III. METODE PENELITIAN A. Alat dan Bahan Sampel yang digunakan untuk pengukuran ripitabilitas yaitu isolat protein kedelai, kedelai yang ditambahkan dekstrin, dan kacang kedelai, sedangkan untuk pengukuran daya cerna protein yaitu dua puluh minuman bubuk berbasis kedelai. Bahan untuk analisis yang digunakan adalah enzim tripsin (Porcine pancreatic trypsin, type IX-S, BAEE 15.500 unit/mg protein, Sigma), enzim kimotripsin (Bovine pancreatic chymotrypsin, 350 unit/mg powder), enzim peptidase (peptidase from Rhizopus oryzae, Biochemika, Fluka Chemie), NaOH 0.1 N, HCl 0.1 N, H 2 SO 4 pekat, HgO, K 2 SO 4, batu didih, NaOH, Na 2 S 2 O 3.5H 2 O, H 3 BO 3, HCl 0.02 N, NaOH 0.02 N, indikator fenolftalein, campuran indikator metilen red-metilen blue, etanol, HCl 25 %, air destilata, kertas saring, dan kertas saring Whatman 42. Alat-alat yang digunakan adalah ph meter, penangas air, pengaduk, sudip, neraca analitik, hot plate, cawan porselen, cawan aluminium, perangkat Kjeldahl, perangkat sohxlet, penyaring vakum, oven, desikator, gelas ukur, erlenmeyer, buret, pipet mohr, pipet tetes, dan alat-alat gelas lainnya. B. Metode Penelitian Penelitian ini dibagi menjadi empat tahap. Tahap pertama adalah persiapan sampel. Tahap kedua adalah melakukan salah satu tahapan validasi metode yaitu ripitabilitas. Ripitabilitas daya cerna protein in vitro metode Hsu et al. (1977) dilakukan sebanyak tujuh kali ulangan. Tahap ketiga adalah melakukan analisis kimia dan fisik dua puluh minuman bubuk komersial berbasis kedelai dan dilakukan untuk dua batch berbeda dan tahap terakhir adalah analisis data. 1. Persiapan Sampel Tahap awal dari pemilihan sampel adalah mendata sebanyak-banyaknya minuman bubuk berbasis kedelai yang dijual di Indonesia. Tahap selanjutnya adalah mensurvei keberadaan produkproduk tersebut di pasaran. Survei dilakukan di Bogor, Semarang, dan Jakarta. Tahap selanjutnya adalah memilih sampel untuk penelitian hingga akhirnya terilih dua puluh sampel. Sampel-sampel terpilih tersebut kemudian digolongkan berdasarkan usia konsumen, yaitu sampel yang ditujukan untuk konsumen 0-1 tahun; untuk konsumen 1-3 tahun; dan untuk konsumen di atas 3 tahun. Kedua puluh sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel minuman bubuk buatan PT Nutricia Indonesia Sejarhtera (Indonesia), PT Nutrifood Indonesia (Indonesia), Abbott Laboratories B.V (Netherlands), Wyeth Nutritionals Ireland (Ireland), NBTY Manufacturing LLC (USA), PT Gizindo Mitra Sukses (Indonesia), Glisindo (Indonesia), CV Intan Alami (Indonesia), Dodo- Mis (Indonesia), IND Herbal (Indonesia), Soya Jaya Sentosa (Indonesia), Melilea (China), dan PT Amco Mandiri Pratama (Indonesia). Setelah dilakukan analisis kadar proximat dan daya cerna protein, kedua puluh sampel ini dikelompokkan menjadi sampel yang ditujukan untuk konsumen berusia 0-1 tahun, 1-3 tahun, dan di atas 3 tahun (dewasa). Sampel yang ditujukan untuk usia 3 tahun ke atas dibagi lagi menjadi sampel minuman untuk konsumen golongan khusus dan konsumen biasa. Penggolongan menjadi konsumen golongan khusus dan konsumen biasa didasarkan pada hasil proximat sampel, ingredient bahan, dan pernyataan pada label yang menyatakan bahwa produk ditujukan untuk konsumen golongan khusus. 14
