V. HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1 Jumlah Leukosit Data perhitungan terhadap jumlah leukosit pada tikus yang diberikan dari perlakuan dapat dilihat pada Lampiran 6. Rata-rata leukosit pada tikus dari perlakuan dapat dilihat pada Gambar 11. Tikus yang diberi yoghurt sinbiotik dengan konsentrasi starter 5% memiliki jumlah leukosit yang paling tinggi, yaitu 16.040/mm 3 dan jumlah leukosit paling rendah dimiliki oleh hewan percobaan yang diberi perlakuan kontrol negatif (-), yaitu 9.600/mm3. 18 16.04 16 13.88 14 12 Jumlah Leukosit x103 /mm3 10 9.6 12.16 10.78 8 6 4 2 0 A B C D E Pemberian Minuman Pada Tikus Gambar 11. Diagram Batang Jumlah Rata-rata Leukosit Hewan Percobaan (x103/mm3) Perhitungan jumlah leukosit dilakukan untuk melihat daya tahan sistem imunitas tubuh hewan percobaan. Peningkatan jumlah leukosit dari batas normal atau 39 FTIP001653/051
40 disebut juga leukositosis, sedangkan jumlah leukosit yang berada di bawah batas normal atau penurunan jumlah leukosit disebut juga leukopenia. Sel darah putih (leukosit) merupakan komponen darah yang berperan dalam memerangi infeksi. Jumlah normal dari sel darah putih pada tikus putih adalah sekitar 6,6 12,6 ( 103/mm3) (Mitruka dan Rawnsley, 1981 dikutip Febriyantho dan Wisnubroto, 2009). Setiap individu memiliki jumlah leukosit yang berbeda-beda. Hal ini dipengaruhi oleh keadaan fisiologis masing-masing individu yang meliputi umur, jenis kelamin, spesies, iklim, dan kondisi lingkungan (Titik, 2008). Pada penelitian yang dilakukan menggunakan tikus jantan dimana umur yang digunakan sekitar 2-3 bulan. Lingkungan ruangan pada temperatur suhu kamar berkisar antara 20-25 oc, dan kelembapan antara 40%-60%. Peningkatan jumlah leukosit dari batas normal, seperti pada hasil dari hewan percobaan yang diberi perlakuan minuman sinbiotik bonggol pisang batu dengan penambahan starter 4% dan 5%, dapat disebabkan karena terjadi secara fisiologik maupun patologik. Leukositosis yang fisiologik dijumpai pada kerja fisik yang berat, gangguan emosi, kejang, dan haid. Leukositosis patologik dapat menunjukan adanya proses infeksi atau radang akut, luka bakar, kanker, leukemia, anemia sel sabit, penyakit parasit, dan stress karena pembedahan ataupun gangguan emosi. Peningkatan leukosit juga bisa disebabkan oleh obat-obatan, seperi aspirin karena aspirin bersifat irtatif terhadap lambung sehingga meningkatkan resiko luka pada lambung (Kumala, 2010). FTIP001653/052
41 Berdasarkan perlakuan minuman sinbiotik yang diberikan, dari data yang diperoleh, dapat dilihat bahwa hewan percobaan yang diberi perlakuan dengan menambahkan starter 3% adalah hewan percobaan yang memiliki jumlah leukosit terbaik, yaitu sebanyak 12.160/mm3. Hal ini dipilih dikarenakan leukositnya mengalami kenaikan paling besar tetapi masih dalam batas jumlah leukosit tikus normal yaitu 6.600-12.600/mm3. Diikuti oleh hewan percobaan yang diberi dengan perlakuan kontrol (+), kontrol (-), minuman sinbiotik 4%, dan minuman sinbiotik dengan starter 5%. Kontrol positif (+) dianggap lebih baik karena adanya perubahan atau perbedaan dari kontrol negatif (-) dalam batas normal yang menandakan adanya pengaruh dari pemberian yoghurt komersial. Kontrol negatif (-) dianggap cukup baik karena pada diagram batang menunjukan bahwa jumlah rata-rata leukosit masih dalam batas normal. Penambahan starter 4% dan 5% dianggap kurang baik karena adanya perubahan jumlah leukosit melebihi batas normal masing-masing sebesar 1280/mm3 dan 3340/mm3. Perubahan pada konsentrasi 4% tidak terlalu besar dibandingkan dengan penambahan konsentrasi 5%. 