21 BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN Pada penelitian sebelumnya diperoleh kerangka baca terbuka gen IFNα2b yang mengandung tiga mutasi dengan lokasi mutasi yang letaknya berjauhan, sehingga mutagenesis terarah untuk memperbaiki mutasi sulit dilakukan. Oleh karena itu, konstruksi gen sintetik dilakukan kembali pada penelitian ini. Proses sintesis kerangka baca terbuka gen IFNα2b dilakukan dalam dua tahap. Pada tahap I dilakukan secara TBIO dan tahap II dilakukan secara PCR. Tahap I menghasilkan produk yang terdiri atas variasi berbagai macam ukuran antara 100-600 pb, yang dapat dilihat pada Gambar V.1 (A). Kerangka baca terbuka IFNα2b berukuran 522 pb, sehingga dapat disimpulkan bahwa kerangka baca terbuka IFNα2b terdapat dalam campuran produk tersebut. Variasi ukuran produk dikarenakan perbandingan konsentrasi oligonukleotida atau konsentrasi total oligonukleotida dalam reaksi belum optimal (Gao et al., 2003). Produk berukuran lebih panjang disebabkan terjadi penempelan pasangan oligonukleotida tambahan, sedangkan produk lebih pendek terjadi karena pasangan oligonukleotida yang letaknya lebih luar tidak menempel. Produk TBIO selanjutnya dijadikan cetakan untuk PCR tahap II. Produk PCR tahap II adalah 3 pita tebal pada daerah sekitar 200 pb, 500 pb dan 600pb. (Gambar V.1 B). Pita tebal berukuran sekitar 500 pb merupakan kerangka baca terbuka IFNα2b yang berukuran 522 pb. Kedua pita lain merupakan produk PCR yang tidak diinginkan. Munculnya kedua pita tersebut diduga karena produk TBIO memiliki ukuran bervariasi yang juga dapat dikenali oleh primer pada PCR tahap II. Untuk mendapatkan hasil lebih baik, yaitu satu pita tunggal berukuran ~522 pb dilakukan optimasi, baik peningkatan suhu penempelan maupun komposisi reaksi, tetapi hasil yang diperoleh sama. Kondisi PCR terbaik yang diperoleh adalah kondisi yang menghasilkan produk 3 pita. Hasil ini sudah cukup untuk mendapatkan pita target, karena ketiga pita terpisah dengan baik. Kerangka baca terbuka gen IFNα2b diperoleh dengan memotong pita berukuran 522 pb dan memurnikannya
22 dengan kolom GFX. Hasil pemurnian dapat dilihat pada Gambar V.1 (C). Gambar V.1 Produk TBIO (A), produk PCR (B) dan hasil pemurnian kerangka baca terbuka gen IFNα2b (C). (A) 1 = marker DNA 100 pb; 2 dan 3 = produk TBIO. (B) 1 = marker DNA 100 pb; 2 = kontrol positif ; 3 = kontrol negatif; 4, 5, dan 6 = produk PCR. (C) 1 = marker DNA 100 pb; 2 = hasil pemurnian kerangka baca terbuka gen IFNα2b Reaksi ligasi dilakukan pada variasi perbandingan vektor dan sisipan, yaitu vektor : sisipan 1:3 (50ng : 25ng), 1:6 (50ng : 50ng), dan 1:8 (50ng : 70ng). Sebagai sisipan, tidak hanya digunakan kerangka baca terbuka gen IFNα2b hasil purifikasi, juga digunakan hasil PCR tahap II langsung untuk mendapatkan koloni transforman berjumlah banyak. Sebagai enzim digunakan enzim ligase T4 dan reaksi ligasi dilakukan selama 18 jam pada suhu 4 o C. Hasil ligasi kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli JM109 sebagai inang dengan metode heat shock. Hasil transformasi selanjutnya diinokulasi dengan metode sebar pada media LB padat yang mengandung ampisillin, IPTG, dan X Gal. Kontrol negatif (sel E. coli tanpa penambahan hasil reaksi ligasi) dan kontrol positif (sel E. coli dengan penambahan plasmid rekombinan pgem-t IFNα2b 3 mut) memberikan hasil yang diharapkan, yaitu tanpa koloni untuk kontrol negatif dan sejumlah besar tranforman untuk kontrol positif. Hasil transformasi produk ligasi memberikan transforman berwarna putih dan biru.
