13 BAHAN DAN METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Maret 2011 hingga bulan November 2011 di Laboratorium Kultur Jaringan, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Institut Pertanian Bogor. Alat dan Bahan Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf untuk sterilisasi alat maupun media dengan tekanan 17.5 psi (pound per square inch) dan suhu 121 0 C, ph meter untuk mengukur derajat keasaman media yang sesuai, laminar air flow cabinet sebagai kotak pindah steril, shaker untuk proses sterilisasi bahan, dan neraca digital untuk mengukur massa, serta peralatan lainnya seperti magnetic stirrer, tabung erlenmeyer, gelas ukur, botol kultur, pipet volumetrik, tisu, pinset, gunting, cawan petri, dan bunsen. Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah pucuk Mentha piperita yang diperoleh dari petani di Cipanas, Jawa Barat. Bahan lain yang digunakan antara lain aquades, larutan stok media Murashige-Skoog (MS), Chitosan yang telah dilarutkan dengan pelarut asam asetat, 6-Benzylaminopurin (BAP), larutan sterilan dengan bahan aktif sodium hipoklorit 5.25%, dan alkohol. Eksplan dikulturkan dahulu pada media dasar MS tanpa zat pengatur tumbuh untuk perbanyakan bahan tanaman penelitian sebelum dikultur pada media penelitian. Metode Penelitian Penelitian ini disusun dalam rancangan lingkungan kelompok lengkap teracak faktorial dengan 2 faktor. Faktor pertama ialah Chitosan dengan tiga taraf konsentrasi yaitu 0 mg/l, 10 mg/l, dan 20 mg/l. Faktor kedua yaitu BAP dengan lima taraf konsentrasi yaitu 0.0 mg/l, 0.5 mg/l, 1.0 mg/l, 1.5 mg/l, dan 2.0 mg/l. Ulangan dikelompokkan berdasarkan hari tanam eksplan ke media perlakuan. Masing-masing perlakuan diulang 3 kali dan setiap ulangan terdiri dari 15 eksplan sebagai satuan amatan sehingga terdapat 675 satuan amatan dalam penelitian ini. Model rancangan percobaan yang digunakan adalah sebagai berikut:
14 Y ijk = μ + α i + β j + (αβ) ij + ρ k + ε ijk Y ijk μ = pengamatan pada konsentrasi Chitosan ke-i, konsentrasi BAP ke-j, dan ulangan ke-k {k = 1,2,3,...,15} = rataan umum α i = pengaruh konsentrasi Chitosan ke-i {i = 1,2,3} β j = pengaruh konsentrasi BAP ke-j {j = 1,2,...,5} (αβ) ij = pengaruh interaksi Chitosan ke-i dengan BAP ke-j ρ k ε ijk = pengaruh aditif kelompok yang diasumsikan tidak ada interaksi dengan pengaruh perlakuan = pengaruh acak pada konsentrasi Chitosan ke-i, konsentrasi BAP ke-j dan ulangan ke-k Pengolahan data menggunakan uji F dengan program aplikasi SAS (Statistical Analysis System). Faktor yang berpengaruh nyata dilakukan uji nilai tengah menggunakan DMRT (Duncan Multiple Range Test) pada taraf 5% (Mattjik dan Sumertajaya, 2006). Pelaksanaan Percobaan Persiapan Alat Alat yang digunakan selama proses penelitian harus dalam keadaan steril untuk meminimalkan kontaminasi. Alat-alat dicuci dengan deterjen dan dibilas air mengalir sampai bersih. Alat tanam seperti pinset, scalpel, gunting, dan cawan petri dibungkus terlebih dahulu menggunakan kertas selanjutnya disterilisasi bersama botol kultur dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 0 C dan tekanan 17.5 psi (pound per square inch) selama 60 menit. Persiapan Media Perlakuan Media dasar menggunakan media Murashige-Skoog (MS) dengan menambahkan 30 g/l sukrosa, 7 g/l agar, serta penambahan Chitosan dan BAP sesuai perlakuan. Keasaman media telah disesuaikan menjadi 5.9 sebelum autoklaf. Kemudian media disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 0 C dan tekanan 17.5 psi (pound per square inch) selama 20 menit. Media yang
