14 BAB III METODOLOGI PEELITIA 3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Lingkungan Hidup PT ewmont usa Tenggara, Kecamatan Sekongkang, Kabupaten Sumbawa Barat, Provinsi usa Tenggara Barat selama 3 bulan mulai dari bulan Juni hinggaagustus 2011. 3.2 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol kultur, oven, plastik warp, gelas piala, gelas ukur, hot plate, magnetic stirer, cawan petri, erlenmeyer, autoklaf, api spiritus, mata pisau, gunting, ph meter, scapel, pinset, pipet, spatula, neraca digital, laminar air flow cabinet serta rak-rak untuk menempatkan botol hasil kultur. 3.3 Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini dijabarkan dalam tiga kelompok sesuai dengan jenis dan cara penggunaannya. 3.3.1 Bahan media tanam Media dasar berfungsi sebagai suplai nutrisi bagi eksplan. Media dasar yang digunakan adalah Murashige Skoog (MS). Bahan yang dibutuhkan untuk membuat media MS adalah unsur makro, mikro dan vitamin. Jenis media tanam berupa gel padat, menggunakan agar-agar khusus yang tidak berwarna dan bersifat netral. Gula digunakan sebagai cadangan makanan dan air sebagai pelarut seluruh media. Hormon yang digunakan adalah Benzyl Adenin Purin (BAP) dan Thidiazuron (TDZ) dengan konsentrasi tertentu.
15 3.3.2 Bahan tanaman Bahan tanaman yang digunakan adalah eksplan Gaharu (Aquilaria malaccensis) dalam media MS 0 hasil subkultur dengan karakteristik satu tunas banyak daun. Bagian tanaman yang digunakan adalah daun.umur plantlet adalah 4 bulan. Plantlet ditanam dalam botol selai yang berukuran besar. 3.3.3 Bahan sterilisasi Bahan yang digunakan untuk mensterilkan peralatan adalah alkohol 70% (cair dan gel), aquades, iodine (betadine), spiritus (api), korek api, kapas, cairan liquinox dan air yang sudah disterilisasi. 3.4 Langkah Kerja Sterilisasi lingkungan kerja Sterilisasi alat ZPT (BAP dan TDZ) Pembuatan media tanam MS instan, Gula, Air, Agar Penanaman/Subkultur Pengamatan Pengambilan data Pengukuran Analisis data Gambar4Bagan langkah kerja penelitian. Urutan kerja dilakukan sesuai dengan Gambar 4, penjelasan teknis kegiatan dijabarkan pada sub bab sebagai berikut,
16 3.4.1 Sterilisasi alat Botol kultur dan perlengkapan penanaman berupa petri dish, scapel, pinset bengkok dan lurus dicuci menggunakan cairan liqui-nox dengan bantuan spon busa dan gumpalan kawat untuk menghilangkan kotoran yang melekat pada peralatan tersebut. Setelah pembersihan menggunakan cairan liquinox kemudian semua botol dan peralatan dibilas menggunakan aquades untuk menghilangkan sisa-sisa cairan pembersih yang masih menampel. Botol dan perlengkapan penanaman ditiriskan di keranjang berongga agar air sisa pencucian sebagian jatuh. Jika botol akan disterilkan pada hari yang berbeda maka botol disimpan di tempat bersih dan tertutup dalam mulut botol berada di bawah (terbalik). Khusus peralatan yang terbuat dari besi setelah pembilasan terakhir harus segera dikeringkan menggunakan tissue untuk mencegah timbulnya karat akibat oksidasi besi dengan air sisa pencucian begitu juga dengan petri dishharus segera dikeringkan untuk mencegah timbulnya bercak-bercak tetesan air. Sterilisasi berikutnya menggunakan bantuan autoclave. Sebelum menata botol kultur pastikan air rebus cukup untuk proses sterilisasi selama satu jam. Botol kultur disusun rapi dan rapat dalam autoclave dengan posisi