34 BAHAN DAN METODE PENELITIAN TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mutu dan Keamanan Pangan, SEAFAST Center, Institut Pertanian Bogor (IPB), Laboratorium Kimia Pangan, Departemen Ilmu Teknologi Pangan (ITP), IPB, serta Laboratorium Gizi Masyarakat dan Sumberdaya Keluarga (GMSK), IPB. Adapun lama penelitian berlangsung sekitar 10 bulan dari Oktober 2005 sampai Juli 2006. BAHAN DAN ALAT Bahan Bahan baku yang digunakan adalah buah vanili segar dan kering jenis Vanila planifolia ANDREWS yang diperoleh dari Desa Tundagan, Kecamatan Ciniru, Kabupaten Kuningan, Provinsi Jawa Barat. Buah vanili segar merupakan buah vanili hijau berusia buah 7-8 bulan dengan karakteristik seragam yakni warna buah hijau, polong penuh, utuh, tanpa cacat atau pecah, panjang minimum 15 cm dan diameter minimum 10 mm. Sedangkan buah vanili kering merupakan buah yang telah mengalami proses kuring dan termasuk mutu II berdasarkan SNI 01-0010-1990 (BSN 1990), dengan syarat umum buah kering memiliki wangi khas vanili, hitam mengkilat, penuh berisi, berminyak, lentur, bebas kapang dan benda asing. Syarat khusus antara lain buah utuh atau terpotong-potong, ukuran polong utuh minimum 8 cm, ukuran polong terpotong-potong tidak disyaratkan, polong utuh yang pecah dan terpotong tidak disyaratkan, kadar air maksimum 30%bb, kadar vanilin minimum 1.5%bk dan kadar abu maksimum 9%bk. Seluruh buah vanili segar dan kering melalui proses pengeringan beku selama 52 jam. Selanjutnya digiling dan diayak dengan saringan berukuran 32 mesh. Pengemasan dilakukan menggunakan plastik rapat dengan keberadaan silica gel, lalu disimpan dalam freezer hingga percobaan dilakukan. Pada Gambar 20 dapat dilihat buah Vanilla planifolia Andrews segar dan kering yang digunakan dalam penelitian ini. Disamping bahan baku, diperlukan juga bahan untuk analisis kimia yakni analisis serat pangan (buffer Na 2 PO 4, HCl, NaOH, etanol, aseton Puriss, petroleum eter, enzim Termamyl, Pepsin, Pankreatin, kertas saring), analisis vanilin (standar vanilin, kertas saring Whatman No.1), analisis glukosa yang terdiri dari pereaksi
35 Nelson (asam molibdat, H 2 SO 4 pekat, Na arsenal), Somogy I (Na 2 SO 4, KNa Tartart, Na 2 CO 3, NaHCO 3 ), Somogy II (Na 2 SO 4, CuSO 4 ), bahan untuk pembuatan buffer sitrat (asam sitrat dan Na-sitrat) serta bahan untuk ekstraksi enzimatik dan optimasi ekstraksi enzimatik yang terdiri dari Celluclast L. (Novo), Viscozyme L. (Novo), β-glukosidase (SIGMA), etanol 95% dan alumunium foil. (a) Gambar 20 Buah Vanilla planifolia Andrews segar (a) dan kering (b) (b) Viscozyme adalah pektinase komersial campuran arabinase, selulase, hemiselulase, silanase dan β-glukanase dari Aspergillus aculeatus dengan aktifitas optimum pada ph 3.3-5.5 dan suhu 25-55 0 C. Viscozyme mengandung 120 FBG/ml dan 32.2 unit aktivitas enzim β-glukosidase (1 unit akan membebaskan 1.0 µmol glukosa dari selobiosa per menit pada ph 4 dan suhu 45 0 C). Sedangkan Celluclast adalah selulase komersial yang memiliki aktifitas selulase dari Trichoderma reesei dengan ph optimum 4.5-6 dan suhu 50-60 0 C. Celluclast mengandung 840 EGU/ml dan 27.7 unit aktivitas enzim β-glukosidase (1 unit akan membebaskan 1.0 µmol glukosa dari selobiosa per menit pada ph 4 dan suhu 45 0 C). Enzim β-glukosidase komersial berasal dari buah almond dengan ph optimum 5. Adapun unit aktivitas enzim β-glukosidase yang terkandung dalam 1 ml enzim adalah 10 unit (1 unit akan membebaskan 1.0 µmol glukosa dari salisin per menit pada ph 5). Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi peralatan gelas, ph meter, refraktometer, termometer, shaker water bath, spektrofotometer double
