BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di laboratorium Biologi Molekuler Tanaman, Pusat Penelitian Bioteknologi - LIPI, Cibinong, mulai bulan Agustus 2006 sarnpai dengan Agustus 2007. Bahan dan Alat Eksplan yang digunakan pada transformasi adalah kalus clan tunas majemuk yang berasal dari embrio. Sedangkan pucuk, batang dan daun berasal dari biji Acacia mangium Willd yang telah dikecambahkan pada media MS. Biji berasal dari Kebun Botani PUSPIPTEK, Serpong. Vektor yang digunakan dalam transformasi adalah Agrobacterium tumefaciens LBA4404 yang membawa gen xyloglucanase, gen nptii, dan promotor 35s pada plasmid paaxeg300. Vektor ini diperoleh Pusat Penelitian Bioteknologi-LIP1 dari RISH (Research Institute for Sustainable Huymanosphere), Kyoto university, Jepang dalam rangka kerjasama Bioteknologi Kehutanan. Gambar 2 Peta plasmid paaxeg300. RB (batas kanan) dan LB (batas kiri) T-DNA (Sumber: Research Institute for Sustainable Huymanosphere, Kyoto University, Jepang)
Media yang digunakan yaitu media MS (Murashige Skoog), media?4 MS dengan penambahan Kanarnisin, Carbenicillin, TDZ (Thidiamron), dan IAA. Bahan kimia yang digunakan pada kegiatan sterilisasi adalah deterjen, fungisida Dithane M-45, Masalgin, Ethanol 70%, Byclin, dan akuades steril. Bahan kimia lain yang juga digunakan adalah Yeast Extract 1 grtl, Saytone 4 grll, Peptone 5 grll, Sucrose 5 grll, MgS04. 7 H20 0.246 grll, dan Bacto Agar 14 grll. Alat dan barang aus yang digunakan pada penelitian ini antara lain aluminium foil, botol kultur, otoklaf, petridish, botol alkohol, corong, gelas piala, gelas ukur, hot plate magnetic, stirer, inkubator, laminar airflow, bunsen, ph meter, shaker, spatula, mikro pipet, dan timbangan analitik. Metode Penelitian Persiapan eksplan Bahan tanaman yang digunakan untuk menyediakan eksplan yang akan ditransformasi adalah biji Acacia mangium Willd. Prosedur sterilisasi yang digunakan adalah yang telah dikembangkan oleh Pusat Penelitian Bioteknologi - LIPI, Cibinong. Sterilisasi dilakukan dengan cara biji Acacia mangium Willd diberi deterjen (Sunlight) kemudian diletakkan pada air mengalir selama 10 menit. Kemudian, biji Acacia mangium Willd direndam pada air panas (80 OC) selama 30 menit, rendaman biji Acacia mangium Willd dikocok dengan menggunakan shaker selama 30 menit dengan menambahkan Dithane (4 g/100 ml), dibilas 3 kali dengan menggunakan akuades. Tahap selanjutnya biji Acacia mangium Willd direndam pada larutan Masalgin (4 g1100 ml), dikocok dengan menggunakan shaker selama 30 menit, kemudian dibilas 3 kali dengan akuades steril di dalam laminar airflow. Setelah itu, biji Acacia mangium Willd direndam pada larutan Bayclin yang telah diencerkan 1.5 kaii selama 10 menit, kemudian dibilas 3 kali dengan akuades steril. Selanjutnya, biji Acacia mangium Willd direndam pada Ethanol 70% selama 5 menit, lalu dibilas dengan akuades steril3 kali. Biji Acacia mangium Willd dipindahkan ke botol steril, kemudian ditutup rapat dengan aluminium foil dan dikocok dengan menggunakan shaker selama 24 jam. Bahan tanaman yang digunakan untuk induksi embrio somatik adalah berupa embrio dan kotiledon yang berasal dari biji Acacia mangium Willd yang
telah steril, dengan cara biji dikupas untuk diambil embrionya cialam laminar airflow. Untuk mendapatkan kalus yang embriogenik, embrio dikecambahkan pada media MS yang dilengkapi dengan 0,25 mg/l IAA, 1 mg/l TDZ, 20 gra sukrosa, dan 2 g/l gelrite selama 3-4 bulan. Biji Acacia mangium Willd yang tidak dikupas kulit bijinya, dikecambahkan pada media MS tanpa zat pengatur tumbuh selarna 3-4 bulan. Optimasi media seleksi Untuk mendapatkan konsentrasi antibiotik Kanamisin dan Carbenicillin yang tepat dalam menyeleksi tanaman Acacia mangium Willd transgenik, dilakukan uji efektifitas konsentrasi