5.2 Diferensiasi Leukosit Data perhitungan terhadap diferensiasi leukosit pada hewan percobaan, dapat dilihat pada Lampiran 7. Jenis leukosit yang paling banyak dimiliki oleh hewan percobaan adalah limfosit, yaitu sekitar 40% - 61%, sedangkan yang paling sedikit dimiliki oleh hewan percobaan adalah basofil yaitu 0%. Neutrofil batang atau disebut juga neutrofil pita adalah neutrofil yang belum matang atau belum dewasa, sedangkan FTIP001653/053
42 neutrofil bersegmen adalah neutrofil yang sudah dewasa. Diagram rata-rata diferensiasi leukosit dari hewan percobaan dapat dilihat pada Gambar 12. % Jumlah Diferensiasi Leukosit 70 61 60 54 50 4141 40 40 30 23 18 20 10 21 27 2423 1820 1012 32222 00000 eosinofil basofil 23 9 1214 9 0 neutrofil neutrofil limfosit batang bersegmen kontrol - (minumum putih biasa) kontrol + (probiotik komersial) yoghurt sinbiotik konsentrasi starter 3% yoghurt sinbiotik konsentrasi starter 4% yoghurt sinbiotik konsentrasi starter 5% monosit Gambar 12. Diagram Batang Rata-rata Diferensiasi Leukosit Hewan Percobaan (%) Diferensiasi leukosit menunjukkan jumlah dari jenis-jenis leukosit yang terdiri dari eosinofil, basofil, neutrofil, limfosit dan monosit. Menurut Mitruka dan Rawnsley (1981) dikutip Febriyantho dan Wisnubroto (2009), jumlah sel eosinofil pada tikus normal adalah 0,03 0,08 ( 103/mm3) atau 0,0-1,96%. Jumlah sel basofil pada tikus normal adalah sekitar 0,00 0,03 ( 103/mm3) atau 0,00 0,60%. Jumlah sel neutrofil pada tikus normal 1,77 3,38 ( 103/mm3) atau 4,40 4,92%. Jumlah limfosit pada tikus normal adalah sekitar 4,78 9,12 ( 103/mm3) atau 50,2 84,5%, dan jumlah sel monosit pada tikus normal adalah 0,01 0,04 ( 103/mm3) atau 0,00 1,81%. FTIP001653/054
43 Berdasarkan data yang diperoleh, jumlah limfosit yang paling banyak dimiliki oleh hewan percobaan yang diberi perlakuan yoghurt sinbiotik dengan konsentrasi starter 4% yaitu 61 %, diikuti oleh hewan percobaan yang diberi perlakuan minuman yoghurt sinbiotik dengan konsentrasi starter 3%, minuman probiotik komersial (kontrol positif), dan air putih biasa (kontrol negatif), sedangkan hewan percobaan yang diberi perlakuan minuman dengan starter 5% memiliki jumlah limfosit yang paling kecil, yaitu 40%. Peningkatan limfosit dalam batas normal berpengaruh pada meningkatnya tingkat imunitas, dimana menurut Surono (2004) penghancuran patogen membutuhkan peran Limfosit T sebagai imunitas yang diperantarai oleh sel. Jenis leukosit yang paling sedikit dimiliki oleh hewan percobaan adalah basofil yaitu 0% hal ini menunjukan tidak adanya respon alergi karena ada pada batas normal yaitu berkisar 0% - 0,60%. Pada jenis neutrofil bersegmen, jumlah yang dimiliki oleh hewan percobaan adalah sekitar 18% - 27%. Jumlah ini melebihi batas normal neutrofil pada