BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN. A. Ekstraksi. panas karena dalam proses perkolasi ini tidak menggunakan pemanasan.

Transkripsi

1 37 BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN A. Ekstraksi Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode perkolasi. Metode ini dipakai karena dapat melarutkan senyawa yang tahan panas maupun tidak tahan panas karena dalam proses perkolasi ini tidak menggunakan pemanasan. Ekstraksi dilakukan dalam empat tahap menggunakan empat pelarut yang berbeda dari tingkat kepolaran rendah ke kepolaran tinggi. Berturut-turut menggunakan pelarut n-heksan, kemudian kloroform, etil asetat, dan etanol 96%. Jumlah ektrak yang diperoleh dari masing-masing pelarut dari 5 gram simplisia adalah ekstrak n-heksan sebesar 6,3 gram, ekstrak kloroform sebesar 5,4 gram, ekstrak etil asetat sebesar 4,6 gram, dan ekstrak etanol 96% sebesar 5,7 gram. B. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Masing-masing ekstrak kemudian diuji sitotoksik menggunakan metode MTT Assay untuk mengetahui nilai LC 5 dari masing-masing ektrak tersebut. Nilai LC 5 merupakan konsentrasi yang menyebabkan kematian sebanyak 5% dari sel uji yang dapat diestimasi dengan grafik dan perhitungan. Sel kanker yang digunakan adalah sel HeLa (Djajanegara dan Wahyudi, 29). Kultur sel HeLa sering digunakan sebagai model penelitian karena tumbuh lebih cepat sehingga mampu memproduksi lebih banyak sel dalam satu flask dan merupakan sel manusia yang umum digunakan untuk kepentingan kultur sel. Kultur sel HeLa bersifat semi melekat, karena sel kultur melepas suatu protein 37

2 38 matriks ekstraseluler sehingga menyebabkan sel-sel tersebut menempel antara satu dan lainnya dan menempel pada dasar flask. Metode MTT Assay memiliki beberapa keuntungan yaitu sederhana dan sangat efisien untuk kemosensitifitas sehingga banyak digunakan dalam metode uji sitotoksik. Prinsip MTT Assay adalah metode spektroskopi dengan menentukan nilai absorbansi formazan. MTT akan diserap ke dalam sel dan masuk ke dalam sistem respirasi sel dalam mitokondria. Tindakan dari enzim aktif dalam sel mitokondria adalah memetabolisme garam tetrazolium, sehingga pemutusan cincin tetrazolium oleh enzim dehidrogenase yang menyebabkan tetrazolium formazan berubah menjadi tidak larut air tetapi larut dalam SDS % dan berwarna ungu. Formazan terbentuk berwarna ungu akan proporsional dengan jumlah sel hidup (Pebriana et al., 28). Sel yang mati dilarutkan dalam air dan tetap berwarna kuning karena mitokondria sel-sel yang mati tidak melakukan respirasi sehingga cincin tetrazolium terputus dan tidak dapat menyerap reagen MTT. Karakteristik morfologi sel-sel hidup berbentuk bulat dengan dinding sel yang bersinar dan menempel pada pelat bawah karena terbentuknya kristal formazan (Gambar 9A). Sel yang mati berwarna gelap dan tidak menempel pada plat dasar karena tidak membentuk kristal formazan (Gambar 9B), karena sel yang mati kehilangan kemampuannya untuk mempertahankan dan memberikan energi bagi fungsi metabolik serta pertumbuhan sel. Morfologi sel setelah penambahan MTT disajikan pada Gambar 9. Setelah penambahan MTT dan diinkubasi selama 4 jam, ditambah SDS dalam HCl %. Alasan penggunaan SDS % karena dapat

