ANALISIS MOLEKULER HCV (HEPATITIS C VIRUS) REGIO E1-E2 DAN NS5B PASIEN HIV RUMAH SAKIT UMUM DAERAH DR. MOEWARDI DI SURAKARTA TESIS Disusun untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Mencapai Derajat Magister Program Studi Biosain Oleh: Rizki Nisfi Ramdhini S901108007 PROGAM PASCA SARJANA UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2014
ANALISIS MOLEKULER HCV (HEPATITIS C VIRUS) REGIO E1-E2 DAN NS5B PASIEN HIV RUMAH SAKIT UMUM DAERAH DR. MOEWARDI DI SURAKARTA TESIS Disusun untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Mencapai Derajat Magister Program Studi Biosain Oleh: Rizki Nisfi Ramdhini S901108007 PROGAM PASCA SARJANA UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2014 1
2
3
PERNYATAAN ORISINALITAS DAN PUBLIKASI ISI TESIS Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa: 1. Analisis Molekuler HCV (Hepatitis C Virus) Regio E1-E2 dan NS5B Pasien HIV Rumah Sakit Umum Daerah Dr. Moewardi di Surakarta tidak terdapat karya ilmiah yang pernah diajukan oleh orang lain untuk memperoleh gelar akademik serta tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis digunakan sebagai acuan dalam naskah ini dan disebutkan dalam sumber acuan serta daftar pustaka. Apabila di kemudian hari terbukti terdapat plagiat dalam karya ilmiah ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai ketentuan perundang-undangan (Permendiknas No 17, tahun 2010). 2. Publikasi sebagian atau keseluruhan isi tesis pada jurnal atau forum ilmiah lain harus seijin dan menyertakan tim pembimbing sebagai author dan PPs UNS sebagai institusinya. Apabila dalam waktu sekurang-kurangnya satu semester (enam bulan sejak pengesahan tesis) saya tidak melakukan publikasi dari sebagian atau keseluruhan tesis ini, maka Prodi Biosain PPs-UNS berhak mempublikasikannya pada jurnal ilmiah yang diterbitkan oleh Prodi Biosain PPs-UNS. Apabila saya melakukan pelanggaran dari ketentuan publikasi ini, maka saya bersedia mendapatkan sanksi akademik yang berlaku. Surakarta, April 2014 Mahasiswa, Rizki Nisfi Ramdhini S901108007 4
5
KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis panjatkan atas kehadirat Allah SWT berkat limpahan nikmat, rahmat serta hidayah-nya penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul Analisis Molekuler HCV (Hepatitis C Virus) Regio E1-E2 dan NS5B Pasien HIV Rumah Sakit Umum Daerah Dr. Moewardi di Surakarta Di dalam melakukan penelitian maupun penyusunan naskah tesis ini penulis mendapatkan banyak masukan, bantua dan bimbingan dari berbagai pihak yang bermanfaat baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terimaksih kepada: 1. Prof. Dr. Ravik Karsidi, M.S selaku Rektor Universitas Sebelas Maret. 2. Prof. Dr. Ir. Ahmad Yunus, M.S selaku Direktur Program Pasca Sarjana. 3. Prof. Dr. Sugiyarto, M.Si selaku Ketua Program Studi Biosain yang telah memberikan arahan dalam proses pembelajaran di Program Studi Biosain. 4. Dr. Ari Susilowati, M.Si selaku Sekretaris Program Studi Biosain. 5. Afiono Agung Prasetyo dr., Ph.D selaku pembimbing tesis yang telah memberikan saran, kritikan, arahan dan motivasinya. 6. Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D selaku pembimbing tesis yang telah memberikan saran dan arahan. 7. Teknisi Laboratorium Biomedik dan staf administrasi serta teman-teman asisten Biomedik di fakultas kedokteran Universitas Sebelas Maret. 8. Staf administrasi Program Studi Biosain atas bantuan dan kerja samanya. 9. Orang tua dan keluarga atas doa, dukungan dan semangat yang selalu dicurahkan. 10. Teman-teman Program Studi Biosain angkatan 2011, mbk nova, mbk fahrida, mbk andriyani, mbk lisdyah, inggrit, angga, pak edi, pak pri atas semangat dan dukungannya. 11. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu atas segala bantuannya dalam penyelesaikan penelitian dan penyusunan tesis ini. 6
