HASIL DAN PEMBAHASAN

Transkripsi

1 HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi RNA total RNA total dari ujung akar G. max kultivar Slamet telah berhasil diisolasi. Kuantifikasi RNA total dengan spektrofotometer menunjukkan bahwa rendemen isolasi RNA total adalah 187 µg tiap g bahan tanaman. Jumlah ini menunjukkan rendemen isolasi RNA yang cukup tinggi dan optimal. Pengujian kemurnian RNA total dilakukan dengan membandingkan nilai OD 260 dan OD 280. Rasio OD 260 /OD 280 dari RNA total pada penelitian ini adalah 1.88 (Tabel 2) yang menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi mempunyai kemurnian yang tinggi yang tidak terkontaminasi oleh protein (Farrel 1993). Tabel 2. Hasil isolasi RNA total Bahan Absorban pada λ260 λ280 Rasio λ260/ λ280 Total RNA (µg/g sampel segar) 1g ujung akar Analisis keutuhan RNA total dilakukan dengan elektroforesis di gel agarosa yang terdenaturasi yang mengandung formaldehid. Hasil elektroforesis RNA total menunjukkan adanya dua pita RNA yang dominan yaitu RNA ribosomal (rrna) 28S dan 18S (Gambar 4). Hal ini mengindikasikan bahwa RNA total yang telah diisolasi adalah utuh, sehingga mrna yang terdapat di dalam RNA total juga utuh. Keutuhan mrna sangat penting dalam sintesis cdna. 28S 18S Gambar 4 RNA total dari ujung akar. Sintesis cdna total. Proses transkripsi balik (reverse transcription) dilakukan untuk mensintesis cdna dengan menggunakan RNA total yang telah diisolasi sebagai cetakan (template). Primer oligo(dt)

2 19 digunakan untuk sintesis cdna, sehingga hanya mrna yang dapat disintesis menjadi cdna melalui transkripsi balik karena memiliki ekor poly A. Keberhasilan sintesis cdna total dan kemurniannya, dan kemurnian RNA total dari kontaminan DNA diuji dengan PCR menggunakan primer spesifik untuk cdna ekson1-ekson2 dari aktin. PCR dengan menggunakan cdna total sebagai cetakan dan cdna ekson1-ekson2 dari gen aktin (ActF dan ActR) sebagai primer, menghasilkan pita DNA yang berukuran sekitar 450 pb (Gambar 5). Hasil ini menunjukkan bahwa daerah yang diamplifikasi adalah cdna ekson1-ekson2 bukan DNA ekson1-ekson2 dari gen aktin. DNA ekson1-ekson2 akan berukuran lebih besar daripada 450 pb karena terdapat intron yang dibuang pada saat pembentukan mrna. Keberadaan intron ditengah ekson1-ekson2 akan menghasilkan ukuran DNA sekitar 600 pb. M Act 1000 pb 500 pb Gambar 5 cdna aktin hasil PCR menggunakan cdna total dari ujung akar sebagai cetakan; M: marker 1 kb, Act: aktin. Proses transkripsi balik untuk mensintesis cdna total dengan menggunakan primer ActF dan ActR telah berlangsung dengan baik dan bebas dari kontaminan yang diperlihatkan dengan diperolehnya pita dengan ukuran 450 pb. Selain itu, hal ini juga membuktikan bahwa RNA total yang telah diisolasi mempunyai kualitas yang sangat bagus, karena selain dapat digunakan untuk mensintesis cdna juga terbebas dari DNA. Isolasi cdna Mt2 melalui PCR Isolasi fragmen cdna Mt2 melalui PCR dengan cdna total sebagai cetakan dan primer spesifik fragmen Mt2, menghasilkan fragmen cdna berukuran sekitar 250 pb (Gambar 6) yang kemudian disebut dengan fragmen GmMt2 (Glycine max Mt2) yang merupakan fragmen cdna kandidat gen penyandi MT2 dari G. max. Ukuran fragmen ini juga sama dengan ukuran gen Mt2 dari A. thaliana (AtMt2A).