3 39 melarutkan kristal formazan dan hasil reaksi MTT tidak menyebabkan pengendapan. Setelah didiamkan semalam, kemudian dibaca menggunakan ELISA Reader untuk menentukan nilai absorbansi. panjang gelombang yang digunakan adalah 55 nm merupakan panjang gelombang maksimum untuk mendapatkan pengukuran yang sensitif dan spesifik (Pebriana et al., 28). Gambar 8. Perubahan MTT menjadi formazan dalam mitokondria sel hidup (Amalia, 28). B B A A Gambar 9. Sel yang hidup membentuk kristal formazan, (A) Sel hidup, (B) Sel mati pada perbesaran kali. Sebelum dilakukan pengujian, sel ditumbuhkan hingga konfluen atau mencapai jumlah yang dibutuhkan yaitu mencapai kerapatan 2x 4. Media kultur yang digunakan adalah media RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 64 karena media ini dapat mendukung pertumbuhan sel dan biasa digunakan untuk

4 4 kultur sel seperti sel HeLa (Freshney, 2). Pada media RPMI 64 juga ditambahkan serum FBS (Fetal Bovine Serum). Serum ini mengandung hormon yang dapat memacu pertumbuhan sel. Komposisi media RPMI 64 disajikan pada Lampiran. Sel yang konfluen ditandai dengan menempelnya sel pada dasar tissue flask. Sel HeLa bersifat semi melekat sehingga untuk melepaskannya memerlukan tripsin yang berfungsi untuk melepaskan interaksi antara molekul glikoprotein dan proteoglikan dengan permukaan tissue flask hingga sel tidak dapat melekat di dasar tissue flask (Doyle dan Griffith, 2). Sebelumnya tripsin telah diberikan PBS (Phospate Buffer Saline) yang berfungsi untuk menghilangkan serum pada media RPMI 64 karena serum ini dapat menghambat kerja tripsin (Freshney, 25). Morfologi sel HeLa terlihat berbentuk agak runcing karena melekat di dasar tissue flask, sedangkan yang telah diberi tripsin terlihat berbentuk bulat karena tidak melekat pada dasar tissue flask yang dapat dilihat pada Gambar. A A (a) (b) Gambar. (a) sel HeLa sebelum diberi tripsin, (b) sel HeLa setelah diberi tripsin pada perbesaran kali. Keterangan: (A) sel hidup. Sel yang sudah dipanen dipindahkan ke dalam conical tube berisi 2 ml media RPMI komplit (FBS, Pens-strep, Fungizon) kemudian disentrifugasi

5 4 dengan kecepatan 34 rpm selama 5 menit. Dilanjutkan perhitungan kerapatan sel hingga mencapai jumlah 2x 4 dengan hemocytometer. A Gambar. Morfologi sel HeLa pada saat perhitungan dengan hemocytometer pada mikroskop cahaya dengan perbesaran kali. Keterangan: (A) sel hidup. Setelah 24 jam dilakukan pengamatan terhadap kematian sel di bawah mikroskop. Hasil pengamatan menunjukkan perbedaan jumlah kematian sel pada setiap perlakuan. Sel yang mati akan terlihat berwarna gelap, karena mengalami lisis sehingga protein dalam plasmanya akan berikatan dengan ekstrak sehingga sel menjadi berwarna gelap dan bentuknya tidak bulat lagi. Sedangkan sel yang hidup akan berbentuk bulat, lebih terang, dan jernih karena tidak mengalami kerusakan pada membran selnya. Morfologi sel HeLa dapat dilihat pada Gambar 2 dan untuk morfologi sel HeLa setiap perlakuan dapat dilihat pada Lampiran 2.

6 a b c 2 d 2 2 e Gambar 2. Morfologi sel HeLa setelah penambahan ekstrak pada perbesaran x dengan konsentrasi 2 µg/ml. (a) ektrak etil asetat, (b) ektrak etanol 96%, (c) ekstrak n-heksan, (d) ekstrak kloroform, dan (e) kontrol negatif DMSO. Keterangan: () sel hidup tampak berbentuk bulat jernih dan bercahaya di tengahnya dan (2) sel mati tampak berbentuk bulat dan keruh di tengahnya. Dari pengamatan terlihat bahwa penambahan konsentrasi ekstrak uji menyebabkan terjadinya peningkatan jumlah kematian sel. Jumlah sel hidup pada kontrol negatif lebih banyak dibandingkan dengan jumlah sel hidup yang ada pada sumuran dengan penambahan konsentrasi ekstrak uji. Kematian sel lebih banyak terlihat pada ekstrak n-heksan, eksrak kloroform, dan ekstrak etil asetat.