tikus normal. Peningkatan neutrofil atau neutrofilia dapat terjadi sesaat sesudah stres, latihan berat (Jain, 1986 dikutip Febriyantho dan Wisnubroto, 2009) serta disebabkan infeksi bakteri (Faris, 2010). Peningkatan neutrofil yang paling tinggi dialami oleh hewan percobaan yang diberi perlakuan minuman sinbiotik dengan penambahan starter 5%. Pada jenis leukosit monosit, jumlah yang dimiliki hewan percobaan sekitar 9% - 23%. Jumlah ini melebihi batas normal monosit pada tikus normal. Peningkatan monosit yang paling tinggi dialami oleh hewan percobaan yang diberi perlakuan minuman probiotik komersial (kontrol positif). Peningkatan monosit dapat terjadi FTIP001653/055
44 karena leukemia monositik, dan infeksi bakteri (Mitruka dan Rawnsley, 1981 dikutip Febriyantho dan Wisnubroto, 2009). Pada jenis leukosit eosinofil, jumlah yang dimiliki hewan percobaan sekitar 2% - 3%. Jumlah ini melebihi batas normal eosinofil pada tikus normal. Eosinofilia atau kelebihan eosinofil disebabkan oleh alergi, hipersensitivitas terhadap obat, infeksi parasit, infeksi virus, keganasan, dan kelainan kulit (Faris, 2010). Peningkatan eosinofil yang paling tinggi dialami oleh hewan percobaan yang diberi perlakuan minuman air putih biasa (kontrol negatif). Kelebihan jumlah eosinofil ini tidak terlalu banyak dari batas normal berkisar antara 2% - 3%. Pada Gambar 12 terlihat bahwa hewan percobaan yang diberi perlakuan minuman sinbiotik dengan starter 5% memiliki jumlah limfosit yang paling rendah, jumlah neutrofil yang terlalu tinggi, serta jumlah monosit dan eosinofil yang diatas normal. Hal ini yang menyebabkan jumlah leukosit dari hewan percobaan yang diberi perlakuan minuman yoghurt sinbiotik dengan starter 5% melebihi batas normal. Peningkatan jumlah leukosit dari batas normal dapat disebabkan karena adanya infeksi bakteri dan stres yang berlebih. Infeksi bakteri dari tikus diduga dari keadaan suhu ruangan yang tidak stabil berkisar 20-25 o C memungkinkan terjadinya perkembangan dengan pesat bakteri dari kotoran tikus pada kandang. Stres berlebih terjadi diduga rasa asam pada produk yang diberi, dimana semakin besar konsentrasi dari strater diberikan pada produk rasa asam akan meningkat, yang berpengaruh pada meningkatnya stres tikus percobaan. Hasil uji organoleptik pada yoghurt konsentrasi FTIP001653/056
45 starter 5% lebih asam dibandingkan dengan 4% dan konsentrasi 4% lebih asam dibandingkan dengan 3% (Emininta, 2011). Pada minuman yoghurt sinbiotik dengan konsentrasi 3%, jumlah limfosit yang dimiliki adalah 54%. Jumlah tersebut merupakan jumlah tertinggi kedua, walaupun masih berada di bawah batas normal, jumlah neutrofil yang dimiliki oleh hewan percobaan yang diberi perlakuan minuman probiotik paling rendah. Jumlah monosit dan eosinofil yang dimiliki hewan percobaan tersebut berada diatas batas normal. Dengan melihat hasil diferensiasi leukosit tersebut, jumlah leukosit yang dimiliki hewan percobaan ini masih berada dalam batas normal, yaitu 12.160/mm3. Pada yoghurt sinbiotik dengan penambahan starter 4%, jumlah limfosit yang dimiliki adalah 61%. Jumlah tersebut merupakan jumlah tertinggi dibandingkan dengan hewan percobaan lain, hal ini