Setelah didiamkan beberapa lama terbentuk 2 lapisan, yaitu lapisan etil asetat ( bagian atas ) dan lapisan etanol 70% (bagian bawah). Lapisan etil asetat dipisahkan dengan membuka kran corong pisah sampai lapisan etanol habis. Diambil lapisan etanol 70% kemudian dipisahkan sebagai fraksi etanol. Fraksi etanol diuapkan dengan vacum rotary evaporator pada suhu 50ºC hingga kental tapi masih bisa dituang. Kemudian fraksi tersebut dikeringkan dalam oven pada suhu 40ºC ( Sediaan Galenik, 1986). Hitung rendemen, susut pengeringan dan identifikasi golongan kimia fraksi etanol (Materia medika Indonesia jilid V, 1989). Pemanenan dan penghitungan sel HeLa Sel HeLa dicuci tiga kal dengan 10 ml PBS. Kemudian ditambahkan 3 ml PBS dan 1 ml tripsin untuk melepaskan sel dari dinding flask. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril, ditambahkan medium hingga 10 ml, suspensi sel di sentrifuse dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Pelet yang diperoleh dibuang, supernatan disuspensikan dalam 10 ml media RPMI 1640 dihitung jumlah selnya menggunakan hemositometer dengan mencampurkan 20 μl suspensi sel dengan 180 μl tripan blue di bawah mikroskop. Sebanyak 10 μl campuran dipipet ditaruh pada permukaan kamar hitung dengan menyinggung pinggir kaca penutup. Biarkan kamar hitung terisi larutan perlahan-lahan sampai penuh. Sel diamati dengan pembesaran 100 kali. Pembuatan larutan uji fraksi etanol dari ekstrak buah pare Fraksi etanol dari ekstrak etanol 70% buah pare ditimbang sebanyak 50 mg dan dilarutkan dalam labu 10 ml sehingga konsentrasi larutan induk 5000 μg/ml. Dari larutan induk dipipet sebanyak 100 μl dan ditambahkan pelarut 900 μl sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 500 μg/ml. Dari larutan ini dibuat pengenceran dengan konsentrasi 130; 81,89; 51,58; 32,49; 20,46 μg/ml untuk fraksi etanol ekstrak etanol 70% buah pare. Semua larutan uji dibuat dengan pengenceran bertingkat. Pembuatan larutan kontrol positif cisplatin Sel ditambah cisplatin dibuat dengan membuat larutan induk cisplatin sebanyak 0,2 ml injeksi cisplatin dengan sediaan 0,5 mg/ml dan ditambahkan pelarut 9,8 ml sehingga diperoleh konsentrasi 10 μg/ml. Kemudian dibuat 5 konsentrasi yaitu 3; 2: 1; 0,5; dan 0,25 μg/ml. Pembuatan larutan kontrol positif dilakukan secara aseptis di dalam LAF. Uji sitotoksisitas dengan metode perhitungan langsung. Media ditambah sel sebagai kontrol negatif, sel ditambah pelarut DMSO sebagai kontrol pelarut, sel ditambah cisplatin sebagai kontrol positif dibuat sebanyak 5 konsentrasi yaitu 3; 2: 1; 0,5; dan 0,25 μg/ml. Dan pengujian larutan sampel uji fraksi etanol ekstrak etanol 70% dibuat sebanyak 5 konsentrasi sebagai berikut: 130; 81,89; 51,58; 32,49; 20,46 μg/ml. Masing-masing dimasukan kedalam mikroplate 96 sumuran sebanyak 100 μl kemudian ditambah suspensi sel sebanyak 100 μl kedalam tiap sumuran, sehingga tiap sumuran berisi 200 μl larutan. Seri kadar dilakukan tiga kali replikasi (triplo) untuk mendapatkan hasil yang lebih valid. Selanjutnya kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Persentase kematian sel dengan metode perhitungan langsung (viable cell count) dihitung dengan menggunakan rumus (Doyle, A. dan Griffiths, J. B, 2000)