23 Hasil transformasi produk ligasi memberikan transforman sebanyak 60. Selanjutnya transforman tersebut kemudian disubkultur pada media LB padat. Analisis lisis cepat dilakukan untuk mengetahui apakah transforman membawa plasmid rekombinan yang diharapkan. Sebagai kontrol digunakan plasmid rekombinan pgem-t IFNα2b 3 mut (Yohanes, 2007). Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa diperoleh 28 transforman yang mengandung plasmid dengan ukuran sama dengan pita plasmid kontrol, yaitu yang berasal dari hasil ligasi dengan sisipan kerangka baca terbuka IFNα2b yang dimurnikan sebanyak 15 transforman (transforman G4, G5, G6, G7, G8, G15, G16, G17,G18, G19, G20, G21, G22, dan G36) dan produk PCR 13 transforman (transforman L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L11, L12, L13, L14, L19, dan L24). Isolasi plasmid dilakukan terhadap 28 transforman. Laju migrasi plasmid dari transforman tersebut dibandingkan dengan laju migrasi plasmid kontrol menggunakan metode elektroforesis agarosa. Plasmid yang memiliki kecepatan migrasi sama dengan kontrol berasal dari 15 transforman yaitu transforman G4, G5, G6, G7, G8, G15, G16, G17, G18, G19, G20, G21, G22, G36, dan L6 (Gambar V.2 A dan B). Gambar V.2 Hasil analisis laju migrasi plasmid rekombinan pgem-t IFNα2b (A) 1 = kontrol ; 2-7 = plasmid dari berturut-turut transforman G4, G5, G6, G7, G8 dan G15. (B) 1= kontrol ; 2-10 = plasmid dari berturutturut transforman G16, G17, G18, G19, G20, G21, G22, G36 dan L6 Plasmid yang memiliki migrasi sama dengan migrasi pita kontrol pada analisis kecepatan migrasi, selanjutnya dipotong baik menggunakan satu enzim restriksi HindIII atau EcoRI maupun dua enzim HindIII dan EcoRI. Pemotongan menggunakan satu enzim
24 menghasilkan pita berukuran ~3,5 kpb, sedangkan pemotongan dengan dua enzim menghasilkan dua buah pita yang berukuran 3 kpb dan 0,52 kpb. Plasmid dari transforman G4, G5, G6, G7, G8, dan G15 dipotong menggunakan EcoRI dan HindIII secara terpisah, ternyata semua plasmid memberikan pita yang ukurannya sesuai dengan yang diharapkan, yaitu ~3,5 kpb Gambar V.3 (A). Sebagai kontrol digunakan plasmid rekombinan pgem-t IFNα2b 3 mut (Yohanes, 2007) yang dipotong dengan HindIII. Plasmid yang berasal dari transforman G16, G17, G18, G19, G20, G21, G22, G36, dan L6 dipotong dengan enzim HindIII terlebih dahulu, selanjutnya dipotong dengan EcoRI. Semua plasmid menghasilkan dua pita DNA berukuran 3 kpb dan 0,52 kpb seperti pada Gambar V.3 (B) dan (C) kecuali plasmid G19. Kemungkinan plasmid yang berasal dari transforman tersebut terkontaminasi enzim DNAse sehingga terdegradasi. Gambar V.3 Hasil pemotongan plasmid rekombinan pgem-t IFNα2b. (A) 1 = DNA marker 1kpb; 2 =) plasmid kontrol tidak dipotong; 3 = plasmid kontrol dipotong dengan HindIII; 4-9 = plasmid G4, G5, G6, G7, G8, G15 dipotong HindIII ; 10-15 = plasmid G4, G5, G6, G7, G8, G15 dipotong EcoRI; 2 (B) kontrol dipotong HindIII, (A) 1 = marker 1kpb; 2 = kontrol tidak dipotong ; 3-11 = plasmid G16, G17, G18, G19, G20, G21, G22, G36, L6 dipotong HindIII, (C) 1 = DNA marker 1kpb ; 2 = kontrol dipotong EcoRI; 3-11 = plasmid G16, G17, G18, G19, G20, G21, G22, G36, L6 dipotong EcoRI DNA sisipan plasmid rekombinan selanjutnya ditentukan urutan nukleotidanya. Analisis urutan nukleotida dilakukan di perusahaan Macrogen Korea. Urutan nukleotida 14 transforman (G4, G5, G6, G7, G8, G15, G16, G17, G18, G20, G21, G22, G36, dan L6)
25 selanjutnya di sejajarkan dengan urutan nukleotida kerangka baca terbuka IFNα2b sintetis yang terdapat pada Genbank (hasil pensejajaran dapat dilihat pada Gambar 5.4 di bagian lampiran). Berdasarkan analisis urutan nukleotida menggunakan primer promotor T7 ternyata semua plasmid rekombinan memiliki mutasi pada daerah berbeda, seperti disarikan pada Tabel V.1. Plasmid rekombinan yang mempunyai urutan nukleotida DNA sisipan terbaik dari 14 plasmid adalah plasmid G20 dan G22. Kedua plasmid rekombinan tersebut memiliki satu mutasi, yaitu mutasi insersi pada plasmid G20 (Gambar V.4 bagian lampiran) dan mutasi delesi pada plasmid G22. Hasil ini sudah lebih baik dari urutan basa plasmid rekombinan pgem-t IFNα2b 3 mut (Yohanes, 2007) dan memungkinkan untuk dilakukan mutagenesis terarah. Plasmid rekombinan dari transforman G22 dipilih untuk penyiapan sisipan kerangka baca terbuka IFNα2b karena mutasi delesi lebih mudah diperbaiki dengan teknik mutagenesis terarah Hasil pensejajaran urutan nukleotida kerangka baca terbuka IFNα2b pada plasmid rekombinan G22 dengan kerangka baca terbuka IFNα2b sintetik pada Genbank dapat dilihat pada Gambar V.5. Delesi terjadi pada kodon kedua, yaitu TGT berubah menjadi TT. Mutagenesis terarah ditujukan untuk menyisipkan deoksi guanosin monofosfat, sehingga diperoleh kerangka baca yang benar. Sebelum dilakukan mutagenesis terarah, kerangka baca terbuka IFNα2b pada plasmid rekombinan G22 harus dipindahkan ke dalam vektor ekspresi pet32b
26 No Transforman Jumlah Mutasi Jenis Mutasi pada DNA sisipan 1 Plasmid G4 3 Delesi: kodon 93 CTG CT, kodon 94 AAC AC Insersi: kodon 109 ACG ACCG 2 Plasmid G5 5 Delesi: kodon 133 GAG AG Insersi: kodon 111 CTG CCTG, kodon 115 GAC GACC, kodon 129 TTA TTAA, kodon 131 CTG CCTG 3 Plasmid G6 5 Delesi: kodon 82 TTA TT Insersi: kodon 81 TTA CTAC Titik: kodon 78 GAC GCC, kodon 83 GAC GCC, kodon 84 AAG AAT 4 Plasmid G7 10 Delesi: kodon 13 CGC CG, kodon 22 ATG AT, kodon 23 CGC G, kodon 103 GGT GT, kodon 104 GTT T, kodon 133 GAG A, kodon 135 AAG G Insersi: kodon 73 AGC AGGC, kodon 131 CTG CCTG Titik : kodon 137 AGC AGT 5 Plasmid G8 3 Delesi : kodon 93 CTG C, kodon 94 AAC AC Titik: kodon 9 AGC ATC 6 Plasmid G15 6 Delesi: kodon 15 ACC A, kodon 16 CTG TG, kodon 17 ATG T, kodon 18 TTA TA Insersi: kodon 67 CTG CTGG, kodon 106 GAC GACC 7 Plasmid G16 3 Delesi: kodon 49 CAA CA Insersi: kodon 17 ATG ATGT kodon 19 CTG CTGG 8 Plasmid G17 7 Delesi: kodon 15 CAT CT, kodon 70 ACG AG, kodon 125 CAG AG Insersi: kodon 68 TTC TTTC, kodon 99 TGC