terbalik. Perlengkapan penanaman disusun sesuai kebutuhan dan dikelompokkan sesuai fungsinya seperti pinset dan scapel dibungkus menjadi satu wadah. Langkah selanjutnya dibungkus rapi dalam kertas HVS dan diberi label nama alat dan tanggal sterilisasi. Strerilisasi peralatan dalam autoclave dilakukan selama satu jam dengan tekanan 17,5 psi dan suhu 121 C. Autoclave dioperasikan dalam keadaan exhaust valve (katup pembuangan) terbuka hingga uap air keluar selama 5 menit, hal ini untuk membuang uap air awal yang masih mengandung kotoran-kotoran yang dapat menyebabkan kontaminasi. Botol dan peralatan yang sudah disterilisasi langsung disimpan dalam wadah tertutup untuk mengurangi kontak dengan udara luar terlalu lama. 3.4.2 Pembuatan media tanam Pertama menyiapkan alat dan bahan dalam meja kerja. Penataan botol steril di meja dilakukan secepat mungkin kemudian ditutup dengan lembaran kertas
17 untuk mencegah kontaminan masuk selama masa pembuatan media. Semua bahan ditimbang menggunakan neraca digital dengan berat sebagai berikut. Tabel 1. Penggunaan bahan untuk pembuatan media tanam Bahan Berat (gram) MS Instan 4,43 Gula pasir 30 Agar-agar 7 setelah seluruh bahan selesai ditimbang kemudian dicampur ke dalam satu liter air mineral aduk hingga merata.langkah selanjutnya mengukur ph menggunakan ph indikator, pastikan didapatkan berkisar ph 5-6. Kemudian panaskan menggunakan hot plate hingga mendidih, selama proses pemanasan larutan harus tetap diaduk agar semua bahan tercampur dengan sempurna. Pemberian BAP dan TDZ sesuai dengan taraf yang direncanakan, larutan BAP yang digunakan adalah BAP 1 ppm dan BAP 2 ppm, TDZ yang digunakan adalah TDZ 0,05 ppm, 0,1 ppm dan 0,5 ppm. Pencampuran antara media dasar dengan hormon diaduk hingga merata. Penuangan dilakukan menggunakan wadah tuang yang berujung lancip untuk memudahkan masuknya larutan ke dalam botol. Volume penuangan kurang lebih 10 ml tiap botol. Botol yang telah terisi media segera ditutup menggunakan plastik dengan ukuran 10 cm x 10 cm kemudian ikat dengan karet untuk mencegah kontaminan masuk, pengikatan dengan karet sebaiknya tidak terlalu rapat untuk mencegah plastik bocor saat proses sterilisasi dengan tekanan dan suhu tinggi. Proses sterilisasi media langkahnya sama dengan sterilisasi alat, hanya saja lama proses dikurangi menjadi 20 menit. Media yang sudah steril selanjutnya ditambah ikatan karet dan ditempatkan pada wadah tertutup kemudian disimpan selama 3 hari untuk memastikan media tidak mengalami kontaminasi.
18 3.4.3 Sterilisasi lingkungan kerja Sebelum melakukan penanaman, ruangan penanaman disterilisasi terlebih dahulu untuk mengeliminasi faktor kontaminasi kasat mata berupa bakteri, virus dan jamur yang menempel pada debu baik yang beterbangan maupun menempel pada peralatan kerja dan permukaan ruangan. Terdapat dua jenis sterilisasi, yaitu sterilisasi ruangan dan sterilisasi laminar air flow (LAF). Sterilisasi ruangan dilakukan dengan menyapu lantai ruangan untuk membersihkan debu-debu yang menempel pada lantai ruangan kemudian mengepel lantai menggunakan larutan alkohol 70% selanjutnya menghidupkan lampu UV selama 12 jam untuk mematikan kontaminan yang masih beterbangan di udara. Sterilisasi LAF dilakukan dengan menyemprotkan larutan alkohol 70% pada seluruh permukaan luar LAF kemudian mengeringkan dengan tissue. Filter blower