15 telah diautoklaf disimpan selama 4 hari untuk memastikan media bebas dari mikroorganisme. Sterilisasi Bahan Tanam Pucuk Mentha piperita yang diambil dari lapang dicuci bersih dengan air mengalir kemudian direndam dalam larutan bakterisida (Agrept) dan fungisida (Dithane 45) yang masing-masing konsentrasinya 4 g/l selama 3 jam dengan alat shaker. Setelah direndam bakterisida dan fungisida, pucuk Mentha piperita dibilas air steril dua kali lalu direndam sambil dikocok dalam sodium hipoklorit 30% (v/v) selama 30 menit. Selanjutnya bilas sekali lalu direndam dan dikocok dalam sodium hipoklorit 10% (v/v) selama 10 menit. Pucuk yang telah disterilisasi langsung ditanam pada media MS tanpa zat pengatur tumbuh sebagai pra kondisi dan untuk perbanyakan bahan tanam sebelum disubkultur ke media perlakuan. Subkultur Eksplan ke Media Perlakuan Planlet pada media MS tanpa zat pengatur tumbuh disubkultur ke media perlakuan. Eksplan yang digunakan berupa buku tunggal dan bagian pucuk tidak digunakan sebagai eksplan. Setiap eksplan terdiri atas satu buku yang memiliki sepasang mata tunas. Masing-masing botol kultur ditanami tiga eksplan kemudian kultur disimpan dalam ruangan dengan suhu 25 0 C dan cahaya 1000 lux selama delapan minggu. Pengamatan Peubah diamati setiap minggu selama 2 bulan dengan peubah yang diamati antara lain: 1. Persentase eksplan yang terkontaminasi Persentase kontaminasi dihitung dari jumlah eksplan yang terkontaminasi oleh cendawan atau bakteri dibagi dengan jumlah seluruh eksplan dan dikali 100%. 2. Saat terbentuk tunas Mentha piperita in vitro Tunas yang dihitung adalah tunas samping/ aksilar yang tumbuh dari eksplan M. piperita.
16 3. Persentasi eksplan Mentha piperita yang bertunas Persentasi eksplan bertunas didapat dari jumlah eksplan yang menghasilkan tunas dibagi jumlah seluruh eksplan dari masing-masing perlakuan dan dikali 100%. 4. Jumlah tunas per eksplan Mentha piperita in vitro Jumlah tunas yang tumbuh dari setiap eksplan diamati dan dihitung. 5. Tinggi Tunas Mentha piperita in vitro Tinggi tunas diukur mulai dari pangkal tumbuh hingga ujung tunas. Pengukuran tinggi dilakukan dari luar botol kultur dengan cara menempelkan penggaris di dinding botol kultur dan posisi botol kultur harus sejajar dengan mata. 6. Jumlah buku per tunas Mentha piperita in vitro Buku tunas adalah pertemuan tiap ruas yang ditandai dengan tumbuhnya daun. Jumlah buku tunas dihitung dari buku paling bawah hingga ujung dari setiap tunas. 7. Skor Warna batang tunas Mentha piperita in vitro Warna batang planlet merupakan peubah kualitatif sehingga pengambilan data menggunakan sistem skor. Skor tertinggi adalah 3 dengan warna yang mendekati warna tanaman Mentha piperita di lapang. Skor Keterangan 0 warna tunas yang mati (vitreous) 1 warna tunas yang berwarna hijau muda 2 warna tunas yang berwarna hijau tua 3 tunas yang berwarna hijau keunguan
17 8. Skor pertumbuhan akar planlet Mentha piperita Skor Keterangan 0 eksplan yang tidak tumbuh akar 1 eksplan yang memiliki jumlah akar kurang dari 10 2 eksplan yang memiliki jumlah akar lebih dari sama dengan 10 namun kurang dari 20 3 eksplan yang memiliki jumlah akar lebih dari sama dengan 10 namun kurang dari 20 dan panjang akarnya lebih dari 2 cm 4 eksplan yang memiliki jumlah akar lebih dari sama dengan 20 9. Persentase bobot kering Persentase bobot kering dihitung dengan cara bobot kering dibagi bobot planlet segar dan dikali 100%. Pengamatan ini hanya menggunakan tiga ulangan kerena bersifat destruktif. Ulangan berupa planlet Mentha piperita dari setiap perlakuan. Pertama-tama planlet dikeluarkan dari botol kultur dan dibersihkan akarnya dari media agar yang menempel. Bobot basah planlet ditimbang menggunakan neraca digital, lalu planlet dimasukkan ke dalam amplop dan dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 60 0 C selama 24 jam. Bobot kering planlet juga ditimbang untuk menghitung persentase bobot kering planlet.