TGCC, kodon 118 CTG CTTG, kodon 131 CTG CTTG 9 Plasmid G18 7 Delesi: kodon 26 AGC GC, kodon 133 GAG AG Insersi: kodon 51 GCC GCCC, kodon 111 CTG CCTG, kodon 115 GAC GACC, kodon 129 TTA TTAA, kodon 131 CTG CCTG 10 Plasmid G20 1 Insersi: kodon 69 AGC AGGC 11 Plasmid G21 3 Insersi: kodon 135 AAG AAAG Titik: kodon 120 GTT GTA, kodon 27 CTG TTG 12 Plasmid G22 1 Delesi : Kodon 2 TGT TT 13 Plasmid G36 3 Insersi: kodon 67 CTG CTGG, kodon 95 GAC GGAC, kodon 149 ATT ATTT 14 Plasmid L6 5 Delesi: kodon 57 TTA TA Insersi: kodon 75 GCC GGCC, kodon 130 TAC TTAC, kodon 131 CTG CCTG Titik: kodon 105 GGC GAC Tabel V.1 Hasil analisis penentuan urutan nukleotida menggunakan primer T7 promotor terhadap kerangka baca terbuka IFNα2b pada plasmid G4, G5, G6, G7, G8, G15, G16, G17, G18, G20, G21, G22, G36, dan L6
27 Gambar V.5 Hasil pensejajaran urutan nukleotida kerangka baca terbuka IFNα2b pada plasmid rekombinan G22 dengan kerangka baca terbuka IFNα2b sintetik pada Genbank Selanjutnya plasmid rekombinan G22 dinamakan pgem-t IFNα2b G del. Kloning kerangka baca terbuka IFNα2b dengan vektor ekspresi, dimulai dengan melakukan isolasi plasmid rekombinan pgem-t IFNα2b G del dan plasmid pet32b. Hasil isolasi kedua plasmid tersebut kemudian dianalisis laju migrasinya dengan metode elektroforesis agarose dan dibandingkan dengan laju migrasi kontrol. Sebagai kontrol laju migrasi pgem-t IFNα2b G del digunakan plasmid pgem-t IFNα2b 3 mut dan sebagai kontrol laju migrasi plasmid pet32b digunakan plasmid pet32b yang telah dikarakterisasi
28 sebelumnya. Baik plasmid rekombinan pgem-t IFNα2b G del maupun pet32b memiliki ukuran yang sejajar dengan kontrol, seperti terlihat pada Gambar V.6. Gambar V.6 Hasil isolasi plasmid rekombinan pgem-t IFNα2b G del dan pet32b. 1 = kontrol pet32b, 2 = plasmid pet32b; 3= kontrol pgem-t IFNα2b 3 mut ; 4 = plasmid rekombinan pgem-t IFNα2b G del Plasmid hasil isolasi dipotong dengan HindIII dan produk pemotongan selanjutnya dianalisis dengan metode elektroforesis agarosa. Hasil pemotongan plasmid rekombinan pgem-t IFNα2b G del memiliki ukuran ~3,5 kpb sementara plasmid pet32b memiliki ukuran 5,9 kpb (Gambar V.7). Kedua plasmid hasil pemotongan selanjutnya dimurnikan menggunakan kolom GFX. Gambar V.7 Hasil pemotongan pgem-t IFNα2b G del dan pet32b dengan HindIII. (A) 1= DNA marker 1 kpb; 2 = pgem-t IFNα2b G del tidak dipotong; 3 = pgem-t IFNα2b G del dipotong HindIII; 4= pet32b tidak dipotong; 5 = pet32b dipotong HindIII
29 Hasil pemurnian selanjutnya dipotong dengan EcoRI sehingga diperoleh kerangka baca terbuka IFNα2b dan plasmid pet32b yang memiliki ujung 5 dan 3 kohesif. Kerangka baca terbuka IFNα2b yang berukuran 522 pb diperoleh dari pgem-t IFNα2b G del, karena pemotongan menghasilkan dua pita pada analisis elektroforesis, yaitu pgem-t berukuran 3 kpb dan KBT IFNα2b berukuran 0,5 kpb (Gambar V.8 A). Sedangkan pemotongan pet32b dengan EcoR1 tetap menghasilkan satu pita berukuran ~5,9 kpb (Gambar V.8 B), karena situs pemotongan