LAMPIRAN Lampiran 1. Pembuatan reagen-reagen untuk tahapan ekstraksi DNA a. Reagen FeCl 3 200 mm FeCl 3 2,7 g Akuades 5 ml FeCl 3 dilarutkan ke dalam akuades yang telah disterilisasi menggunakan autoklaf selama 15 menit. b. Reagen SDS 20% SDS 10 g Akuades 50 ml SDS dilarutkan ke dalam akuades yang telah disterilisasi menggunakan autoklaf selama 15 menit. c. Reagen NaCl 2 M NaCl 11,7 g Akuades 10 ml NaCl dilarutkan ke dalam akuades yang telah disterilisasi menggunakan autoklaf selama 15 menit. d. Reagen TE 1X (Tris 10 mm, EDTA 1 mm) Tris-HCl 1,576 g EDTA 0,2922 g Akuades 1 l Tris-HCl dilarutkan kedalam 800 ml akuades kemudian dihomogenkan dan diatur ph sampai 8. EDTA ditambahkan ke dalam larutan. Akuades ditambahkan 21
hingga volume larutan 1 l. Larutan TE 1X disterilisasi menggunakan autoklaf 15 menit. e. Reagen kloroform : isoamil alkohol (24:1) Kloroform 24 ml Isoamil alkohol 1 ml Kloroform 24 ml dicampurkan dengan isoamil alkohol 1 ml kemudian dihomogenkan dengan cara dikocok. 22
Lampiran 2. Elektroforesis gel agarosa a. Pembuatan TAE 50X Tris base Asam asetat glasial EDTA 0,5 M (ph 8) Akuades 242 g 57,1 ml 100 ml sampai 1 l Semua bahan dicampurkan dan dihomogenkan dengan hotplate dan stirrer. TAE 50X yang sudah homogen disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit. b. Pembuatan gel agarosa 1,5% Agarosa TAE 1X 6 g 40 ml DNA Fluorosafe 4 µl Agarosa dimasukkan ke dalam TAE 1X lalu dihomogenkan menggunakan hotplate dan stirrer. Campuran yang telah homogen dibiarkan hingga hangat kemudian ditambahkan DNA fluorosafe. Gel dituangkan ke dalam cetakan yang telah dipasang selotip pada kedua ujungnya dan diberi sisir pembuat sumuran. Selotip dan sisir pembuat sumuran dilepas setelah gel memadat dan gel siap digunakan. c. Persiapan running elektroforesis Cara kerja : Tangki elektroforesis diisi dengan TAE 1X. Gel agarosa yang telah memadat dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis. Pastikan gel agarosa dalam posisi terendam TAE 1X. Sampel dicampurkan dengan loading dye 6X dengan perbandingan antara sampel dan loading dye 5:1. Satu per satu sampel dimasukkan ke dalam sumuran. Tutup pengaman tangki elektroforesis dipasang kemudian disambungkan kabel listrik antara tangki dengan adapter. Pastikan pemasangan kabel positif dan negatif tidak terbalik. Adapter dinyalakan kemudian atur voltase pada 100 V, kuat arus 400 ma dan waktu 50 menit. Tombol run ditekan untuk memulai running. 23
Lampiran 3. Pembuatan reagen denaturing gradient gel electrophoresis a. Larutan 40% acrylamide/bis (37.5:1) Acrylamide Bis-acrylamide Akuades 38.93 g 1.07 g sampai 100 ml Semua bahan dicampurkan dalam botol gelap dan dihomogenkan dengan cara dikocok. Larutan disimpan pada suhu 4 o C. b. Larutan 0% denaturan gel acrylamide/bis 8% 40% Acrylamide/Bis 20 ml 50x TAE buffer 2 ml dh2o 78 ml Semua bahan dicampurkan dalam botol gelap dan dihomogenkan dengan cara dikocok. Larutan disimpan pada suhu 4 o C. c. Larutan 100% denaturan gel acrylamide/bis 8% 40% Acrylamide/Bis 20 ml 50x TAE buffer 2 ml Formamide (deionized) 40 ml Urea 42 g Akuades sampai 100 ml Semua bahan dicampurkan dalam botol gelap dan dihomogenkan dengan cara dikocok. Larutan disimpan pada suhu 4 o C. d. Ammonium persulfate 10% Ammonium persulfate Akuades 0.1 g 1.0 ml 24