jumlahsely anghidup viabilitas 100%....(1) jumlahtota l % kematian 100 % % viabilitas....(2) HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil perolehan ekstrak dan fraksi etanol buah pare berbau khas, rasa pahit dan berwarna hijau kecoklatan serta mengandung senyawa kimia alkaloid, flavonoid dan saponin. Susut pengeringan fraksi etanol sebesar 4,47%. Hasil rendemen fraksi sebesar 2,63%. Kepadatan sel yang dihitung dengan haemocytometer, diperoleh sebanyak 1325 sel dengan rata-rata 53 sel pada tiap bidang. Sehingga diperoleh kepadatan sel dengan jumlah 53 x 10 5 sel/ml, pada tiap-tiap sumuran dimasukkan sebanyak 100 µl suspensi sel dengan kepadatan 106 x 10 4. Uji sitotoksik dengan perhitungan langsung dimana sel mendapat 4 kelompok perlakuan sebagai berikut : fraksi etanol 70% sebagai larutan uji dibuat 5 konsentrasi. Sel ditambah cisplatin sebagai kontrol positif dibuat sebanyak 5 seri konsentrasi. Sel ditambah media sebagai kontrol negatif, sel ditambah DMSO sebagai kontrol pelarut. Inkubasi dilakukan dalam waktu 24 jam dan 48 jam. Dari hasil uji sitotoksisitas persentase kematian tertinggi cisplatin pada konsentrasi 1,5 µg/ml yaitu 91,7% dan persentase yang menyebabkan 50% kematian pada konsentrasi 0,4075 µg/ml. Persen kematian sel tertinggi dengan larutan uji fraksi etanol ekstrak etanol 70% buah pare inkubasi 24 jam dan 48 jam masing-masing adalah 82,5% dan 94,6 % pada konsentrasi 130 µg/ml. Berdasarkan perhitungan persamaan regresi linear diperoleh nilai LC 50 yaitu yang menyebabkan 50% kematian masing-masing untuk inkubasi 24 jam dan 48 jam pada konsentrasi sebesar 48,5736 µg/ml dan 32,87 µg/ml. Tabel I. Persentase kematian sel terhadap cisplatin sebagai kontrol positif inkubasi 24 jam. Konsentrasi (µg/ml) Log konsentrasi % Kematian Probit 1,5 0,1760 91,7 6,3852 1 0 66,6 5,4281 0,5-0,3010 50 5,000 0,25-0,6020 34,4 4,6984 0,125-0,9030 18,1 4,0884 Y= 5,733030313 + 1,880399734 X r = 0,959125222 LC 50 = 0,4075 µg/ml
Tabel II. Persentase kematian sel HeLa pada fraksi etanol ekstrak etanol 70% buah pare inkubasi 24 jam. Konsentrasi (µg/ml) Log konsentrasi % Kematian Probit 130 2,1139 82,5 5,9346 81,89 1,9132 65,6 5,4016 51,58 1,7125 53,9 5,0279 32,49 1,5117 34 4,5875 20,46 1,3109 21,4 4,2074 Y= 1,5075 + 2,0710 X r = 0,9966 LC 50 = 48,5736 µg/ml Tabel III. Persentase kematian sel HeLa pada fraksi etanol ekstrak etanol 70% buah pare inkubasi 48 jam. Konsentrasi (µg/ml) Log konsentrasi % Kematian Probit 130 2,1139 94,6 6,6078 81,89 1,9132 77,7 5,7621 51,58 1,7125 66,2 5,4170 32,49 1,5117 46,5 4,9122 20,46 1,3109 35,8 4,6362 Y= 1,3785+ 2,3876 X r = 0,9806 LC 50 = 32,87 µg/ml Pengujian fraksi etanol dari ekstrak etanol 70 % buah pare bertujuan untuk mengetahui efektifitas pemberian fraksi etanol buah pare (Momordica charantia L.) sebagai senyawa sitotoksik. Metode kuantifikasi sel yang digunakan dalam penelitian ini yaitu metode perhitungan langsung menggunakan haemocytometer. Sebagai kontrol positif digunakan cisplatin, Cisplatin dipilih karena cisplatin adalah obat yang biasa digunakan sebagai obat kanker rahim. Mekanisme kerjanya membentuk hubungan melintang (cross-linking) antara dua rangkaian DNA yang dapat mempengaruhi sejumlah jalur metabolik penting untuk pertumbuhan dan mencegah mitosis sel sehingga menyebabkan proses terbentuknya sel kanker terganggu (Carmen and Carlos, 200). Dari hasil pengujian cisplatin sebagai control positif diperoleh LC 50 sebesar 0,4075 µg/ml. Pada penelitian ini dilakukan inkubasi 24 jam dan 48 jam, inkubasi 24 jam bertujuan untuk mengetahui nilai LC 50 atau nilai konsentrasi yang menghasilkan hambatan proliferasi sel 50% serta menunjukan ketoksikan suatu senyawa terhadap sel, sedangkan inkubasi 48 jam bertujuan untuk mengetahui efektifitas ekstrak etanol 70% fraksi etanol buah pare sebagai senyawa sitotoksik. Pada larutan uji fraksi etanol dari ekstrak etanol 70% buah pare inkubasi 24 jam diperoleh nilai LC 50 48,5736 µg/ml. Pada inkubasi 48 jam diperoleh nilai LC 50 32,87 µg/ml. Semakin lama masa inkubasi maka akan diperoleh LC 50 yang semakin kecil.