3 mt2 M pb 250 pb Gambar 6 Fragmen GmMt2 hasil PCR menggunakan cdna total dari ujung akar sebagai cetakan; M: marker 1 kb, mt2: fragmen mt2. Pengklonan fragmen GmMt2 ke dalam plasmid pgem T Easy Fragmen GmMt2 telah diligasikan dengan plasmid pgem T Easy di tengah gen lacz dan hasil ligasi kemudian telah berhasil diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α. Keberhasilan penyisipan GmMt2 ke dalam pgem T Easy dan introduksi pgem T Easy rekombinan ke E. coli ditunjukkan oleh adanya koloni putih yang dapat tumbuh pada media seleksi yang mengandung antibiotik ampisilin, IPTG dan X-gal. E. coli yang dapat bertahan hidup di media seleksi berarti mengandung plasmid, dan koloni yang berwarna putih di media seleksi adalah koloni E. coli yang mengandung plasmid rekombinan, sedangkan yang berwarna biru adalah E. coli yang mengandung plasmid non-rekombinan (Gambar 7). Gen lacz menyandi β-galactosidase (β-gal) yang mengubah substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru bila ada IPTG yang berfungsi menginduksi promoter lacz. Bila fragmen GmMt2 menyisip pada gen lacz, maka gen lacz tidak dapat diekspresikan sehingga koloni E. coli berwarna putih. Bila tidak ada penyisipan pada lacz, maka koloni yang terbentuk akan berwarna biru. Koloni putih Koloni biru Gambar 7 Seleksi biru putih koloni E. coli DH5α yang ditransformasi dengan hasil ligasi antara DNA plasmid pgem T Easy dan GmMt2 pada media seleksi yang mengandung ampisilin, IPTG dan X-gal.

4 21 Adanya sisipan fragmen GmMt2 di dalam koloni E. coli putih dikonfirmasi dengan PCR-koloni. PCR-koloni terhadap koloni putih menghasilkan DNA yang berukuran sekitar 250 pb yang menunjukkan bahwa koloni putih mengandung fragmen GmMt2 (Gambar 8). M mt pb 250 pb Gambar 8 Hasil PCR terhadap koloni putih sebagai cetakan; M: marker 1 kb, mt2: fragmen mt2. Untuk memastikan fragmen GmMt2 tersisip di dalam pgem T Easy, DNA plasmid rekombinan yang telah diisolasi dari koloni putih, dipotong dengan enzim restriksi EcoR1 untuk mengeluarkan sisipan GmMt2. Pemotongan dengan enzim restriksi bertujuan untuk memutus DNA pada situs pemotongannya, sehingga DNA plasmid yang berbentuk sirkuler terputus dan terbagi menjadi vektor dan sisipan. Ukuran molekul vektor biasanya lebih besar dibandingkan dengan sisipan yang berukuran lebih kecil (Old & Primrose 2003). Pemotongan terhadap DNA plasmid rekombinan dengan EcoR1 yang situs pemotongannya mengapit daerah penyisipan, menghasilkan dua fragmen yaitu fragmen sekitar 3000 pb yang merupakan vektor pgem-t Easy dan fragmen yang berukuran sama dengan fragmen GmMt2 yaitu sekitar 250 pb (Gambar 9), sehingga dapat dipastikan bahwa fragmen GmMt2 tersisip di dalam plasmid pgem-t Easy. p M vektor pgem -T Easy 3000 pb 1000 pb 250 pb Sisipan GmMt2 Gambar 9 Hasil pemotongan plasmid dengan enzim restriksi EcoR1; M: marker 1 kb, p: pgem T Easy + GmMt2.

5 22 Analisis fragmen GmMt2 Pengurutan DNA terhadap fragmen GmMt2 yang diperoleh dengan PCR menggunakan primer MF dan M7R menghasilkan 257 nukleotida yang mengandung 246 pb ORF (open reading frame) yang menyandi 81 asam amino dengan 14 Cys. GmMT2 memiliki berat molekul 8.2 kda. Secara umum, MT tipe 2 pada tanaman tersusun dari asam amino yang mengandung Cys yang terkonservasi (Kojima 1991), dan dengan berat molekul yang rendah berkisar 4-8 kda (Valle 1991). GmMt2 yang memiliki ukuran 246 pb merupakan daerah ekson, yang sama dengan ekson yang ada pada AtMt2A. Gen AtMt2A dengan ukuran 538 pb (nomor akses NM_111773), memiliki satu ekson dan dua intron. Program Genewise dari EBI (European Bioinformatics Institute) digunakan untuk menganalisis daerah ekson dan intron dari urutan nukleotida GmMt2 dan AtMt2A. Analisis terhadap cdna juga menunjukkan bahwa fragmen GmMt2 mengandung cdna lengkap yang mengandung kodon awal dan kodon akhir dari Mt2 (Gambar 10). Dengan demikian cdna penyandi MT2 dari kedelai telah berhasil diisolasi. Hasil selengkapnya dari pengurutan fragmen GmMt2 menggunakan primer T7, disajikan pada lampiran 1. Sequence ID: GmMT2 Nuk AA atg tct tgc tgt gga gga aac tgc gga tgt gga tct ggc tgc aag tgc ggc aac ggt 57 M S C C G G N C G C G S G C K C G N G 19 tgt gga ggt tgc aaa atg tac cct gac ttg gga ttc tcc ggc gag aca acc aca act 114 C G G C K M Y P D L G F S G E T T T T 38 gag act ttt gtc ttg ggc gtt gca ccg gcg atg aag aat cag tac gag gct tca ggg 171 E T F V L G V A P A M K N Q Y E A S G 57 gag agt aac aac gct gag aac gat gct tgc aag tgt gga tct gac tgc aag tgt gat 228 E S N N A E N D A C K C G S D C K C D 76 cct tgc acc tgc aag tga 246 P C T C K - 81 Gambar 10 Urutan basa fragmen GmMt2 dan deduksi asam aminonya.