36 beam, refrigerator, alat pengeringan beku, alat penyaring vakum, timbangan analitik, cawan alumunium, desikator, oven dan krusibel. PROSEDUR PENELITIAN Pada Gambar 21 dapat dilihat bahwa prosedur penelitian terbagi ke dalam 5 tahap yakni; (1) Karakterisasi kimia buah vanili segar dan kering, (2) Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase, (3) Ekstraksi enzimatik buah vanili segar; (a) Satu jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol serta (b) Dua atau tiga jenis enzim komersial dengan pelarut etanol, (4) Optimasi ekstraksi enzimatik dan (5) Pengamatan terhadap kadar air, serat pangan, vanilin, glukosa dan padatan terlarut. Buah Vanili Kering Segar Tahap 1: 1.Karakterisasi kimia - Air - Serat pangan - Vanilin 2.Ekstraksi vanili kering tanpa enzim komersial dengan pelarut etanol Tahap 2: Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase Tahap 3: Ekstraksi enzimatik 1.Satu jenis enzim komersial dengan pelarut etanol/air 2.Dua/tiga jenis enzim komersial dengan pelarut etanol Parameter: Vanilin Ekstrak Terbaik Tahap 4: Optimasi ekstraksi enzimatik 1.Penentuan konsentrasi enzim 2.Penentuan waktu inkubasi enzim Ekstrak Terbaik Gambar 21 Diagram alir tahapan penelitian
37 Karakterisasi Kimia Buah Vanili Segar dan Kering Karakterisasi kimia buah vanili segar dan kering merupakan tahap awal dari penelitian ini. Karakterisasi kimia bertujuan untuk mengetahui kadar senyawasenyawa penting dalam buah vanili segar dan kering, yang dapat mendukung penelitian. Analisis kimia yang dilakukan antara lain kadar air dengan metode gravimetri, serat pangan metode enzimatik dan vanilin metode spektrofotometri. Disamping itu, pada tahap ini pun dilakukan penentuan kadar vanilin dari ekstrak vanili kering yang berfungsi sebagai kontrol terhadap kadar vanilin ekstrak vanili segar yang diproses secara enzimatik. Prosedur ekstraksi vanili kering antara lain dengan menimbang sejumlah vanili kering (perhitungan bahan kering disamakan dengan bahan kering vanili segar), lalu dimasukkan ke dalam tabung tertutup dan ditambahkan aquadest 10 ml. Reaksi dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 50 0 C menggunakan shaker water bath 150 rpm. Kemudian ekstraksi dilanjutkan dengan penambahan etanol 47.5%v/v selama 30 menit. Campuran diencerkan dengan aquadest sampai tanda batas 25 ml labu ukur. Setelah itu ekstrak disaring melalui kertas saring Whatman No.1 dan diukur kadar vanilinnya dengan metode spektrofotometri. Penentuan Suhu Inkubasi Optimum Enzim β-glukosidase Penentuan suhu optimum aktifitas enzim β-glukosidase dilakukan dengan memvariasikan suhu inkubasi pada 30, 37, 45 dan 50 0 C. Prosedurnya antara lain dengan menimbang 3.33 g vanili segar (dikonversikan menjadi berat vanili segar setelah pengeringan beku), lalu dimasukkan ke dalam tabung tertutup dan ditambahkan enzim β-glukosidase 1 ml serta aquadest 9 ml. Reaksi enzimatik dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 30, 37, 45 dan 50 0 C menggunakan shaker water bath 150 rpm dan dilanjutkan 30 menit dengan penambahan etanol 47.5%v/v. Setiap hasil ekstraksi yang diperoleh, diencerkan dengan aquadest sampai tanda batas 25 ml labu ukur. Ekstrak disaring melalui kertas saring Whatman No.1 dan diukur kadar vanilinnya dengan metode spektrofotometri. Suhu inkubasi enzim β-glukosidase yang menghasilkan kadar vanilin tertinggi dianggap sebagai suhu optimum bagi aktifitas enzim β-glukosidase dan kondisi suhu tersebut digunakan untuk inkubasi enzim β-glukosidase pada tahapan