Berikut adalah grafik hubungan konsentrasi dengan persen kematian sel pada inkubasi 24 jam dan 48 jam dan juga grafik hubungan log konsentrasi dengan probit empirik inkubasi 24 jam dan 48 jam yang membentuk garis linier. % kematian 120 100 80 60 40 20 0 y = 0.5206x + 31.214 r = 0.9377 y = 0.5337x + 17.787 r = 0.9297 0 50 100 150 konsentrasi (µg/ml) Inkubasi 24 jam Linear (Inkubasi 24 jam) Inkubasi 48 jam Linear (Inkubasi 48 jam) Gambar 1. Grafik hubungan konsentrasi (µg/ml) dengan persen kematian probit empirik 7.5 8 7 6.5 5.5 6 5 4.5 3.5 4 3 y = 2.3876x + 1.3785 r = 0.9616 y = 2.071x + 1.5075 r = 0.9933 0 0.5 1 1.5 2 2.5 log konsentrasi Inkubasi 24 Linear (Inkubasi 24) Inkubasi 48 jam Linear (Inkubasi 48 jam) Gambar 2. Grafik hubungan log konsentrasi dengan probit (probit empirik) KESIMPULAN Dapat disimpulkan bahwa buah pare memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai obat antikanker. Karena berdasarkan penelitian yang dilakukan fraksi etanol ekstrak etanol 70% buah pare (Momordica charantia L.) terhadap sel HeLa memiliki nilai LC 50 pada inkubasi 24 jam sebesar 48,5736 µg/ml dan pada inkubasi 48 jam diperoleh 32,87 µg/ml dan masuk dalam rentang amat sangat toksik yaitu 5-50 µg/ml.
DAFTAR PUSTAKA Carmen and Carlos, J.M. 2008. Medicinal Chemistry of Anticancer Drug. Elsevier B.V. Ámsterdam. Hal. 169-173. Departemen Kesehatan RI. 2008. Farmakope Herbal Indonesia Edisi 1. Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Hal. 174-175. Departemen Kesehatan RI. 1989. Materia Medika Indonesia Jilid V. Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Hal.523-555. Departemen Kesehatan RI. 1986. Sediaan Galenik. Departemen Kesehatan RI. Dirjen POM, Jakarta. Hal. 10-12. Direktorat Pengendalian Penyakit Tidak Menular. 2009. Buku Saku Pencegahan Kanker Leher Rahim dan Kanker Payudara. Bakti Husada, Jakarta. Hal. 1, 4-5. Doyle, A. dan Griffiths, J. B. 2000. Cell and Tissue Culture For Medical Research. John Wiley & Sons, LTD. NewYork. Hal. 12-16, 48-49, 409.Subahar TS. 2004. Khasiat dan Manfaat Pare. Penerbit Agromedia Pustaka, Jakarta. Martini dan Sutiningsih, Dwi dan Hestiningsi, Retno. 2005. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanol Momordica charantia L., Phyllantus niruri L., dan Andrographis pankulata Ness terhadap Sel Hela, Mieloma dan Sel B958 Secara In Vitro. Skripsi. Fakultas Kesehatan Masyarakat Universitas Diponegoro, Semarang. Nefrialdi dan Gan, S. 1995. Farmakologi dan Terapi ed IV. Fakultas kedokteran UI, Jakarta. Hal. 686-690, 699.