dinilai baik karena jumlah dari limfosit tersebut masih berada dibatas normal, dan cukup untuk membangun sistem imun yang kuat. Jumlah neutrofil yang dimiliki oleh hewan percobaan yang diberi perlakuan yoghurt sinbiotik dengan starter 4% yaitu terendah kedua dari kenaikan batas normal, hal ini juga dinilai cukup baik. Jumlah monosit dan eosinofil yang dimiliki hewan percobaan tersebut berada diatas batas normal, bahkan untuk jumlah monosit, hewan percobaan yang diberi perlakuan yohurt sinbiotik dengan starter 4% memiliki jumlah yang cukup tinggi dari batas normal yaitu 14%. Pada kontrol (-), jumlah leukosit yang dimiliki hewan percobaan memiliki jumlah yang paling rendah, hal ini karena jumlah monosit yang dimilikinya paling rendah walaupun di atas batas normal. Tetapi, jumlah dari neutrofil dan eosinofil FTIP001653/057
46 yang dimilikinya cukup tinggi dari batas normal, sedangkan limfosit yang dimiliki hewan percobaan tersebut berada di bawah batas normal. Gambar dari jenis-jenis leukosit dapat dilihat pada Gambar 13. (1) (2) (3) (4) Gambar 13. Jenis-jenis Leukosit : (1) Monosit, (2) Limfosit, (3) Neutrofil, dan (4) Eosinofil (Dokumentasi Pribadi, 2011) Gambar-gambar tersebut merupakan gambar yang diambil menggunakan kamera digital langsung dari lensa okuler mikroskop. Adanya perbedaan warna gambar-gambar tersebut diambil dari beberapa slide yang berbeda dengan perbedaan intensitas warna, konsentrasi pewarna dan lamanya paparan zat pewarna. 5.3 Total Bakteri Asam Laktat Pada Feses Perhitungan total bakteri asam laktat pada feses hewan percobaan dilakukan untuk mengetahui jumlah bakteri asam laktat yang masih hidup di dalam saluran percernaan. Menurut Winarno, et.al (2003), jumlah bakteri yang hidup pada feses FTIP001653/058
47 sama dengan jumlah bakteri yang hidup pada usus besar. Bahan baku yoghurt sinbiotik yang digunakan pada konsentrasi 3%, 4%, dan 5% mengandung jumlah bakteri asam laktat masing-masing 2,4 x 107 cfu/g, 3,6 x 107 cfu/g, dan 4,8 x 107 cfu/g. Data perhitungan jumlah bakteri asam lakat pada feses dapat dilihat pada Lampiran 8. Hasil perhitungan total bakteri asam laktat diperoleh rata-rata 0,3 x 106 cfu/g feses untuk perlakuan kontrol negatif (-), dan 0,7 x 106 cfu/g feses untuk perlakuan kontrol positif (+). Pada perlakuan yoghurt sinbiotik diperoleh rata-rata 2,3 x 106 cfu/g feses untuk penambahan starter 3%, 2,4 x 106 cfu/g feses untuk penambahan pada Gambar 14 x 106 cfu/g feses 3 Jumlah Total Bakteri Asam Laktat starter 4%, dan 2,7 x 106 cfu/g feses untuk penambahan starter 5% seperti terlihat 2.7 2.3 2.5 2.4 2 1.5 1 0.5 0.7 0.3 0 A B C D E Pemberian Minuman Gambar 14. Diagram Batang Rata-rata Total Bakteri Asam Laktat Hewan Percobaan (cfu/g feses) FTIP001653/059