HindIII dan EcoR1 letaknya berdekatan, yaitu sekitar 13 pb. Selanjutnya Pita Kerangka baca terbuka IFNα2b dipotong dari gel dan dimurnikan dengan kolom GFX. Gambar V.8 Hasil pemotongan plasmid pgem-t IFNα2b G del dan pet32b dengan EcoRI. (A) 1= DNA marker 1 kpb; 2, 3, 4 = pgem-t IFNα2b G del dipotong HindIII dan EcoRI, (B) 1= marka DNA 1 kpb 2,3,4 (B) = pet32b dipotong HindIII dan EcoRI Reaksi ligasi dilakukan pada variasi perbandingan vektor dan sisipan, yaitu vektor : sisipan 1:3 (50 ng : 12,71 ng), 1:6 (50 ng : 25,41 ng), dan 1:8 (50 ng : 67,8 ng) menggunakan enzim ligase T4. Reaksi ligasi dilakukan duplo yaitu selama 18 jam pada suhu 4 o C dan pada suhu kamar. Hasil ligasi kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli DH5α. Hasil transformasi diinokulasi dengan metode sebar pada media LB padat yang mengandung ampisillin.
30 Hasil ligasi pada suhu 4 o C menghasilkan 3 transforman, yaitu PI 1, PI 2, dan PI 3.,sedangkan hasil ligasi pada suhu kamar menghasilkan 14 transforman yaitu PEI 1 sampai PEI 14. Dari 14 transforman tersebut, setelah di subkultur hanya 6 transforman yang tumbuh yaitu PEI 2, PEI 5, PEI 6, PEI 11, PEI 12, dan PEI 14. Analisis menggunakan lisis cepat dilakukan untuk mengetahui apakah transforman membawa plasmid rekombinan yang diharapkan dengan pet32b sebagai kontrol. Plasmid dari transforman yang memiliki kecepatan migrasi lebih lambat menunjukkan plasmid rekombinan dengan sisipan kerangka baca terbuka IFNα2b. Hasil lisis cepat menunjukkan bahwa plasmid yang diperkirakan memiliki laju migrasi lebih lambat dibandingkan laju migrasi kontrol adalah koloni PI 2 dan PI 3. Terhadap transforman tersebut dilakukan isolasi plasmid. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa plasmid PI 2 dan PI 3 memiliki laju migrasi yang berbeda jika dibandingkan dengan laju migrasi kontrol pet32b, dimana PI 2 bermigrasi lebih lambat dan PI 3 bermigrasi lebih cepat. Hasil analisis migrasi dapat dilihat pada Gambar V.9. Gambar V.9 Hasil isolasi pet32b IFNα2b G del. 1 = kontrol pet32b; 2,= PI 2; 3 = PI 3 Plasmid PI 2 diperkirakan membawa plasmid rekombinan pet32b IFNα2b, sehingga dilakukan analisis pemotongan dengan HindIII dan EcoRI. Pemotongan menggunakan HindIII dan EcoRI menghasilkan pita DNA berukuran ~6,4 kpb (Gambar V.10 A), sedangkan pemotongan menggunakan kedua enzim tersebut menghasilkan dua pita berukuran masing-masing ~5,9 kpb dan ~0,52 kpb Gambar V.10 B). Berdasarkan data di
31 atas, dapat disimpulkan bahwa transforman PI 2 membawa plasmid rekombinan yang diinginkan. Gambar V.10 Hasil pemotongan pet32b IFNα2b G del PI 2. (A) 1 = DNA Marker 1 kpb; 2 = plasmid PI 2 yang tidak dipotong; 3 (A) plasmid PI 2 dipotong HindIII; 4 = plasmid PI 2 dipotong EcoRI, (B) 1 = Marker DNA 1 kpb ; 2 = plasmid PI 2 dipotong HindIII dan EcoRI Terhadap kerangka baca terbuka IFNα2b pada plasmid rekombinan PI 2 dilakukan analisis urutan nukleotida. Hasil analisis urutan nukleotida menggunakan primer promotor T7 