6 23 Hasil analisis urutan nukleotida menunjukkan bahwa promoter T7 terletak di hulu dari GmMt2 yang tersisip di gen lacz. GmMt2 mempunyai arah yang berlawanan dengan lacz (Gambar 11). Sisipan gen lac Z Gambar 11 Posisi GmMt2 di dalam MCS dari pgem T Easy. Analisis kesejajaran lokal berdasarkan urutan nukleotida dan asam amino dengan bank data di GenBank dilakukan dengan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). BLAST adalah program berbasis bioinformatik dengan tujuan untuk mencari kesejajaran dari bagian urutan basa nukleotida atau asam amino (local alignment) yang memiliki nilai yang paling tinggi. BLAST dapat digunakan sebagai alat untuk menentukan identitas suatu fragmen DNA yang belum diketahui berdasarkan tingkat homologi dengan gen atau fragmen DNA yang telah diketahui di GenBank (Mount 2001). Hasil penyejajaran nukleotida fragmen GmMt2 dengan program BLAST menunjukkan bahwa GmMt2 sama dengan AtMt2A dari A. thaliana. Karena nukleotidanya sama maka urutan asam amino antara GmMT2 dengan AtMT2A juga sama. Hasil penyejajaran selengkapnya disajikan pada lampiran 2 dan lampiran 3. Oleh karena itu, GmMT2 mempunyai fungsi yang sama dengan AtMT2A yaitu berperan dalam pengikatan dan detoksifikasi logam dan membatasi kerusakan oksidatif (Zhou et al. 1995).

7 24 Hasil deduksi asam amino dari fragmen GmMt2 memperlihatkan bahwa motif urutan asam amino Cys dari GmMT2 terdiri dari Cys-Cys (residu 3-4), Cys-X-Cys (8-10, 14-16, 67-69, 73-75, 78-80) dan Cys-X-X-Cys (20-23) (Gambar 12). Karakteristik yang khas dari distribusi asam amino Cys dari GmMT2, memiliki kesamaan dengan protein MT tipe 2 dari tanaman yang telah dilaporkan dari berbagai penelitian (Robinson et al. 1993; Cobbett & Goldsbrough 2002). Tipikal komposisi Cys dari protein MT tipe 2 dari tanaman adalah motif Cys-Cys, Cys-X-Cys, dan Cys-X-X-Cys ( -X- adalah asam amino lain selain Cys) yang terdapat pada ujung amino dan ujung karboksil. ORF 1 1 fragment (s) aa MSCCGGNCGCGSGCKCGNGCGGCKMYPDLGFSGETTTTETF ** *x* *x* *xx* VLGVAPAMKNQYEASGESNNAENDACKCGSDCKCDPCTCK- *x* *x* *x* Gambar 12 Urutan ORF dan motif asam amino Cys. Analisis situs restriksi pada fragmen GmMt2 menunjukkan bahwa fragmen tersebut tidak mengandung situs pemotongan enzim restriksi endonuklease yang terdapat pada situs pengklonan (MCS = multi cloning sites) dari pgem T Easy (Gambar 13) sehingga semua situs restriksi yang terdapat pada MCS tersebut dapat digunakan untuk mengisolasi sisipan GmMt2. Situs restriksi yang terdapat pada fragmen GmMt2 adalah BbvI, BsaBI, BtsCI, TseI, FokI, ApeKI, CspCI, HpyCH4III, PshAI, BsrFI, SgrAI, AcuI, BtgZI, MboII, SfaNI, Cac8I dan Hpy188I. Situs-situs ini tidak dapat digunakan untuk pengklonan karena akan memotong cdna utuh menjadi dua bagian atau lebih. Gambar 13 Peta restriksi yang terdapat pada fragmen GmMt2.

