KLONING DAN OVEREKSPRESI GEN celd DARI Clostridium thermocellum ATCC DALAM pet-blue VECTOR 1

Transkripsi

1 PROPOSAL METODOLOGI PENELITIAN (BM-3001) KLONING DAN OVEREKSPRESI GEN celd DARI Clostridium thermocellum ATCC DALAM pet-blue VECTOR 1 Penyusun: Chandra Dosen Narasumber: Dra. Maelita Ramdani Moeis, Ph.D Akhmaloka, Ph.D PROGRAM STUDI SARJANA MIKROBIOLOGI SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG BANDUNG 2008

2 1.1 Latar Belakang Clostridium thermocellum ATCC merupakan eubakteri gram positif yang bersifat anaerob termofilik dan berbentuk batang. Bakteri ini sudah diketahui dapat memproduksi enzim endoglukanase termostabil yang sangat aktif. Salah satu enzim endoglukanase yang dihasilkan adalah endoglukanase D atau EGD. Enzim yang termasuk ke dalam keluarga enzim selulase ini dikode oleh gen celd (Mishra et al., 1990). Kebutuhan akan enzim endoglukanase (terkait dengan enzim selulase) yang termostabil semakin meningkat, terutama saat ini untuk menghasilkan kebutuhan bioenergi berupa bioetanol. Untuk memproduksi bioetanol secara massal dibutuhkan banyak sumber glukosa. Glukosa tersebut akan terfermentasi dan menghasilkan bioetanol. Masalahnya ketersediaan glukosa tidak banyak namun ketersediaan selulosa justru yang melimpah. Maka dari itu dibutuhkan banyak enzim endoglukanase untuk menguraikan selulosa yang ada menjadi monomer glukosa sehingga kemudian dapat digunakan untuk kebutuhan bioenergi. Salah satu usaha untuk memperbanyak produksi enzim selulase yang termostabil adalah lewat penelitian rekayasa genetika mikroba yang meliputi isolasi gen pengkode enzim endoglukanase yang termostabil dari mikroba termofilik dan mengoverekspresikannya ke vektor yang sesuai sehingga diharapkan dapat meningkatkan perolehan enzim yang banyak dibutuhkan ini. Sebelumnya telah dilakukan penelitian tentang kloning dan overekspresi gen celd Clostridium thermocellum ini pada vektor ekspresi puc8 dengan inang E. coli (Jollif et al., 1986). Pada penelitian kali ini akan dilakukan kloning dan overekspresi gen yang sama pada pet-blue 1 dengan inang E. coli Tuner (DE3) placi. pet-blue 1 ini digunakan karena memiliki keunggulan di antaranya dalam hal high multiple copy numbers dan pengaturan ekspresi gen. Dengan penelitian ini diharapkan enzim endoglukanase yang dihasilkan lebih banyak dan lebih terkontrol.

3 1.2 Tujuan Mengkloning gen celd Clostridium thermocellum ATCC ke vektor ekspresi pet-blue 1 dan mengoverekspresikannya dalam E. coli Tuner (DE3) placi. Menguji adanya aktivitas enzim endoglukanase D atau EGD yang dihasilkan. 1.3 Hipotesis Gen celd Clostridium thermocellum ATCC yang dikloning ke dalam vektor ekspresi pet-blue 1 dapat dioverekspresikan dalam E. coli galur Tuner (DE3) placi.

4 BAB II METODOLOGI PENELITIAN 2.1 Metode Kerja Vektor kloning + gen celd - PCR - Elektroforesis - Purifikasi Gen celd pet-blue 1 Restriksi oleh enzim EcoRV Ligasi pet-blue cutted Transformasi ke E. coli Tuner (DE3) placi Screening biru-putih SDS PAGE Uji aktivitas a. Desain primer Pada tahap ini dirancang primer yang sesuai dengan gen target celd. Selain itu pada primer juga ditambahkan sisi pengenalan enzim restriksi EcoRV. Untuk desain primer digunakan program Primer3. b. PCR Pada tahap ini dilakukan PCR dengan suhu denaturasi 94 o C, annealing 50 o C, dan elongasi 72 o C. Suhu annealing yang optimum akan dicari dengan melakukan optimasi PCR.