untuk pembacaan arah 5-3 dan terminator T7 untuk pembacaan arah 3-5 memberikan hasil yang benar dimana setelah situs restriksi HindIII maupun EcoRI pada plasmid pet 32b terdapat kerangka baca terbuka IFNα2b G del. Seluruh urutan nukleotida pada kerangka baca terbuka IFNα2b memiliki urutan yang sama dengan kerangka baca terbuka IFNα2b G del yang berasal dari koloni G22, artinya tidak terdapat mutasi tambahan selain delesi nukleotida deoksiguanosin monofosfat pada kodon kedua setelah kodon start. Situs tambahan berupa 4 buah basa yaitu CCAT yang sengaja ditambahkan pada perancangan KBT IFNα2b sintetik untuk mencegah mutasi kerangka baca karena plasmid 32b memiliki karakteristik delesi satu basa (Gambar V.11 A dan B).
A 32
33 Gambar V.11 Hasil penentuan urutan nukleotida DNA sisipan pet32b IFNα2b G del (PI2).(A) Hasil penentuan urutan nukleotida dengan primer promotor T7 (B) Hasil penentuan urutan nukleotida dengan primer terminator T7 B Mutagenesis terarah untuk menyisipkan satu nukleotida deoksiguanosin monofosfat pada kodon kedua setelah kodon start untuk memperbaiki urutan kerangka baca terbuka IFNα2b pada pet32b IFNα2b G del. Primer dirancang menggunakan program DNA Star dan memiliki panjang 32 nukleotida yang saling berkomplementasi. Urutan primer tersebut adalah, CGAATTCCCATATGTGTGACCTGCCGCAAACC (primer forward,
34 FWDIFNA2B) dan GGTTTGCGGCAGGTCACACATATGGGAATTCG (primer reverse, REV REVIFNA2B dengan masing-masing primer memiliki titik leleh 65,2 o C. Mutagenesis terarah dilakukan dengan metode PCR dengan konsentrasi primer adalah 150 ng menggunakan Pfu DNA polymerase. Variasi konsentrasi plasmid rekombinan yang digunakan sebagai cetakan adalah 25 ng dan 50 ng. Analisis elektroforesis terhadap produk mutagenesis terarah tidak memberikan hasil yang jelas atau sangat tipis ketika divisualisasi karena siklus yang digunakan hanya 12. Produk PCR adalah plasmid rekombinan yang telah disisipi satu nukleotida deoksiguanosin monofosfat dan berupa plasmid yang memiliki celah. Enzim DpnI yang memiliki aktivitas endonuklease dengan target 5 -G m6 ATC-3, guanin yang termetilasi, ditambahkan sebanyak 10 unit selama 16 jam untuk menghilangkan cetakan. Basa guanin tersebut berasal dari plasmid yang diisolasi dari hampir semua galur E. coli karena adanya aktivitas dam methylated. Selanjutnya plasmid tersebut ditransformasikan ke dalam E. coli TOP10. Hasil transformasi diinokulasi pada media LB yang mengandung ampisillin dengan metode sebar. Hasil transformasi menghasilkan 32 transforman dan analisis menggunakan lisis cepat dilakukan terhadap transforman dengan menggunakan pet32b IFNα2b G del sebagai kontrol. Hasil lisis cepat dari 28 transforman memberikan pita yang sejajar dengan pita kontrol. Isolasi plasmid dilakukan terhadap 12 transforman, yaitu Spi 1, Spi 3, Spi 5, Spi 9, Spi 11, Spi 13, Spi 17, Spi 19, Spi 22, Spi 25, Spi 28, dan Spi 32. Semua plasmid memiliki laju migrasi yang sama dengan laju migrasi kontrol (Gambar V.12).