8 25 Tingkat kekerabatan antar individu dapat dilihat dari pohon filogenetik. Kekerabatan dalam filogenetik dapat menggambarkan kedekatan antara individu dalam taksonomi, selain itu juga dapat menunjukkan kesamaan peran dan spesifitas gen atau urutan nukleotida. Berdasarkan kesamaan urutan nukleotida Mt2, GmMt2 sama dengan AtMt2A dari Arabidopsis thaliana. Kesamaan antara GmMt2 dengan AtMt2A dapat mengindikasikan kesamaan peran. Gambaran filogenetik berdasarkan pada urutan nukleotida Mt2 dan urutan asam aminonya dari berbagai spesies ditunjukkan pada Gambar 14 dan Gambar 15. Gambar 14 Filogenetik berdasarkan urutan nukleotida Mt2 dari berbagai spesies.

9 Gambar 15 Filogenetik berdasarkan urutan asam amino MT2 dari berbagai spesies. 26

10 27 Berdasarkan urutan nukleotida Mt2, GmMt2 yang diisolasi dari kedelai varietas Slamet tidak berada dalam satu kelompok dengan G. max MET2 (nomor akses AB ) (Gambar 14). G. max MET2 memiliki ukuran 564 nukleotida yang mengandung 240 pb ORF dan menyandi 79 asam amino dengan 13 Cys. G.max MET2 memiliki berat molekul 7.9 kda. Dengan demikian, GmMt2 memiliki perbedaan dengan G. max MET2 pada urutan nukleotida, asam amino dan berat molekulnya. Perbedaan ini dapat disebabkan oleh perbedaan varietas yang dianalisis. Analisis Domain Fragmen GmMt2 Analisis domain asam amino GmMT2 dilakukan dengan menggunakan program interproscan dari EBI. GmMT2 memiliki 33 residu (asam amino ke 25 sampai 58) yang secara umum sejajar dengan domain MT tanaman, famili MT kelompok ke-15 (MT2_15p). GmMT2 memiliki 81 residu (asam amino ke 1 sampai 81) yang sama dengan domain dari subfamili MT kelompok tanaman yaitu MT tipe 2 (Gambar 16). Gambar 16 Posisi fragmen GmMT2 pada MT tanaman famili ke-15 berdasarkan urutan asam amino; MT2_15p: domain MT tipe 2 dari famili ke-15 MT tanaman, GmMT2: domain GmMT2. Fragmen GmMT2, mengandung satu domain tempat fosforilasi kasein kinase II yang terletak pada asam amino ke-35 sampai dengan 40; empat domain tempat miristoilasi yang terletak pada asam amino ke-9 sampai dengan 14, asam amino ke-17 sampai dengan 22, asam amino ke-23 sampai dengan 28 dan asam amino ke-48 sampai dengan 53; dan domain yang banyak mengandung asam amino Cys yang terletak pada asam amino ke-3 sampai dengan 23 dan asam amino ke-69 sampai dengan 80 ( Gambar 17). Gambar 17 Profil domain yang terdapat pada GmMT2. (1) Domain fosforilasi kasein kinase II, (2) Domain miristoilasi, dan (3) Domain yang banyak mengandung Cys.

11 28 Fosforilasi kasein kinase II (CK-2) adalah domain yang memiliki asam amino serine (Ser) atau threonine (Thr) yang merupakan asam amino yang menjadi tempat fosforilasi. CK-2 menfosforilasi berbagai protein yang berbeda. CK-2 kemungkinan memiliki peran yang esensial di dalam pengontrolan terhadap pembelahan dan diferensiasi sel pada semua eukariot (Collinge & Walker 1994). Fosforilasi kemungkinan juga mengaktifkan metal transcription factor-1 (MTF-1) didalam respon terhadap logam berat (LaRochele et al. 2001; Saydam et al. 2002) Miristoilasi adalah modifikasi lipid yang memastikan fungsi dan jalur intraseluler yang tepat dari protein dalam keterlibatannya pada berbagai jalur-jalur sinyal. Suatu sekuen asam amino yang mempunyai domain miristolasi maka pada ujung N (N-terminal) pasti memiliki asam amino glysine (Gly). Gly adalah asam amino untuk tempat miristolasi (Pierre et al. 2007). Domain yang banyak mengandung asam amino Cys merupakan karakteristik umum dari protein MT. Berdasarkan komposisi asam amino Cys di dalam suatu sekuen maka MT dibagi menjadi dua domain dalam mekanisme pengikatan logam, yaitu β domain (N-terminal) dan α domain (C-terminal) (Valle & Auld 1993). Komposisi Cys yang dimiliki MT diduga berkaitan dengan kemampuan MT dalam mengikat logam untuk mekanisme detoksifikasi dan juga kestabilan protein (Duncan et al. 2006).