5 c. Elektroforesis Fragmen DNA hasil PCR dimasukkan ke dalam jel agarosa kemudian dialirkan aliran listrik untuk memisahkan fragmen DNA target. Untuk mengetahui DNA target (berdasarkan panjangnya), maka digunakan ladder sebagai pembanding. d. Purifikasi DNA Fragmen DNA target pada jel agarosa dipotong kemudian dipurifikasi dengan menggunakan kit purifikasi sehingga didapatkan fragmen DNA target dalam bentuk cair. e. Restriksi Fragmen DNA target dan vektor ekspresi diberi enzim restriksi EcoRV sehingga keduanya menghasilkan ujung lekat yang saling melengkapi. f. Ligasi Fragmen DNA dan vektor ekspresi yang dilekatkan satu sama lain dengan kit ligasi. g. Transformasi Fragmen DNA yang sudah terinsert ke dalam pet-blue 1 dimasukkan ke dalam sel E. coli Tuner (DE3) placi dengan metode heat-shock. h. Seleksi biru-putih E. coli galur Tuner (DE3) placi yang telah ditransformasi kemudian ditumbuhkan ke dalam medium yang mengandung IPTG dan X-gal. Koloni yang tumbuh dan berwarna putih kemudian diambil dengan tusuk gigi steril dan ditumbuhkan dalam LB yang mengandung IPTG.

6 i. SDS PAGE Kultur tersebut disentrifuga kemudian diambil supernatannya dan dilakukan SDS PAGE. j. Uji aktivitas Crude extract enzyme yang didapat dari proses sebelumnya diuji aktivitas selulasenya secara kualitatif. 2.2 Rencana Kerja Bulan ke- Perihal No Studi literatur v v v v v v v v v v v v 2 Desain primer v v 3 PCR-elektroforesis v v 4 Kloning ke vektor ekspresi v v 5 Transformasi-skrining biru putih v v 6 SDS PAGE v v 7 Uji aktivitas v v 8 Pembuatan laporan v v v v v

7 DAFTAR PUSTAKA Mishra, Saroj, Beguin, Pierre, dan Jean-Paul Aubert Transcription of Clostridium thermocellum Endoglucanase Genes celf and celd, Journal of Bacteriology volume 173 nomor 1 halaman Washington: American Society for Microbiology. Joliff, Gwennael, Pierre Bdguin, dan Jean-Paul Aubert Nucleotide sequence of the cellulase gene celd encoding endoglucanase D of Clostridium thermocellum, Nucleic Acids Research Journal halaman Oxford: Oxford University Press.

8 LAMPIRAN Rincian Biaya Penelitian No. Justifikasi Jumlah Total Biaya (Rp) 1 PCR mix (PROMEGA) 1 kit 1,700,000 2 Oligonucleotide primers US$ 2/nucleotide 100 2,000,000 3 X-GAL (PROMEGA) 100 mg 2,500,000 4 Kultur E. coli Tuner (DE3) placi 500,000 5 IPTG-dioxan free (PROMEGA) 1 g 1,500,000 6 Agarose (PROMEGA) 100 g 3,000,000 7 Ethidium bromide (PROMEGA) 0,5 ml 2,500,000 8 Chloramphenicol 200,000 9 Medium kultur bakteri (Luria Bertani): Yeast extract 500 g 1,000,000 Bacto tryptone 250 g 1,500,000 Bacto peptone 500 g 1,500,000 Bacto agar 1 lb 1,500, Gel extraction Kit (PROMEGA) 1 2,500, Plasmid isolation kit (PROMEGA) 1 2,000, Enzim restriksi EcoRV(PROMEGA) 2 1 kit 1,600, Enzim ligasi (PROMEGA) 2 kit 2,000, Vektor ekspresi pet-blue 1 (Novagen) 1 kit 2,000, Cawan Petri 3 buah 37, Pipet tips 1 pack 1,000, PCR tube 1 pack 1,000, Mikrotube 1,5 ml 1 pack 1,000, Sekuensing dan pengiriman sampel 1,000,000 TOTAL 33,537,500