Semua bahan dicampurkan dalam tabung microcentrifuge 1,5 ml dan dihomogenkan dengan cara tabung dibolak-balik 20 kali. e. Pembuatan gel akrilamid/bis dengan konsentrasi denaturan 25% dan 60% Denaturing Solution 25% 60% 100% 5 ml 12 ml 0% 15 ml 8 ml Volume total 20 ml 20 ml 25
Lampiran 4. Pre-heating running buffer TAE 1X Cara kerja : a. Tangki elektroforesis diisi dengan 7 l buffer TAE 1X. b. Temperature control module diletakkan di atas tangki elektroforesis. Arus listrik disambungkan ke temperature control module dan nyalakan alat, pemanas dan pompa (gambar 7.1). Temperature control module Power Pompa Tangki elektroforesis Pemanas Gambar 7.1. Proses pre-heating buffer TAE 1X c. Pengaturan suhu diatur menjadi 60 o C dan ditunggu hingga buffer mencapai suhu yang diinginkan. 26
Lampiran 5. Perakitan alat cetakan parallel gradient gel Cara kerja : a. Clamp, glass plate dan spacer dipersiapkan ditempat yang rata dan bersih. Pastikan glass plate yang lebih panjang berada di bawah dan kedua glass plate dipisahkan oleh spacer membentuk sandwich (gambar 7.2). Clamp Glass plate Spacer Gambar 7.2. Posisi clamp, glass plate dan spacer yang akan dirakit b. Clamp dipasangkan pada kedua ujung sandwich (gambar 7.3). Clamp dikencangkan dengan cara memutar screw yang ada di atas clamp. Screw Gambar 7.3. Proses pemasangan clamp pada sandwich c. Sandwich diletakkan pada salah satu alignment slot dari casting stand. Pastikan aligment slot telah diberi grey sponge. Clamp dikendorkan dan alignment card dimasukkan ke dalam cetakan gel untuk mengatur spacer berada ditempat yang tepat (gambar 7.4). Clamp dikencangkan kembali. 27
Casting stand Alignment card Grey sponge Gambar 7.4. Pengaturan posisi spacer pada sandwich dengan alignment card d. Alignment card dikeluarkan dari cetakan gel. Cetakan gel diisi dengan akuades steril untuk memastikan cetakan tidak bocor. Apabila cetakan masih bocor maka penyusunan cetakan gel diulangi dari awal kembali. e. Cetakan yang sudah baik dilepaskan dari casting stand untuk mengeluarkan akuades steril kemudian dipasang kembali pada casting stand. 28
Lampiran 6. Mencetak parallel denaturing gradient gel Cara kerja : a. Gradient delivery system dirakit (gambar 7.5). Gambar 7.5. Gradient delivery system yang telah dirakit b. Low density solution (gel 25% denaturan) dan high density solution (gel 60% denaturan) disiapkan dalam tabung disposable 50 ml. DCode Dye solution 100 µl ditambahkan pada high density gel. Ammonium persulfat 40 µl dan TEMED 40 µl ditambahkan ke dalam Low density gel dan high density gel kemudian dihomogenkan dengan cara dikocok. c. Low density solution dan high density solution dimasukkan ke masing-masing syringe. Pastikan tidak ada gelembung udara yang terperangkap. Syringe ditekan hingga gel solution mencapai ujung long tygon tubing. d. Masing-masing syringe dipasang kembali pada gradient delivery system. Long tygon tubing kedua syringe dipasang pada Y-fitting short tygon tubing. Ujung needle diletakkan di atas bagian tengah cetakan gel (gambar 7.6). Needle Short tubing Y-fitting Long tubing Gambar 7.6. Proses penuangan gel ke dalam cetakan 29