Kedua puluh sampel tersebut dibeli di supermarket dan apotek di wilayah Bogor, Semarang, dan Jakarta. Masing-masing sampel dibeli sebanyak dua buah dengan batch yang berbeda dengan syarat sampel belum kadaluarsa. Sampel batch I dibeli pada bulan Maret 2011, sedangkan sampel batch II dibeli pada bulan April 2011. Penentuan batch yang berbeda dapat dilihat dari kode produksi dan tanggal kadaluarsa yang berbeda. 2. Ripitabilitas Daya Cerna Protein Metode Hsu et al. (1977) Ripitabilitas daya cerna protein dilakukan untuk mengetahui apakah metode Hsu et al. 1977 dapat digunakan. Sampel yang digunakan pada pengukuran ripitabilitas adalah isolat protein kedelai, kedelai yang ditambahkan dekstrin, dan kedelai. a. Analisis Proximat Analisis proximat yang dilakukan meliputi analisis kadar air, protein, abu, lemak, dan karbohidrat. b. Ripitabilitas Daya Cerna Protein Metode Hsu et al. (1977) Ripitabilitas dilakukan dengan cara menganalisis daya cerna protein sebanyak tujuh kali ulangan. Data yang diperoleh kemudian dihitung rata-ratanya, simpangan baku (SD), dan simpangan baku relatif (RSD)-nya. 3. Analisis Kimia dan Fisik Dua Puluh Sampel Minuman Bubuk Berbasis Kedelai di Indonesia a. Analisis Proximat Analisis proximat meliputi analisis kadar air, protein, abu, lemak, dan karbohidrat. Analisis proximat dua puluh sampel dilakukan pada sampel batch pertama saja. Pada sampel batch kedua hanya dilakukan analisis kadar air dan protein. Pengukuran daya cerna protein metode Hsu et al. (1977) membutuhkan data kadar protein basis kering sehingga pengukuran kadar air dan protein harus dilakukan sebelum melakukan analisis daya cerna protein. b. Analisis Daya Cerna Protein in Vitro dengan Metode Hsu et al. (1977) Analisis daya cerna protein dua puluh sampel minuman bubuk komersial berbasis kedelai dilakukan untuk dua batch berbeda. Hasil analisis dua batch tersebut kemudian dibandingkan dan diolah dengan uji independent T-test menggunakan program SPSS untuk mengetahui hasilnya berbeda nyata atau tidak. c. Uji Kelarutan Uji kelarutan dua puluh sampel minuman bubuk komersial berbasis kedelai dilakukan untuk dua batch berbeda. Nilai kelarutan dihitung berdasarkan berat residu sampel yang tidak dapat melalui kertas saring Whatman 42. 4. Analisis Data Analisis data dilakukan menggunakan SPSS 17.0. Uji pertama yang dilakukan adalah independent T-test untuk kadar protein, daya cerna protein, dan kelarutan. Uji T dilakukan untuk mengetahui apakah ada perbedaan nyata antara data batch I dan II. Uji lainnya adalah one way ANOVA dan uji lanjut Duncan untuk mengetahui apakah ada perbedaan nyata antar kelompok sampel dan antar sampel dalam satu kelompok. 15
Analisis lain yang dilakukan adalah analisis hubungan antara sampel yang bersumber protein dari isolat protein kedelai atau yang difortifikasi dengan sumber protein hewani dan sampel yang bersumber protein dari kedelai dengan kadar protein, daya cerna protein, dan kelarutannya. Analisis ini dilakukan dengan bantuan Microsoft Excel dan SPSS. C. Prosedur Analisis 1. Analisis Proximat Sampel a. Analisis Kadar Air Metode Oven (AOAC Official Method. 