48 Pada Gambar 14 dapat dilihat, bahwa jumlah total bakteri asam laktat dari feses hewan percobaan yang diberi perlakuan yoghurt sinbiotik bonggol pisang memiliki jumlah yang lebih banyak dibandingkan kontrol negatif (-) dan kontrol positif (+). Hal ini menunjukkan bahwa bakteri probiotik yang terdapat dalam minuman sinbiotik bonggol pisang batu meningkat efektivitasnya sehingga mampu menjaga sistem imunitas di dalam tubuh tetap baik. Bakteri asam laktat didefinisikan sebagai kelompok bakteri yang membentuk asam laktat, baik sebagai satu-satunya produk maupun sebagai produk utama pada metabolisme karbohidrat. Beberapa ciri yang dimiliki oleh bakteri asam laktat adalah termasuk dalam gram positif, tidak membentuk spora, berbentuk bulat atau batang, dan pada umumnya tidak memiliki enzim katalase (Zaenuri, 2009). Menurut Surono (2004), di dalam lambung terdapat Lactobacillus sebanyak 0-103 cfu/g atau per ml, dan bakteri probiotik sebanyak 0-102 cfu/g atau per ml. Bakteri yang dapat hidup di dalam lambung hanyalah bakteri-bakteri yang tahan asam, karena dalam rongga lambung yang kosong, memiliki ph 3,0 sampai 3,5 (Winarno, et.al, 2003). Di dalam usus halus Lactobacillus yang hidup sebanyak 102105 cfu/g atau per ml, dan sebanyak 103-1011 cfu/g atau per ml (Surono, 2004). Menurut Drasar dan Hill, (1974) dikutip Suryadjaja (2005) dilaporkan bahwa di usus halus mengandung Lactobacillus 102-105 cfu/g atau per ml dan di dalam kolon atau usus besar terdapat Lactobacillus yang hidup sebanyak 104-109 cfu/g. Selanjutnya menurut Surono (2004), bakteri probiotik yang hidup didalam usus besar sebanyak 108-1011 cfu/g atau per ml. Kisaran jumlah total bakteri asam laktat tersebut FTIP001653/060
49 menunjukkan bahwa bakteri probiotik mampu bertahan hidup di dalam saluran pencernaan. Hal tersebut diperkuat dari data perhitungan statistik pada perlakuan dengan dengan uji F, dimana perlakuan menunjukkan F hitung > F tabel 5% dan 1%, hasil analisis data stastik dapat dilihat pada Lampiran 9. Hal ini berarti bonggol pisang batu dalam yoghurt berpengaruh nyata terhadap pertumbuhan bakteri asam laktat. Data hasil uji F dilanjutkan dengan uji Duncan, dimana hasil pada uji Duncan pada taraf 5% dapat dilihat pada Tabel 7. Tabel 7. Pengaruh Perlakuan Terhadap Jumlah Bakteri Asam Laktat Perlakuan A (Kontrol -) B (Kontrol +) C (3%) D (4%) E (5%) Rata-Rata Perlakuan (cfu/g feses) 3,5 x 105 6,6 x 105 2,3 x 106 2,4 x 106 2,7 x 106 Hasil Uji a a b b b Keterangan : Nilai rata-rata yang diwakili huruf menggunakan uji Duncan Perlakuan signifikan pada taraf nyata 5% Pada uji tersebut menunjukan bahwa pada kontrol negatif (-) dan kontrol postif (+) tidak berbeda nyata pengaruhnya terhadap jumlah bakteri asam laktat yoghurt sinbiotik, tetapi berpengaruh nyata lebih kecil dengan perlakuan penambahan starter 3%, 4%, dan 5%. Konsentrasi yoghurt 5% menghasilkan jumlah bakteri asam laktat tertinggi, tetapi tidak berbeda nyata dengan penambahan konsentrasi 3% dan 4%. Pengaruh nyata antara kontrol postif dan negatif dengan yoghurt sinbiotik menunjukkan adanya pengaruh bonggol pisang batu sebagai peran prebiotik dalam FTIP001653/061
50 meningkatkan aktivitas bakteri asam laktat pada yoghurt. Meningkatnya aktivitas bakteri ditandai dengan jumlah bakteri asam laktat pada feses yang lebih besar yang menunjukkan bakteri asam laktat lebih dapat bertahan hidup saat melewati usus. Penambahan konsentrasi 3%, 4%, dan 5% tidak berpangaruh nyata hal ini disebabkan karena range starter yang tidak jauh sehingga berpengaruh terhadap laju pertumbuhan bakteri asam laktat pada yoghurt yang tidak berbeda nyata. FTIP001653/062