e. Cam diputar perlahan untuk memintahkan gel ke dalam cetakan. Setelah gel berada pada cetakan, sisir pembuta sumuran dipasang di atas cetakan (gambar 7.7). Sisir Gambar 7.7. Pemasangan sisir pada gel yang telah dituang f. Gel dibiarkan memadat sekitar 60 menit. Setelah gel memadat, sisir dilepas dari cetakan dan gel beserta cetakannya dilepas dari casting stand. Gel siap dielektroforesis. 30
Lampiran 7. Denaturing gradient gel electrophoresis Cara kerja : a. Sandwich berisi gel dan core diletakkan pada permukaan yang datar dan bersih. b. Sandwich berisi gel dipasang pada core (gambar 7.8). Core Gambar 7.8. Pemasangan sandwich pada core c. Temperature control module dimatikan ketika buffer mencapai suhu 60 o C. Temperature control module dipindahkan pada DCode lid. Core berisi sandwich diletakkan pada tangki elektroforesis dengan posisi bulatan merah berada pada sisi kanan dan bulatan hitam pada sisi kiri. d. Sumuran dibersihkan dengan buffer untuk menghilangkan sisa gel yang tidak terpolimerisasi. Sampel dimasukkan ke dalam sumuran menggunakan mikropipet secara hati-hati. e. Temperature control module dipasang kembali pada tangki elektroforesis kemudian power, heater dan pompa dinyalakan (gambar 7.9). Gambar 7.9. Posisi core yang telah dimasukkan pada tangki DGGE 31
f. Kabel disambungkan pada adapter kemudian power dinyalakan. Voltase diatur pada 130 V kemudian tekan tombol run untuk memulai elektroforesis. 32
Lampiran 8. Pewarnaan gel dengan etidium bromida Cara kerja : a. Sumber arus listrik dimatikan setelah elektroforesis selesai dilakukan. Temperature control module diletakkan pada DCode Lid Stand (gambar 7.10). Gambar 7.10. Posisi temperature control module pada DCode lid stand b. Core berisi sandwich diambil dan diletakkan pada permukaan yang rata. Sandwich dilepaskan dari core (gambar 7.11). Gambar 7.11. Proses pelepasan sandwich dari core c. Kedua clamp dilepaskan dari glass plate. Glass plate yang pendek dilepas secara perlahan-lahan. Kedua spacer dilepaskan dan gel dimasukkan ke dalam baki yang berisi 250 ml buffer TAE 1X dan 25 µl EtBr 10 mg/ml. Gel diwarnai selama 15 menit. 33
d. Gel yang telah diwarnai diambil dan dimasukkan ke dalam baki berisi 250 ml TAE 1X selama 20 menit untuk proses destaining. e. Gel diambil kemudian diletakkan pada UV transilluminator untuk didokumentasikan. 34
Lampiran 9. Spesifikasi peralatan dan bahan SPESIFIKASI PERALATAN DAN BAHAN No. Nama Alat Merek/Tipe Kegunaan Tempat 1. Gelas ukur Iwaki PYREX Mengambil dan menakar larutan dengan volume tertentu 2. Labu Erlenmayer Iwaki PYREX Menyimpan dan menghomogenkan reagen 3 Botol - Menyimpan sampel sedimen mangrove dan menyimpan reagen 4. ph indicator strips 5. Timbangan Analitik 35 Merck Mengukur ph OHAUSS Menimbang bahan dengan berat maksimal 0,1 g 200 g 6 Cool box Harvest Menyimpan sampel pada saat pengambilan di lapangan 7. Hot Plate Stuart Memanaskan larutan 8. Magnetic Stirer Stuart Menghomogenkan larutan 9 Sarung tangan Safeguard karet Melindungi tangan pada saat bekerja dan mencegah kontaminasi 10. Autoklaf Hirayama Mensterilisasi dengan uap panas bertekanan 11 Masker IBS Melindungi diri dari bahan-bahan kimia berbahaya 12 Tabung mikrosentrifuge 1,5 ml Biologix dan mencegah kontaminasi Meletakkan sampel pada saat diisolasi DNA 13 Tabung reaksi Iwaki PYREX Tempat preparasi sampel pada saat akan mengisolasi DNA 14. Water bath Heidolph Membantu