925.10 tahun 2005) Cawan aluminium kosong dikeringkan dalam oven suhu 105 0 C selama 15 menit lalu didinginkan dalam desikator selama 5 menit atau sampai tidak panas lagi. Cawan ditimbang dan dicatat beratnya. Sejumlah sampel (sekitar 1 gram) dimasukkan ke dalam cawan kosong yang telah diketahui beratnya. Cawan beserta isi dikeringkan di dalam oven bersuhu 105 0 C. Pengeringan dilakukan sampai diperoleh bobot konstan. Setelah dikeringkan, cawan dan isinya didinginkan di dalam desikator, ditimbang berat akhirnya, dan dihitung kadar airnya dengan persamaan (1.1). Kadar air (% b/b) = (x-y) x 100% (x-a) (1.1) Keterangan : x = berat cawan dan sampel sebelum dikeringkan (g) y = berat cawan dan sampel setelah dikeringkan (g) a = berat cawan kosong (g) b. Analisis Kadar Protein metode Mikro Kjeldahl (AOAC Official Method. 960.52 tahun 2005) Sampel sebanyak 0.1 0.2 g dimasukkan ke dalam labu Kjedahl 100 ml, lalu ditambahkan 1 g K 2 SO 4, 40 mg HgO, dan 3.5 ml H 2 SO 4 pekat. Setelah itu, didestruksi sampai cairan berwarna jernih, kemudian didinginkan. Tahap selanjutnya adalah destilasi. Larutan sampel hasil destruksi dibilas dengan akuades dan ditambahkan 8 ml larutan NaOH-Na 2 S 2 O 3.5H 2 O, kemudian didestilasi. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer 125 ml yang berisi H 2 BO 3 dan indikator. Hasil destilasi tersebut kemudian dititrasi dengan HCl 0.02 N yang sudah distandardisasi hingga terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Larutan blanko juga dianalisis seperti sampel. Kadar nitrogen dihitung berdasarkan rumus (2.1, 2.2, dan 2.3). % Nitrogen = (ml HCl ml Blanko) x N HCl x 14,007 x 100 % mg contoh (2.1) Kadar protein (% bb) = % Nitrogen x Faktor Konversi (FK) (2.2) Kadar protein (% bk) = protein % bb x 100 % 100 kadar air bb (2.3) 16
c. Analisis Kadar Lemak Metode Soxhlet dengan Hidrolisis (AOAC Official Method. 963.15 tahun 2005) Sampel ditimbang sebanyak 1-2 gram lalu ditambah 30 ml HCl 25 % dan 20 ml air. Sampel didihkan selama 15 menit di ruang asam kemudian disaring dengan kertas saring dalam keadaan panas. Selanjutnya, kertas saring dicuci dengan air panas hingga tidak asam lagi. Kertas saring berikut isinya dikeringkan pada suhu 105 0 C. Selanjutnya, kertas saring dilipat dan analisis dilanjutkan pada tahap ekstraksi. Labu lemak yang akan digunakan untuk mengekstraksi dikeringkan di dalam oven bersuhu 100-110 0 C selama 15 menit, didinginkan dalam desikator selama 5 menit, kemudian ditimbang. Kertas saring hasil hidrolisis sebelumnya dimasukkan ke dalam selongsong kertas saring baru dan disumbat kapas pada sisi atas dan bawahnya, kemudian dimasukkan ke dalam alat ekstraksi yang telah berisi pelarut hexana. Refluks dilakukan selama 6 jam dan pelarut yang ada di dalam labu lemak didistilasi. Selanjutnya, labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven bersuhu 105 0 C hingga beratnya konstan, didinginkan dalam desikator, dan ditimbang. Penghitungan kadar lemak berdasarkan rumus (3.1). Kadar lemak (% bb) = a b x 100% C (3.1) Keterangan : a = berat labu dan sampel akhir (g) b = berat labu kosong (g) c = berat sampel awal (g) d. Analisis Kadar Abu (AOAC Official Method. 