antibiotik pada media MS yang dilengkapi dengan 0,25 mg/l IAA, 1 mg/l TDZ, 20 gr/l sukrosa, dan 2 gra gelrite. Kanamisin dan carbenicillin ditarnbahkan pada media seleksi setelah media diotoklaf dan dibiarkan dingin sampai suhu sekitar 50 OC. Konsentrasi Kanamisin yang diuji adalah 0, 100, 200, dan 400 mg/l. Sementara konsentrasi Carbenicillin yaitu 225 mg/l. Kultur Agrobacterium tumefaciens Agrobacferium tumefacciem yang mengandung paaxeg300 ditumbuhkan pada media YES-cair yang telah ditarnbah 50 mg/l Kanamisin. Diinkubasi dan dikocok dengan menggunakan shaker (150 rpm) pada suhu 28 OC selama 24 jam. Selanjutnya diremajakan pada media YES-cair baru, diinkubasi dan dikocok kembali dengan menggunakan shaker (150 rpm) pada suhu 28 OC selama 24 jam. Suspensi bakteri ini disentrifbgasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 OC untuk diambil peletnya. Kemudian pelet dibilas dengan air steril clan disentrifbgasi kembali (3000 rpm) selama 10 menit pada suhu 4 OC. Pelet bakteri kemudian dilarutkan dengan aquades steril, diukur pada selanjutnya siap digunakan untuk transformasi. Transformasi dan regenerasi Transformasi dilakukan dengan mengikuti prosedur dari Xi dan Hong (2002) dengan beberapa modifikasi. Inokulasi dilakukan dengan perendaman eksplan bersarna suspensi bakteri selama 5 menit. Setelah kokultivasi selama 1
hari pada media?4 MS eksplan dipindah ke media seleksi dengan konsentrasi kanamisin 0, 100, 200, dan 400. Pengamatan dilakukan terhadap eksplan yang tumbuh pada tiap media seleksi. Eksplan yang tumbuh pada media seleksi selanjutnya dipindah pada media regenerasi yang terdiri dari media MS yang dilengkapi dengan 0,25 mg/l IAA, 1 mg/l TDZ, 20 grll sukrosa, dan 2 g/l gelrite. Pengamatan dilakukan terhadap persentase eksplan kalus yang membentuk somatik embrio, jumlah daun yang tumbuh pada eksplan pucuk dan batang. Untuk menumbuhkan akar pada eksplan pucuk dan batang, eksplan dipindah ke media MS yang dilengkapi den- 0,25 mg/l IAA, 20 grll sukrosa, dan 2 g/l gelrite. Uji ekspresi Western blot Untuk mengetahui keberhasilan transformasi, pada eksplan hasil kokultivasi dan eksplan yang tumbuh di media seleksi dilakukan uji ekspresi Western blot. Metoda yang digunakan adalah metoda yang telah dilakukan di Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Cibinong sesuai dengan metoda yang telah dilakukan Park et al. (2004) pada tanaman poplar yang telah ditransformasi. Ekstraksi protein. Bahan tanaman (2-3 tangkai daun) yang diduga transgenik berdasarkan uji media seleksi yang mengandung Kanamisin dirnasukkan ke tabung Eppendorf yang berisi 200 p1 buffer pengekstrak (Sodium acetat ph 5,5), digerus dengan penggerus plastik biru sampai dengan homogen. Kemudian dibiarkan selama 30 menit di dalam es. Setelah disentrifbgasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 "C, kemudian supernatan diambil dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada 4 OC. Prosedur Western blot. Sampel protein dipisahkan dengan 10% SDS-PAGE. Selanjutnya dielektrotransfer ke membran Hybond ECL. Membran direndam pada larutan blocking buffer (4% susu rendah lemak + TBS), diinkubasi pada suhu 4 "C semalaman. Kemudian dibilas dengan aquades steril dan pembilasan dilanjutkan dengan TBS sebanyak 3 Mi. Selanjutnya direndam kembali pada antibodi primer (10 pl TBS + 10 pl XEG), digoyang dengan menggunakan shaker selama 60 menit. Bilas dengan TBS sebanyak 3 Mi. Membran direndam pada antibodi sekunder (10 pl TBS + 2 pl anti rabbit), dieoyang dengan menggunakan shaker
selama 60 menit. Bilas dengan TBS sebanyak 3 kali. Membran direndarn pada antibodi ke tiga (10 pl TBS + 2 pl S-avidin + 2 pl HRP), digoyang dengan menggunakan shaker selama 30 menit. Bilas dengan TBS sebanyak 3 kali. Protein dideteksi dengan ECL solution.