35 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gambar V.12 Hasil isolasi pet32b IFN α2b dari transforman. 1= kontrol; 2 = Spi 1; 3 = Spi 3; 4 = Spi 5; 5 = Spi 9; 6 = Spi 11; 7 = Spi 13; 8 = Spi 17; 9 = Spi 19; 10 = Spi 22; 11 = Spi 25,;2= Spi 28; 13 = Spi 32 Analisis pemotongan dengan HindIII dan EcoRI terhadap 12 transforman menghasilkan pita DNA berukuran ~6,4 kpb yang sejajar dengan pita DNA kontrol. Hasil pemotongan dapat dilihat pada Gambar V.13 (A) dan (B). Gambar V.13 Hasil pemotongan pet32b IFNα2b. (A) 1 = DNA marker kpb; 2-14 = plasmid kontrol, Spi 1, Spi 3, Spi 5, Spi 9, Spi 11, Spi 13, Spi 17, Spi 19, Spi 22, Spi 2, Spi 28, dan Spi 32 dipotong HindIII, (B) 1 = DNA marker 1 kpb; 2-14 = plasmid kontrol, Spi 1, Spi 3, Spi 5, Spi 9, Spi11, Spi 13, Spi 17, Spi19, Spi 22, Spi 25, Spi 28, dan Spi 32 dipotong EcoRI
36 Analisis penentuan urutan nukleotida dilakukan pada DNA sisipan enam plasmid rekombinan pet32b IFNα2b yang berasal dari transforman Spi 1, 3, 9, 13, 17 dan 28. Hasil penentuan urutan nukleotida DNA sisipan plasmid berasal dari transforman Spi 1, 3, 9, 13, dan 28 menunjukkan bahwa penyisipan satu nukleotida deoksiguanosin monofosfat pada posisi yang diinginkan telah berhasil Dengan demikian, kerangka baca terbuka IFNα2b yang benar telah diperoleh. Penyisipan guanin pada kerangka baca terbuka IFNα2b dapat dilihat pada Gambar V.14. Situs Mutasi Penyisipan Kodon Start Kodon Start Gambar V.14 Hasil penyisipan deoksiguanosin monofosfat hasil mutagenesis terarah pada pet32b IFNα2b G del menghasilkan pet32b IFNα2b Plasmid pet32b IFNα2b kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli BL21. Hasil transformasi ditanam pada media LB padat yang mengandung ampisillin dengan metode sebar dan transforman yang tumbuh disubkultur. Masing-masing transforman ditumbuhkan dalam 5 ml media cair LB selama 18 jam pada suhu 37 o C dan kecepatan pengocokan 200 rpm. Kemudian kultur dipindah ke dalam media baru dengan perbandingan 2:100 diinkubasi selama 3 jam dan diinduksi dengan IPTG dengan konsentrasi 0,3 mm. Setelah 3 jam kultur dipanen dan dilakukan isolasi protein total. Hasil analisis protein dengan metode SDS PAGE menunjukkan bahwa protein rekombinan IFNα2b dapat diekspresikan dalam E. coli BL21. Protein rekombinan IFNα2b diperoleh sebagai protein fusi, sehingga mengalami penambahan ukuran. Protein IFNα2b berukuran ~18 kda dan situs penambahannya yang mengandung poli histidin
37 untuk purifikasi berukuran 18 kda, sehingga protein fusi berukuran sekitar 37 kda. Pita tebal protein hanya terdapat pada E. coli yang mengalami induksi dengan IPTG dan hal ini menunjukkan bahwa overproduksi IFNα2b rekombinan berjalan dengan baik. Pada hasil isolasi protein bakteri E. coli BL 21 tanpa plasmid pet32b IFNα2b tidak terdapat pita protein IFNα2b, dapat dilihat pada Gambar V.15. Gambar V.15 Hasil analisis SDS PAGE protein intrasel total transforman E. coli pet32b IFNα2b 1 = protein transforman Spi 28 diinduksi ; 2 = ekstrak protein transforman Spi 28 tidak induksi ; 3 = protein transforman