Penulis menyadari bahwa naskah tesis ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran untuk perbaikan dan pembelajaran selanjutnya. Akhir kata penulis mengharapkan agar naskah ini nantinya dapat memberikan manfaat bagi semua pihak. Surakarta, April 2014 Penulis 7
Rizki Nisfi Ramdhini, S901108007, 2014, Analisis Molekuler HCV (Hepatitis C Virus) Regio E1-E2 dan NS5B Pasien HIV Rumah Sakit Umum Daerah Dr. Moewardi di Surakarta. TESIS. Pembimbing 1: Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D, II: Afiono Agung Prasetyo dr., Ph.D. Program Pascasarjana, Universitas Sebelas Maret Surakarta. ABSTRAK Sekitar 15-30% dari pasien dengan HIV (Human immunodeficiency Virus) diperkirakan koinfeksi dengan HCV (Hepatitis C Virus). Pasien koinfeksi HIV-HCV lebih mungkin untuk progresivitas sirosis dan risiko AIDS. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendeteksi infeksi HCV pasien HIV di Rumah Sakit Umum Moewardi Surakarta dan analisis motif esensial di sebagian region HCV E1-E2 dan HCV NS5B. Sebanyak 100 sampel plasma diperoleh dari 100 pasien HIV di VCT (voluntary counselling and testing) di Rumah Sakit Umum Moewardi Surakarta. Dalam studi ini, deteksi RNA HCV meliputi isolasi asam nukleat, sintesis cdna, amplifikasi menggunakan nested PCR dan sequencing produk PCR. Hasil sekuensing di-aligment dengan semua sekuen genotipe HCV yang dilaporkan di database GenBank. Identifikasi genotipe HCV berdasarkan analisis filogenetik dan analisis molekuler dilakukan menggunakan software MEGA5. RNA HCV positif terdeteksi pada satu sampel dari 37 sampel anti- HCV positif dan satu sampel dari 63 anti-hcv negatif. Hasil ini menunjukkan bahwa HCV dapat mengalami koinfeksi dengan pasien HIV. Hasil tersebut merupakan petunjuk terhadap pentingnya pemeriksaan HCV terhadap pasien HIV. Sekuensing nukleotida regio NS5B dan E1-E2 menunjukkan satu isolat diidentifikasi sebagai genotipe 1a dan satu isolat sebagai genotipe campuran 1a dan 3k. Di regio E1 terjadi variasi alanine di residu 369. Epitop I regio E2 terjadi variasi di I414V dan T416S (isolat D8-26), dan N417G T416A (isolat D8-87), sedangkan epitop II regio E2 terjadi variasi di W437F, L438I, Q444Y dan H445N (isolat D8-26); L438I, F442I, Q444R dan H445Y (isolat D8-87). Regio NS5B ditemukan variasi di motif A RdRp NS5B yaitu D220Y (isolat D10-87) sedangkan di motif B dan C tidak ditemukan variasi asam amino baik di isolat D10-26 dan D10-87.Variasi tersebut diketahui tidak menurunkan kesensitivan terhadap antibodi monoklonal dan terapi antiretroviral (ARV). Kata kunci: HCV, HCV E1-E2, HCV NS5B 8
Rizki Nisfi Ramdhini, S901108007, 2014. Molecular Analysis of HCV (Hepatitis C Virus) E1-E2 and NS5B regions in HIV Patients in Dr. Moewardi General Hospital, Surakarta. THESIS. Supervisor I: Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D, II: Afiono Agung Prasetyo dr., Ph.D. Program Study of Sciences. Post-graduate Program of Sebelas Maret University, Surakarta. ABSTRACT Approximately 15%-30% of people with HIV (Human Immunodeficiency Virus) are estimated to be co-infected with HCV (Hepatitis C Virus). HIV- HCV co-infected patients were more likely to develop cirrhosis and had an increased risk of developing AIDS. The aim of this study was to investigate HCV infection in HIV-positive patients in Moewardi General Hospital Surakarta and analysis of essential motif on portion HCV E1-E2 and HCV NS5B regions. A total of 100 plasma samples were obtained from 100 HIV patients in VCT (voluntary counselling and testing) Moewardi General Hospital Surakarta. In this study, detection of RNA HCV which includes nucleic acid isolation, cdna synthesis, amplification by nested PCR and sequencing of PCR products. The sequences result were aligned with all HCV genotype sequences reported in the GenBank database. HCV genotyping was performed by