melisiskan sel 15. Alumunium foil Klim pak Sebagai penutup erlenmayer, reagen dan botol sampel 16 Tabung Falcon Menampung dan disposable 50 ml meracik reagen 17 Mikropipet 100-1000 µl 18 Mikropipet 20-200 µl 19 Mikropipet 0,5-10 µl Eppendorf Eppendorf Eppendorf DGGE Mengambil larutan dengan volume 100-1000 µl Mengambil larutan dengan volume 20-200 µl Mengambil larutan dengan volume 0,5-10 µl 20 Tip biru Biologix Mengambil larutan dengan volume 100-1000 µl 21 Tip kuning Biologix Mengambil larutan dengan volume 20-200 µl 22 Tip putih Biologix Mengambil larutan dengan volume 0,5-10 µl 23 Alat elektroforesis 24 UV transilluminator 25 Nano spektrofotometri 26 Tabung PCR 0,2 ml CBS Scientific EPS 300X MultiDoc-It 120 Imaging System Implen Biologix 27 Alat PCR Thermal Cycler Techne (TC- 5000) Memisahkan DNA berdasarkan ukuran dan bentuk Visualisasi hasil elektroforesis Mengukur kuantitas dan kemurnian DNA Meletakkan sampel yang akan diamplifikasi Mengamplifikasi fragmen DNA target 28 Alat DGGE Biorad Memisahkan DNA berdasarkan urutan basanya 29 Vorteks IKA MS3 Digital Menghomogenkan larutan dan proses beadbeating 30 Kertas Parafilm M-Parafilm Mencampurkan sampel DNA dengan loading dye Biosains Biologi Biologi Biologi Biologi Biologi Biologi Biologi Biologi Terpadu Biologi Terpadu Biosains Biologi 36
No. Nama Bahan Spesifikasi Kegunaan 1. Sedimen Mangrove - Sebagai sampel untuk penelitian 2 Buffer Tris-HCl Powder Sebagai buffer 3 Asam asetat glasial Cair Sebagai sumber elektrolit 4 EDTA Powder Sebagai anti DNAse 5 FeCl 3 Powder Sebagai pengikat asam humat 6 SDS Powder Merusak dinding dan membran sel bakteri 7 Kloroform Cair Menghilangkan protein 8 Isoamyl alcohol Cair Menghilangkan protein 9 Akuades Cair Sebagai pelarut reagen 10 Alkohol absolut Cair Mengendapkan DNA 11 Alkohol 70% Cair Mencuci DNA dari lemak 12 NaCl Powder Mengendapkan DNA 13 Agarosa Powder Membuat gel untuk elektroforesis agarosa 14 DNA fluorosafe Cair Mewarnai DNA 15 EtBr Cair Mewarnai DNA 16 Primer 27F Cair Mengamplifikasi fragmen DNA target 17 Primer 1540R Cair Mengamplifikasi fragmen DNA target 18 Primer 968F-GC Cair Mengamplifikasi fragmen DNA target 19 Primer 1406R Cair Mengamplifikasi fragmen DNA target 20 Akuabides Cair Mengencerkan DNA 21 Kappa PCR master mix Cair 22 Akrilamid Powder 23 Bis-akrilamid Powder Mengamplifikasi fragmen DNA target Membuat gel akrilamid untuk DGGE Membuat gel akrilamid untuk DGGE 24 UREA Powder Sebagai denaturan DNA 25 Formamide Cair Sebagai denaturan DNA 26 TEMED Cair Memadatkan gel akrilamid 27 Ammonium persulfat Powder Memadatkan gel akrilamid 28 Membuat gradasi warna pada Biorad Dye solution Cair gel akrilamid 29 Loading dye Cair Sebagai pemberat DNA 30 Marka DNA 100 bp Cair Sebagai penentu ukuran DNA 37