juga dibersihkan secara berkala. Bagian dalam juga disemprot larutan alkohol 70% dalam keadaan blower hidup kemudian dikeringkan. Setelah semua langkah diatas selesa, media tanam, alat dan bahan tanam dimasukkan kedalam LAF kemudian hidupkan lampu UV minimal selama 2 jam untuk mematikan kontaminan yang masih tersisa. Sebelum memulai menggunakan LAF, buka sedikit pintu LAF, matikan lampu UV dan nyalakan blower selama 30 menit untuk membuang sisa debu dan kontaminan yang telah terkena UV. Ruangan yang steril juga ditunjang dengan sikap dan pakaian yang steril. Hal ini diterapkan untuk mengurangi masuknya kontaminan ke dalam ruangan laboratorium. Pakaian steril yang dikenakan adalah jas lab khusus, penutup kepala, kaos tangan karet, masker dan kacamata. 3.4.4 Penanaman/Subkultur Pastikan alat dan bahan telah lengkap tersedia di dalam LAF, selama penanaman hidupkan lampu neon dan blower. Siapkan kapas untuk mengoleskan campuran betadine, alkohol gel 70% dan air steril secukupnya pada bibir dan leher botol. Teteskan betadine sebanyak 3 tetes dan air steril secukupnya ke dalam petri dish secukupnya kemudian ratakan dengan cara memutar-mutar petri dish. Keluarkan terlebih dahulu beberapa plantlet dari botol selai menggunakan pinset kemudian pisahkan daun dengan batangnya dengan bantuan scapel dan
19 pinset. Daun berukuran relatif besar dipotong menjadi dua sampai tiga bagian dengan potongan horizontal urat daun. Daun yang digunakan adalah daun yang sudah berwarna hijau muda hingga tua. Susun rapi daun-daun yang akan dimasukkan kembali ke dalam botol untuk efisiensi subkultur. Buka tutup plastik media tanam secara perlahan, panaskan sekeliling leher botol di api bunsen untuk mematikan kontaminan, oleskan cairan betadine, alkohol gel 70% dan air steril menggunakan kapas sepanjang bibir dan leher botol. Masukan dua eksplan daun ke dalam botol, posisi tanam diusahakan membuat kontak permukaan daun dengan media sebanyak mungkin. Tutup kembali petri dish. Panaskan beberapa saat bibir botol kemudian langsung tutup dengan plastik dan ikat menggunakan dua karet serapat mungkin. Proses penanaman dilakukan cepat dan hati-hati karena semakin lama botol dan petri dish terbuka, semakin besar peluang kontaminan masuk ke dalam. Sebelum menggunakan pinset dan mata pisau scapel, dicelupkan ke dalam alkohol 70%, dipanaskan di api bunsen dan masukkan ke air steril untuk mendinginkan. Selama proses penanaman minimalkan tangan keluar dari LAF dan bercakapcakap. 3.4.5 Pengambilan Data Pengambilan data dilakukan dengan dua metode, yaitu pengamatan visual dan pengukuran langung. pengamatan visual dilakukan untuk mengamati perubahan morfologi eksplan, gangguan pertumbuhan dan kontaminasi. Pengukuran langsung dilakukan seminggu sekali selama 8 minggu. Variabel yang diukur dalam penelitian ini adalah 1). Luas bengkak : diukur menggunakan bantuan milimeter blok transparan, untuk mengukur luas permukaan daun yang bengkak, hasil pengukuran dikelompokkan dalam dua grup nilai. ilai 1 untuk eksplan bengkak dengan luas kurang dari 50% dari luas total jaringan daun yang hidup. ilai 2 untuk eksplan bengkak dengan luas lebih dari sama dengan 50% dari luas total jaringan daun yang hidup. 2). Luas kalus : diukur menggunakan bantuan milimeter blok transparan, untuk mengukurluas permukaan kalus yang terbentuk, satuan yang digunakan cm 2.