phylogenetic analysis and molecular analysis was performed using MEGA5 software. Positive HCV RNA was detected in one sample from 37 samples of anti-hcv positive and one sample from 63 of anti-hcv negative. These results indicated that HCV can be co-infection in HIV patients. These findings are pointer to the importance of testing for HCV in HIV pasien. Nucleotide sequencing of the NS5B and E1-E2 regions showed that one isolate was identified as 1a dan one isolate was a mixed infection of genotype 1a and 3k. In the E1 region were alanine variation on 369 residue. The epitope I of E2 region showed variations on I414V and T416S (D8-26 isolate), N417G and T416A (D8-87 isolate), while the epitope II of E2 region showed variations on W437F, L438I, Q444Y dan H445N (D8-26 isolate); L438I, F442I, Q444R dan H445Y (D8-87 isolate). In the NS5B region were found variation motif A of RdRp NS5B was D220Y (D10-87 isolate) while in motif B and C were no variation both D10-26 and D10-87 isolates. These variations not decreased sensitivity of monoclonal antibodies and antiretrovirals (ARV) therapy. Keywords: HCV, HCV E1-E2, HCV NS5B 9
HALAMAN JUDUL... i HALAMAN PENGESAHAN PEMBIMIBING TESIS... ii HALAMAN PENGESAHAN PENGUJI TESIS... iii HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS... iv HALAMAN MOTTO DAN PERSEMBAHAN... v KATA PENGANTAR... vi ABSTRAK... viii ABSTRACT... ix DAFTAR ISI... x DAFTAR TABEL... xi DAFTAR GAMBAR... xii DAFTAR LAMPIRAN... xiii BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang... 1 B. Rumusan Maslah... 2 C. Tujuan Penelitian... 2 D. Manfaat Penelitian... 4 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA A. Kajian Teori... 4 B. Kerangka Pemikiran... 13 BAB III. METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian... 14 B. Alat dan Bahan... 14 C. Cara Kerja... 16 D. Analisis Data... 23 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil... 26 B. Pembahasan... 39 BAB V. KESIMPULAN... 59 DAFTAR PUSTAKA... 61 LAMPIRAN... 72 10
DAFTAR TABEL Tabel 1. Homologi sekuen nukleotida E2-E2 dan NS5B isolat uji dengan seluruh isolat di database GenBank berdasarkan 27 Tabel 2. Variasi nukleotida dan asam amino isolat E1-E2 (D8-31 Tabel 3. Variasi nukleotida dan asam amino isolat E1-E2 (D8-33 Tabel 4. Variasi nukleotida dan asam amino isolat NS5B (D10-35 Tabel 5. Variasi nukleotida dan asam amino isolat NS5B (D10-36 Tabel 6. Motif esensial sebagian regio HCV E1-37 Tabel 7. 38 Tabel 8. Daftar reference sequences isolat HCV genotipe 1-7 dari GenBank 78 Tabel 8. Alignment nukleotida isolat NS5B (D10-79 Tabel 9. Alignment nukleotida isolat NS5B (D10-87 81 Tabel 10. Alignment nukleotida isolat E1-E2 (D8-26 83 Tabel 11. Alignment nukleotida isolat E1-E2 (D8-87 11
DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Struktur genom HCV 5 Gambar 2. Pemetaan HCV E1 dan E2 8 Gambar 3. Pemetaan subdomain finger, palm dan thumb 10 Gambar 4. Kerangka berpikir 13 Gambar 5. Skema alur kerja penelitian 25 Gambar 6. Konstruksi phylogenetic tree isolat uji sebagian regio HCV 29 Gambar 7. Konstruksi phylogenetic tree isolat uji sebagian regio HCV 30 Gambar 8. Sekuen asam amino sebagian regio HCV E1 isolat D8-43 Gambar 9. Sekuen asam amino sebagian regio HCV E1 isolat D8-44 Gambar 10. Sekuen asam amino sebagian regio HCV E2 isolat D10-26... 46 Gambar 11. Sekuen asam amino sebagian regio HCV E2 isolat D10-87... 46 Gambar 12. Sekuen subdomain palm (motif B dan motif C) RdRp NS5B isolat D10-51 Gambar 13. Sekuen subdomain palm (motif A, B dan motif C) RdRp NS5B isolat D10-52 12
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Visualisasi hasil 72 Lampiran 2. 74 Lampiran 3. Alignment sekuen nukleotida isolat uji dengan seluruh isolat di database GenBank 76 Lampiran 4. Daftar reference sequences 77 Lampiran 5. Hasil alignment isolat uji dengan reference sequences 79 13