923.03 tahun 2005) Cawan porselin dikeringan dalam oven selama 15 menit kemudian didinginkan dalam desikator selama 5 menit dan ditimbang. Sebanyak 2-3 gram sampel ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan porselin. Selanjutnya, sampel dipanaskan di atas hot plate sampai tidak berasap lagi, kemudian dilakukan pengabuan di dalam tanur pada suhu 400-600 0 C selama 4-6 jam atau sampai terbentuk abu berwarna putih. Sampel kemudian didinginkan dalam desikator, selanjutnya ditimbang dan dihitung kadar abunya sesuai rumus (4.1). Kadar abu (% bb) = a b x 100% c (4.1) Keterangan : a = berat cawan dan sampel akhir (g) b = berat cawan kosong (g) c = berat sampel awal (g) e. Analisis Kadar Karbohidrat by Difference Pengukuran kadar karbohidrat menggunakan metode by difference, dilakukan dengan rumus (5.1). Kadar karbohidrat (% bb) = 100% - (kadar air + kadar protein + kadar lemak + kadar abu) (5.1) 17
2. Analisis Daya Cerna Protein Metode Hsu et al. (1977) Sampel yang digunakan untuk menguji ripitabilitas adalah isolat protein kedelai, kedelai yang ditambah dekstrin, dan kacang kedelai. Terlebih dahulu dibuat larutan multi-enzim dalam air destilata. Larutan multienzim terdiri dari campuran 1.6 mg tripsin, 3.1 mg kimotripsin, dan 1.3 mg peptidase per ml akuades. Larutan enzim ini ditepatkan ph-nya menjadi ph 8.00 menggunakan NaOH 0.1 N atau HCl 0.1 N. Larutan multi-enzim selanjutnya disimpan dalam lemari pendingin. Sejumlah sampel disuspensikan dalam akuades sampai konsentrasi 6.25 mg protein/ml. Sebanyak 25 ml suspensi sampel ditaruh dalam gelas piala kecil, kemudian diatur ph-nya menjadi ph 8.00 dengan menambahkan NaOH 0.1 N atau HCl 0.1 N. Selanjutnya sampel dimasukkan dalam penangas air 37 0 C selama 5 menit sambil diaduk. Sebanyak 2.5 ml larutan multienzim ditambahkan (saat penambahan enzim dicatat sebagai waktu ke nol) ke dalam suspensi sampel sambil tetap diaduk dalam penangas air 37 0 C. Nilai ph suspensi sampel dicatat pada tepat menit ke-10. Daya cerna protein dinyatakan dengan rumus (6.1). Y = 210.464 18.103x (6.1) Keterangan : Y = daya cerna protein x = ph pada menit ke-10 Pada pengujian ripitabilitas dilakukan pengulangan (repeat) tujuh kali terhadap larutan sampel yang dibuat sesuai prosedur yang diukur pada hari yang sama, dengan alat yang sama, oleh orang yang sama, dan di tempat yang sama. Data yang diperoleh kemudian dihitung rata-ratanya, SD, dan RSD-nya. Metode bisa dikatakan valid jika nilai RSD analisis (RSD a) lebih kecil dibanding RSD Horwitz (RSD h). RSD a dan RSD h dapat dihitung menggunakan rumus (7.1 dan 7.2). RSD a = SD x 100 X (7.1) RSD Horwitz = (7.2) Keterangan : SD = Standar deviasi X = nilai rata-rata C = nilai rata-rata konsentrasi analat 3. Uji Kelarutan (AOAC 1995) Pengukuran kelarutan dihitung berdasarkan berat residu yang tidak dapat melalui kertas saring Whatman 42. Sejumlah sampel ditimbang (sekitar 0.75 gram) lalu dilarutkan dalam 100 ml air destilata dan disaring dengan penyaring vakum. Kertas saring sebelum digunakan dikeringkan terlebih dulu dalam oven sekirat 30 menit lalu ditimbang. Setelah penyaringan, kertas saring beserta residu kemudian dikeringkan dalam oven 100 0 C selama 3 jam lalu didinginkan dalam desikator selama kurang lebih 15 menit dan ditimbang. Kelarutan dapat dihitung berdasarkan rumus (8.1). 18
(8.1) Keterangan : a = berat kertas saring + residu (gram) b = berat kertas saring (gram) c = berat contoh yang digunakan (gram) Ka = kadar air contoh yang digunakan (%bb) 19