II. METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian a. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian tersebut adalah daun Angsana (Pterocarpus indicus Willd.), HNO 3 1 %, HNO 3 pekat, H 2O 2, PbNO 3 PPB (Potassium Phosphate Buffer), guaiacol, polyvinylpyrrolidone, akuabides, aseton 80%, whatman 42, kertas saring dan akuades. b. Alat Alat yang digunakan adalah timbangan analitik, oven, pipet ukur, pipet tetes, kuvet, Spektrofotometer Serapan Atom (SSA), Spektrofotometer UV Vis, cawan porselen, muffle furnace, labu destruksi, gelas ukur, corong, botol film, labu takar, centrifuge, saringan buchner, pisau, galah atau bambu, mortar, tabung effendov, beaker glass, hand counter, kulkas, mikropipet, tip, tabung reaksi, rak tabung, gunting, silet, kertas label, kamera, kantong plastik, tissue dan alat tulis. 2. Lokasi dan Waktu Penelitian Pengambilan sampel daun Angsana dilakukan di empat lokasi dengan tingkat kepadatan lalu lintas yang berbeda di Purwokerto Kabupaten Banyumas, yaitu jalan H. R. Bunyamin, Ovis Isdiman, Dr. Soeharso dan Gerilya. Penelitian dilaksanakan di Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman. Pembuatan filtrat daun untuk pengukuran kadar timbal di Laboratorium Ekotoksikologi. Pengukuran kadar klorofil dan pengukuran aktivitas enzim peroksidase di Laboratorium Genetika dan Laboratorium Lingkungan. Analisis kadar logam berat timbal daun dilakukan di Laboratorium Wahana, Semarang. Penelitian dilakukan pada bulan Oktober 2013- Februari 2014. Gambar lokasi dan objek penelitian disajikan di Lampiran 9. B. Metode Penelitian 1. Metode Penelitian Metode penelitian yang digunakan adalah metode survai dengan teknik purposive sampling. Pengambilan sampel daun diulang masing-masing jalan sebanyak 6 kali. Variabel bebas dalam penelitian berupa kadar timbal pada daun, 5
sedangkan variabel terikat berupa kadar klorofil dan aktivitas enzim peroksidase daun Angsana. 2. Cara Kerja a. Pengambilan Sampel Sampel daun yang diambil adalah tajuk paling bawah dari cabang dekat batang utama, dan daun ketiga termuda dari ujung batang (Sembiring dan Sulistyawati, 2006). Pengambilan sampel daun dilakukan dengan menggunakan bantuan pisau, galah atau bambu dan benang kasur. Cara pengambilan sampel adalah sebagai berikut : (1). Pisau diikat dengan galah atau bambu menggunakan benang kasur pada ketinggian dibatasi antara 1-2 m di atas permukaan tanah; (2). Pengambilan sampel dilakukan secara acak di beberapa tanaman Angsana yang terdapat di lokasi pengambilan sampel; (3). Daun sampel dibersihkan dari debu dengan cara menyemprotkan air menggunakan spray dan dikeringkan dengan tissue kemudian dimasukan ke dalam kantong pastik, diberi label. b. Perhitungan Kepadatan Lalu Lintas Kepadatan lalu lintas dinyatakan dalam satuan kendaraan bermotor per jam, dihitung dengan hand counter dalam jangka waktu selama satu jam. Waktu pelaksanaan akan dilakukan pada pagi hari (pukul 06.30-10.00), siang hari (pukul 11.00-14.30) dan sore hari (pukul 15.00-18.30). Lokasi perhitungan kepadatan lalu lintas dilakukan di sekitar pengambilan sampel daun Angsana. Data kepadatan kendaraan bermotor dimasukkan kedalam tabel pada lampiran 1. c. Pengukuran Konsentrasi Timbal Daun (1). Pembuatan filtrat sampel daun (Herlich, 1991) (a). Daun Angsana dikeringkan dengan cara dijemur selama 1 x 24 jam kemudian dikeringkan dalam oven hingga berat konstan. (b). Daun Angsana di potong kecil-kecil dan diambil sebanyak 5 gr lalu dipanaskan dalam muffle furnace pada suhu 600 0 C. Abu 6
daun ditambah dengan HNO 3 pekat sebanyak 10 ml dan H 2O 2 sebanyak 5 ml. (c). Larutan disaring dengan kertas saring Whatman No. 42 dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Filtrat yang didapat diencerkan hingga batas tera kemudian dibaca absorbansinya dengan alat AAS. (d). Data absorbansi dimasukkan ke dalam tabel pada lampiran 2. (2). Analisis kandungan Logam berat (Herlich, 1991) (a). Larutan blanko dibuat untuk menghindari kesalahan dalam penghitungan kadar logam berat dalam sampel yang dianalisis. (b). Larutan blanko dibuat dengan cara memperlakukan aquades sama seperti pada sampel air. (c). Larutan standar digunakan sebagai indikator untuk mengetahui kandungan logam berat dari