ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Transkripsi

1 ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA Oleh: Nama : Ariani Sukma Dewi NIM : B1J Kelompok : 6 Rombongan : III Asisten : Nur Cahyati LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2012

2 I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metodemetode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Pemisahan DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel. Molekul DNA terpisah berdasarkan ukuran ketika dilewatkan pada matriks gel dengan aliran listrik. DNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif. Molekul yang berukuran besar, memiliki kesulitan melewati pori-pori gel sehingga bermigrasi lebih lambat melalui gel dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. Setelah elektroforesis selesai, molekul DNA divisualisasi dengan pewarna fluorescent seperti Ethidium yang berikatan dengan DNA dan berada di antara basa-basa DNA.

3 B. Tujuan Tujuan dari praktikum elektroforesis agarosa ini adalah dapat melakukan elektroforesis gel agarosa.

4 II. MATERI DAN METODE A. Materi Alat yang digunakan dalam praktikum yaitu gelas ukur, labu erlenmeyer, tabung mikrosentifuge, sarung tangan, seperangkat mikropipet beserta tipnya, kertas parafilm, seperangkat alat elektrifororesis, UV trasiluminator, dan kamera digital. Bahan yang digunakan yaitu sampel DNA kromosom buah dan bakteri, agarosa, larutan buffer TAE 50x, akuades, loading dye 6x, dan larutan Etidium Bromid (EtBr). B. Metode 1. Dibuat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara dicampurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades. 2. Dibuat gel agarosa 1% dengan cara ditimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam buffer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna. 3. Disiapkan baki gel agarosa, dilekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa. 4. Dipasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosadengan posisi hamper menyentuh dasar baki. 5. Diperiksa suhu larutan agarosa sampai hangat-hangat kuku, ditambahkan 1µl etidium bromid. 6. Dihomogenkan larutan agarosa, kemudian dituangkan ke dalam baki gel agarosa. Dibiarkan hingga padat. 7. Diambil sisir dengan hati-hati dan dilepaskan selotip dari ujung baki. 8. Dimasukkan baki yang berisi agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi larutan buffer TAE 1x. 9. Dimasukkan 12 µl sampel DNA buah dan bakteri ditambahkan loading dye 6x dengan perbandingan 2: 8 untuk bakteri dan 4 : 8 untuk buah ke dalam sumuran gel agarosa yang sebelumnya telah dihomogenkan antara loading dye dan smapel DNA.

5 10. Dihubungkan tangki elektroforesis dengan power supply sesuai kutub yang ada dalam tangki dan diatur waktu running untuk V=100V, ma= 400 ma, dan waktu 30 menit. 11. Setelah waktu running selesai, gel diambil dan direndam dalam larutan EtBr selama 30 menit. 12. Diamati dalam UV transiluminator.

6 III. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Gambar hasil pengamatan gel agarosa Gambar gel agarosa setelah divisualisasi

7 B. Pembahasan Praktikum kali ini digunakan agarosa karena agarosa memiliki beberapa kelebihan seperti mudah didapat, harganya relatif murah, tidak bersifat toksik, serta memiliki pori yang kecil. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak dari rumput laut. Hasil dari elektroforesis gel agarosa akan menunjukkan warna biru dari loading dye pada posisi paling depan kemudian plasmid DNA berwarna orange terang. Berdasarkan hasil praktikum diperoleh bahwa laju migrasi elektroforesis gel agarosa menunjukkan pergerakan ke arah positif. Hal ini sesuai dengan pustaka yang menyebutkan bahwa teknik elektroforesis pada dasarnya berdasarkan pada fakta bahwa DNA cenderung bermuatan negatif pada ph netral dengan buffer phospat sebagai penyangga ph agar. Saat dilakukan elektroforesis dengan memberikan daya listrik di kedua kutub maka DNA akan bergerak ke kutub positif, inilah prinsip kerja elektroforesis gel agarosa. Agarosa merupakan gel yang memiliki resolusi lebih rendah dalam pemisahan tetapi dapat memisahkan sampel yang berukuran sampai puluhan kilo basa. Agarosa terbuat dari polisakarida, dilarutkan dengan buffer dan dipanaskan, setelah dingin akan membentuk gelatin yang padat (Ripani, 2010). Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan ph dari medium dalam mengkateristik, sehingga

8 pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai (Sumitro et al., 1996). Macam elektroforesis antara lain yaitu elektroforesis kertas dan elektroforesis gel. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, ph, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media (Fatchiyah, 2006). Metoda Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan mulekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing) (Sumitro, 1996). Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutup negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen

9 pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA standar (Sambbrook, 1989). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (Fatchiyah, 2006). Elektroforesis gel agarosa dapat dipakai secara efektif untuk mendeteksi dan mempersiapkan karakterisasi plasmid DNA yang muncul pada isolasi klinis dan pewarnaan laboratoris dari mikroorganisme gram negatif. Metode ini sangat sensitif dan tidak memerlukan radioisotop atau ultrasentrifugasi. Selanjutnya, untuk mendeteksi potongan-potongan DNA berupa bands-dna pada gel agarosa digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengan konsentrasi rendah, seperti intercalating agent etidium bromide (EtBr). Setelah elektroforesis, gel diwarnai dengan EtBr selama kurang lebih 30 menit (Gautom, 1997). Hanya sedikit DNA dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator (Sambrook et al, 1989). Menurut Ripani (2010) fungsi alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel agarosa ini yaitu : Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE memiliki daya ion dalam larutan sebagai penghantar listrik. Loading dye berfungsi sebagai pemberat agar tidak keluar dari sumuran. Etidium bromida sebagai pewarna DNA yang akan menyisip di sela-sela basa nukleotida. UV transiluminator untuk visualisasi pewarnaan DNA didalam gel agarosa.

10 Aquades sebagai pelarut Baki gel agarosa sebagai cetakan gel agarosa TAE : Trisbase sebagai buffer sesuai dengan ph Asam Asetat Glasial sebagai elektrolit gram EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DNA Sisir elektroforesis untuk membuat sumuran pada gel agarosa Tangki elektroforesis untuk running DNA Mikropipet untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA dan loading dye Kertas Parafilm untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan loading dye Sarung tangan untuk melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak DNA Menurut Atang (2007) hubungan antara berat molekul DNA dengan kerapatan agarosa terhadap laju migrasi adalah agarosa gel akan membentuk kerangka-kerangka atau lubang-lubang yang kompleks untuk di lewati molekul DNA menuju elektroda positif. Makin kecil molekul DNA semakin cepat laju migrasinya, sebaliknya makin besar molekul DNA maka semakin lambat laju migrasinya. Komposisi gel juga menentukan ukuran molekul DNA yang dapat dipisahkan. Jika sumuran gel agarosa menyentuh dasar baki tempat pembuatan gel agarosa maka DNA tidak dapat melakukan migrasi. DNA gel elektroforesis adalah teknik biologis eksperimental penting dan sekuensing DNA dapat didefinisikan olehnya. Gel elektroforesis terdiri dari pemecahan molekul menjadi fragmen banyak oleh aksi enzim tertentu. Fragmen ini tersebar di media poliakrilamida atau gel agarosa dimana medan listrik diterapkan. Masing-masing fragmen memiliki muatan listrik yang berbeda dan berat molekul, menyebabkan mereka harus bermigrasi pada tingkat yang berbeda melalui gel (Der Lee, 2011).

11 IV. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat disimpulkan bahwa : 1. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. 2. Prinsip kerja dari elektroforesis gel agarosa adalah memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. 3. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa DNA tidak terfragmentasi secara sempurna. Hal ini disebabkan oleh berbagai faktor diantaranya kemungkinan DNA mengalami kerusakan, penyimpanan DNA hasil PCR yang terlampau lama, maupun pemotongan yang kurang sempurna pada saat melakukan PCR, hingga kesalahan pada saat memasukkan DNA ke dalam sumuran. B. Saran Saran yang dapat diberikan pada praktikum ini adalah pada saat memasukkan sampel DNA kedalam sumuran harus secara hati-hati agar tidak menyebar keluar sumuran.

12 DAFTAR REFERENSI Atang Pengenalan Agarose Gel Electrophoresis. Universitas Negeri Lampung, Bandar Lampung. Der Lee et al., Automatic DNA Sequencing For Electrophoresis Gel Using Image Processing Algorithms. J. Biomedical Science and Engineering, 2011, 4, Fatchiyah Gel Elektroforesis. Laboratorium Sentral Biologi Molekuler dan Seluler Departemen Biologi Universitas Brawijaya. Malang Gautom, Romesh K Rapid Pulsed-Field Gel Electrophoresis Protocol for Typing of Escherichia coli O157:H7 and Other Gram-Negative Organisms in 1 Day. Journal Of Clinical Microbiology. Vol. 35, No. 11: Ripani, M Diagnostik Molekuler. Teknologi Laboratorium Kesehatan (TLK) di Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin, Makassar. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Sudarmadji, S., Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama Liberty. Yogyakarta. Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas KursusTeknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPAUniversitas Brawijaya. Malang