Spi 9 diinduksi ; 4 = protein transforman Spi 9 tidak induksi ; 5 = protein transforman Spi 1 diinduksi ; 6 = protein transforman Spi 1 tidak diinduksi ; 7 = protein marker; 8 = protein E. coli BL21 yang tidak mengandung pet32b IFNα2b diinduksi ; 9 = protein E. coli BL21 yang tidak mengandung pet32b IFNα2b tidak induksi Protein IFNα2b rekombinan dimurnikan dari ekstrak protein total transforman Spi 1 menggunakan kolom nikel. Kolom nikel dapat mengikat protein rekombinan IFNα2b sebagai protein fusi poli his. Fraksi hasil pencucian kolom ditampung sebagai pembanding dan hasil pemurnian dibagi menjadi tiga fraksi. Hanya fraksi pertama yang memberikan pita tebal protein rekombinan IFNα2b (Gambar V.16). Hal ini diduga karena protein IFNα2b sebagai protein terlarut hanya terdapat dalam jumlah yang sedikit dalam ekstrak protein, sehingga telah terelusi pada fraksi pertama. Akibatnya fraksi kedua dan ketiga hanya mengandung sedikit protein yang terelusi. Diduga protein terlarut hanya
38 terdapat dalam jumlah yang sedikit dalam ekstrak karena protein dapat membentuk badan inklusi sehingga ikut terendapkan bersama debris sel pada proses isolasi protein. Gambar V.16 Analisis SDS PAGE hasil pemurnian IFNα2b rekombinan. 1 = fraksi 3 ; 2 = fraksi ; 3 = fraksi 1; 4 = marka ; 5,6 = ekstrak protein yang tidak dimurnikan ; 7 = hasil pencucian; 8 = fraksi 1 ; 9 = fraksi 2 ; 10 = fraksi 3 Pita protein murni dipotong dari gel dan dikarakterisasi dengan metode spektrofotometri massa MALDI TOF. Protein diekstraksi dari gel dan dipotong dengan tripsin. Masingmasing fragmen peptida dianalisis dan ditentukan urutan asam aminonya berdasarkan data spektra rasio massa dan muatan menggunakan mascot sequence matching software. Berdasarkan urutan asam amino tersebut dicari secara otomatis kemiripan dengan asam amino fragmen peptida yang terkandung dalam protein data base. Empat fragmen peptida memiliki kemiripan sangat tinggi dengan protein IFNα2 dan IFNα2b (Gambar V.17). Hal ini terjadi karena hanya sebagian asam amino dari total 165 asam amino yang diidentifikasi urutannya. Perbedaan urutan asam amino IFNα2b dengan IFNα2 hanya pada asam amino kedua (sistein) dan 163 asam amino berikutnya memiliki urutan yang sama dengan IFNα2. Urutan asam amino IFNα2 dan IFNα2b hanya berbeda satu maka asam amino yang menjadi ciri khas IFNα2b tidak teridentifikasi. Hasil analisis homologi
39 menunjukkan bahwa protein rekombinan murni memberikan homologi yang tinggi dengan IFNα2b (kode akses Q86UP4) dan IFNα2 (kode akses Q6DJX8) (Gambar V.17). IFNα2b terdiri atas 165 asam amino dengan massa 19388 Da dan IFNα2 terdiri atas 188 asam amino dengan massa 21564 Da. Berdasarkan hasil peptide sequencing dengan spektrometri massa MALDI-TOF yang menyatakan bahwa protein yang dioverproduksi dan dimurnikan mempunyai kemiripan yang tinggi dengan IFNα2b dan adanya data pendukung berupa hasil SDS PAGE, dapat disimpulkan bahwa protein tersebut adalah IFNα2b. Gambar V.17 Hasil analisis protein rekombinan IFNα2b dengan metode Spektrometri massa MALDI TOF