sampel yang dianalisis. Larutan standar Pb dibuat dengan melarutkan 1,598 gr PbNO 3 ditambah HNO 3 1% sampai homogen, setelah homogen ditambahkan aquades hingga 1000 ml. (d). Kurva standar dibuat dalam tabung reaksi dengan konsentrasi 0,005; 0,01; 0,015 dan 0,02 mg/l. Tabung reaksi dikocok sampai homogen. Adsorbansi larutan standar dengan AAS nyala asetilen. (e). Dibuat hubungan antara konsentrasi Pb (sebagai absis) dan nilai adsorban (sebagai ordinat) dengan analisis regresi linier sehingga didapatkan persamaan Y= a + bx. (f). Analisis kandungan logam berat menggunakan seperangkat alat AAS dengan tingkat kepekaan 0,003. d. Pengukuran Kadar Klorofil (1). Pembuatan ekstrak klorofil ( Arnon, 1949) (a). Sampel helaian daun dengan berat 5 gr dipersiapkan dan dibersihkan. Daun di potong kecil-kecil. (b). Daun ditimbang menggunakan timbangan analitik dengan berat 1 gram. 7
(c). Daun dimasukkan dalam mortar dan ditambahkan 4-5 tetes aseton 80% dimaserasi hingga halus dan berubah menjadi ekstrak yang homogen. (d). Ekstrak disaring dengan kertas saring ke dalam labu ukur berukuran 100 ml. Kemudian ditambahkan dengan aseton 80 % sehingga larutan menjadi 100 ml. (2). Kalibrasi Transmitan Pengukuran kadar klorofil, terlebih dahulu dilakukan kalibrasi terhadap nilai transmitansinya. Nilai transmitan pelarutnya harus dibuat atau diatur 100%, sehingga nilai absorbansi yang dihasilkan saat pengukuran semata-mata ditentukan oleh klorofil sebagai zat terlarutnya (bukan oleh pelarut). Langkah-langkahnya : (a). Spektrofotometer dihidupkan sebelum digunakan untuk mengukur (20 menit) agar alatnya stabil. (b). Pelarut aseton dituangkan ke dalam cuvet sampai garis batas (c). Permukaan luar tabung cuvet dibersihkan dan dikeringkan menggunakan tissue (d). Panjang gelombang pengukuran pada spektrofotometer diatur. (e). Cuvet dimasukkan ke spektrofotometer (f). Nilai transmittan dibuat menjadi 100 %, dengan memutar tombol pengatur sinarnya. (3). Kadar klorofil (Arnon, 1949) (a). Larutan klorofil dituangkan ke cuvet sampai garis batas (b). Permukaan cuvet dibersihkan dengan tissue, dan dimasukkan ke spektrofotometer. (c). Nilai absorbansi dicatat untuk setiap panjang gelombangnya, dengan pelarut aseton : 645 dan 663 nm. (d). Kadar klorofil dihitung menggunakan rumus: Klorofil a = 12,7 D 663-2,69 D 645 (mg/ l) Klorofil b = 22,9 D 645-4,68 D 663(mg/ l) Klorofil Total = 20,2 D 645 + 8,02 D 663 (mg/l) Keterangan : 12,7; 2,69; 22,9; 4,68; 20,2; 8,02 = Konstanta D663, D645 =Absorbansi pada panjang gelombang 663 nm dan 645 nm 8
(e). Data disajikan dalam lampiran 3. e. Pengukuran aktivitas enzim peroksidase (1). Pembuatan ekstrak enzim ( Janda et.al., 2003 ) (a). Beberapa helai daun dipersiapkan dan dibersihkan (b). Daun ditimbang menggunakan timbangan analitik sebanyak 500 mg. (c). Daun dihomogenkan dengan 5 ml PPB ( Pottasium Phosphate Buffer) yang mengandung polyvinylpyrrolidone 4 % pada ph 7 (d). Larutan di sentrifugasi pada 12.000 g pada suhu 4 0 C selama 30 menit, sehingga dihasilkan natan dan supernatant. (e). Supernatan digunakan sebagai ekstrak enzim (2). Pengukuran aktivitas enzim peroksidase ( Janda et. al., 2003 ) (a). Disiapkan 3,5 ml phosphate buffer 50 mm yang mengandung 1 mm guaiacol dan 0,5 mm H 2O 2 pada tabung reaksi dengan ph 5,5 (b). Ditambahkan ekstrak enzim sebanyak 0,4 ml di homogenkan menggunakan mikropipet kemudian di vorteks (c). Diukur menggunakan spektrofotometer Uv vis pada panjang gelombang 470 nm (d). Diukur pada 0 detik dan 60 detik setelah didiamkan (e). Aktivitas satu unit enzim peroksidase dapat dilihat dari peningkatan absorbansi 0,01/ menit. (f). Data aktivitas enzim peroksidase dimasukkan kedalam tabel pada lampiran 4. C. Metode Analisis Data yang diperoleh berupa kadar timbal daun, kadar klorofil dan aktivitas enzim peroksidase kemudian ditabulasi dan disajikan dalam bentuk diagram atau grafik. Data dianalisis menggunakan anova taraf 5 % dan 1 %, analisis statistic. Analisis regresi linier digunakan untuk mengetahui hubungan antar kadar timbal daun dengan respon kadar klorofil dan aktivitas enzim peroksidase. Rumus regresi linier sederhana yaitu Y = a + bx. Keterangan :Y = variabel tak bebas a = konstanta b = koefisien regresi x = variabel bebas. 9