20 3.4.6 Analisis data Perhitungan parameter kualitatif meliputi persentase kontaminasi oleh jamur dan bakteri, browning (pencoklatan), dan kematian pada eksplan dengan menggunakan rumus sebagai berikut : %Tingkat kontaminasi = eksplan yang terkontaminasi x 100% %Tingkat pencoklatan = eksplan yang mengalami pencoklatan x 100% %Tingkat pemutihan = eksplan yang mengalami pemutihan x 100% %Tingkat kematian = eksplan yang mengalami kematian x 100% %Tingkat keberhasilan = eksplan yang berkalus x 100% Keterangan : adalah jumlah total eksplan yang tersedia pada setiap perlakuan Data yang akan diolah menggunakan metode statistik akan menggunakan bantuan perangkat lunak Statistical Analysis System 9.1 dengan metode statistik Annova yang akan dijelaskan di sub-bab berikutnya. 3.5 Rancangan percobaan Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Rancangan Faktorial dengan Acak Lengkap (RAL-F). Dalam penelitian ini, RAL-F terdiri dari dua faktor yaitu zat pengatur tumbuh BAP dan zat pengatur tumbuh TDZ. masing-masing taraf terdapat 20 eksplan yang ditanam dalam 10 botol, sehingga eksplan total adalah 240 eksplan dalam 120 botol.taraf atau konsentrasi masingmasing faktor yaitu :
21 Tabel 2. Kombinasi zat pengatur tumbuh BAP TDZ(ppm) (ppm) 0 0,05 0,1 0,5 0 B0T0 B0T1 B0T2 B0T3 1 B1T0 B1T1 B1T2 B1T3 2 B2T0 B2T1 B2T2 B2T3 Keterangan : B0T0 : Kontrol B1T1 : BAP 1 ppm + TDZ 0,05ppm B0T1 : TDZ 0,05 ppm B1T2 : BAP 1 ppm + TDZ 0,1ppm B0T2 : TDZ 0,1 ppm B1T3 : BAP 1 ppm + TDZ 0,5ppm B0T3 : TDZ 0,5 ppm B2T1 : BAP 2 ppm + TDZ 0,05ppm B1T0 : BAP 1 ppm B2T2 : BAP 2 ppm + TDZ 0,1ppm B2T0 : BAP 2 ppm B2T3 : BAP 2 ppm + TDZ 0,5ppm Adapun model linear rancangan percobaan yang digunakan yaitu sebagai berikut (Mattjik & Sumertawijaya 2002) : Y ijk =µ + B i + T j + (BT)ij + ε ijk Keterangan : Y ijk : ilai respon eksplan terhadap perlakuan BAP ke-i, TDZ ke-j dan ulangan ke-k. µ : ilai tengah populasi B i T j (BT)ij ε ijk : Pengaruh perlakuan BAP ke-i : Pengaruh perlakuan TDZ ke-j : Pengaruh interaksi antara perlakuan BAP ke-i dan TDZ ke-j : ilai galat/error percobaan pada perlakuan BAP ke-i, TDZ ke-j dan ulangan ke-k Hipotesis dalam uji F: H0 : Perlakuan tidak berpengaruh terhadap pertumbuhan kalus pada eksplan daun H1 : Perlakuan berpengaruh terhadap pertumbuhan kalus pada eksplan daun Pengambilan keputusan uji F:
22 Terima H0 = Perbedaan taraf pemberian antibiotika pada media kultur tidak berpengaruh terhadap tingkat kontaminasi pada selang kepercayaan 95% (α=0,05) Terima H1 = Sekurang-kurangnya ada taraf pemberian antibiotika pada media kultur yang berpengaruh nyata terhadap tingkat kontaminasi pada selang kepercayaan 95% (α= 0,05) Untuk mengetahui pengaruh yang diberikan pada percobaan dilakukan uji- F yang diperoleh dari hasil analisis ragam atau analysis of variance (AOVA). Kemudian dibandingkan dengan F tabel pada selang kepercayaan 95% (α=0,05) dengan kaidah : 1. Jika F hitung < F tabel maka H0 diterima, H1 ditolak sehingga pemberian antibiotika pada media kultur tidak berpengaruh terhadap tingkat kontaminasi. 2. Jika F hitung > F tabel maka H0 ditolak H1 diterima sehingga pemberian antibiotika pada media kultur berpengaruh nyata terhadap tingkat kontaminasi. Jika sidik ragam memberikan hasil berpengaruh nyata, selanjutnya dilakukan uji Duncan untuk mengetahui beda antar perlakuan. Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Statiscal Analysis System 9.1.