38 penelitian berikutnya yakni ekstraksi enzimatik serta optimasi ekstraksi enzimatik buah vanili segar. Ekstraksi Enzimatik Buah Vanili Segar Ekstraksi enzimatik buah vanili segar bertujuan untuk mengetahui bagaimana pengaruh penggunaan enzim komersial tunggal atau kombinasinya dengan atau tanpa etanol terhadap kadar vanilin ekstrak vanili segar. Pada tahap ini digunakan konsentrasi enzim, jumlah vanili segar, suhu, waktu inkubasi serta konsentrasi larutan etanol berdasarkan hasil penelitian Ruiz-Teran et al. (2001) sebagai acuan. Ekstraksi enzimatik buah vanili segar terdiri dari 2 bagian yakni; Penambahan Satu Jenis Enzim Komersial dengan Pelarut Air dan atau Etanol Tahap ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh penggunaan enzim selulase, pektinase dan β-glukosidase komersial secara tunggal serta pelarut yakni air dan atau etanol terhadap kadar vanilin ekstrak vanili segar. Pada tahap ini terdapat 2 prosedur berdasarkan jenis pelarut yang digunakan. Prosedur pertama adalah ekstraksi enzimatik yang menggunakan air sebagai pelarut yakni dengan menimbang 3.33 g vanili segar (dikonversikan menjadi berat vanili segar setelah pengeringan beku) lalu dimasukkan ke dalam tabung tertutup dan ditambahkan 1 jenis enzim sebanyak 1 ml serta aquadest 9 ml. Reaksi enzimatik dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 50 0 C menggunakan shaker water bath 150 rpm. Sebagai prosedur kedua adalah ekstraksi enzimatik yang menggunakan air dan etanol 95% sebagai pelarut. Prosedurnya sama dengan prosedur 1, namun setelah reaksi berlangsung selama 8 jam, ditambahkan 10 ml etanol 95% dan proses ekstraksi dilanjutkan selama 30 menit. Disamping itu, dilakukan ekstraksi menggunakan pelarut air dengan atau tanpa etanol, tapi tanpa penambahan enzim. Setiap hasil ekstraksi yang diperoleh dari kedua prosedur di atas, diencerkan dengan aquadest sampai tanda batas 25 ml labu ukur. Ekstrak disaring melalui kertas saring Whatman No.1 dan diukur kadar vanilinnya dengan metode spektrofotometri. Pada Tabel 1 dapat dilihat perlakuan penggunaan 1 jenis enzim komersial berikut perlakuan pelarut untuk ekstraksi.
39 Tabel 1 Rekapitulasi perlakuan 1 jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol untuk ekstraksi Perlakuan Penambahan 1 2 3 4 5 6 7 8 air a air+etanol b selulase+air c selulasel+air+etanol pektinase+air pektinase+air+etanol β-glukosidase+air β-glukosidase+air+etanol Keterangan: 1. a air 10 ml ditambahkan pada 3.33 g vanili segar, lalu reaksi berlangsung 8 jam pada suhu 50 0 C. b air 10 ml diditambahkan pada 3.33 g vanili segar, setelah reaksi berlangsung 8 jam pada suhu 50 0 C, ditambahkan 10 ml etanol 95% dan reaksi dilanjutkan selama 30 menit. c selulase 1 ml ditambahkan pada 9 ml air lalu reaksi berlangsung 8 jam pada suhu 50 0 C. 2. Jumlah vanili (3.33 g) dikonversikan terlebih dahulu, apabila digunakan vanili yang telah melalui proses pengeringan beku. Misalnya: berat vanili segar sebelum pengeringan beku adalah 3.33 g dengan kadar air 82.28%, maka berat keringnya 0.5901. Jika digunakan vanili segar setelah pengeringan beku dengan berat kering yang sama, maka jumlah yang digunakan sebesar 0.6464 g. Hasil dari penelitian tahap ini akan memberikan informasi jenis pelarut yang mampu menghasilkan kadar vanilin lebih tinggi, sehingga selanjutnya jenis pelarut tersebut digunakan pada perlakuan ekstraksi dengan penambahan kombinasi enzim. Disamping itu, kadar vanilin ekstrak yang dihasilkan dari setiap perlakuan penggunaan enzim tunggal, selanjutnya dibandingkan dengan perlakuan kombinasi enzim. Kemudian dilakukan optimasi konsentrasi dan waktu inkubasi enzim terhadap perlakuan ekstraksi enzimatik yang menghasilkan kadar vanilin tertinggi, sehingga diperoleh kadar vanilin ekstrak optimum. Penambahan Dua atau Tiga Jenis Enzim Komersial dengan Pelarut Air dan Etanol Tahap ini dilakukan untuk mengetahui efek sinergisme enzim selulase, pektinase dan β-glukosidase sehingga dapat ditentukan apakah ketiga enzim komersial tersebut lebih efektif digunakan secara tunggal atau kombinasi. Pada tahap ini terdapat 2 prosedur berdasarkan jumlah enzim yang digunakan. Prosedur pertama adalah ekstraksi enzimatik menggunakan 2 jenis enzim yakni dengan menimbang 3.33 g vanili segar (dikonversikan menjadi berat vanili segar