7 43 Sedangkan ekstrak etanol 96% terlihat sangat sedikit kematian yang ditimbulkan seperti halnya kontrol negatif yaitu DMSO. Rendahnya aktivitas sitotoksik pada ekstrak etanol 96% kemungkinan disebabkan karena dalam ekstrak tersebut terdapat beragam senyawa baik yang bersifat polar, semi polar, maupun non polar sehingga efek sitotoksiknya saling mempengaruhi (Djajanegara dan Wahyudi, 29). Berdasarkan hasil dari persentase kematian sel (Lampiran 4), dilakukan analisis data dengan kurva regresi linier. Kurva regresi linier dapat dilihat pada Gambar 3. Pada Gambar 3, dapat dilihat bahwa nilai R² grafik etil asetat (Gambar 3.a) dan grafik kloroform (Gambar 3.c) mendekati atau tidak kurang dari,6. Hal ini menunjukkan kedekatan hubungan antara konsentrasi ekstrak yang digunakan dengan presentase kematian sel, sehingga dapat diketahui bahwa kematian sel benar-benar disebabkan oleh perlakuan ekstrak. Sedangkan, untuk grafik grafik etanol 96% (Gambar 3.b), ekstrak n-heksan (Gambar 3.c) dan grafik DMSO (Gambar 3.e) nilai R² <,6. Hal ini menunjukkan bahwa tidak adanya kedekatan antara ekstrak yang digunakan dengan presentase kematian sel, sehingga dapat diketahui bahwa kematian sel selain disebabkan oleh ekstrak juga disebabkan oleh faktor lain, misalnya fluktuasi dan human error (kesalahan peneliti) (Patel et al., 29).

8 44 mortalitas sel (%) Etil asetat y = 34.8x R² = Log Konsentrasi mortalitas sel (%) Etanol 96% y = 8.28x R² = Log Konsentrasi (a) (b) mortalita sel (%) n heksan y = 2.2x R² = Log Konsentrasi mortalitas sel (%) Kloroform y = 29.83x R² = Log Konsentrasi (c) (d) mortalitas sel (%) DMSO (e) y = 2.48x R² = Log Konsentrasi Gambar 3. Grafik hubungan antara presentase kematian dengan log konsenstrasi sampel. (a) etil asetat, (b) etanol 96%, (c) n-heksan, (d) kloroform, dan (e) DMSO.

9 45 Nilai LC 5 sel HeLa setelah penambahan ekstrak menunjukkan bahwa eksrak n-heksan memiliki nilai LC 5 paling rendah yaitu,436 µg/ml, kemudian ekstrak etil asetat sebesar,5 µg/ml, ektrak kloroform sebesar 5984,6 µg/ml. Dalam kasus ekstrak etanol 96% fluktuasi lebih banyak terjadi sehingga nilai LC 5 yang diperoleh sebesar 3,467 x 36 µg/ml. Demikian pula pada kontrol negatif DMSO memiliki nilai LC 5 sebesar 2,69 x -5 µg/ml. Seperti pada penelitian Patel et al., (29) yaitu uji sitotoksisitas ekstrak Solanum nigrum terhadap sel Vero dengan nilai LC 5 sebesar 6,862 x 8 karena mengalami banyak fluktuasi. Sel vero merupakan sel monolayer berbentuk poligonal dan pipih yang diisolasi dari sel ginjal monyet hijau afrika oleh Yasumura dan Kawakita di universitas Chiba, Jepang. Perhitungan secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 5. Hasil LC 5 menunjukkan bahwa ekstrak daun sirsak dengan pelarut n- heksan dan etil asetat ini memiliki LC 5 < 3 µg/ml sehingga dapat terlihat bahwa ekstrak daun sirsak memiliki efek sitotoksik dan berpotensi sebagai anti kanker (Meyer et al., 982). Semakin kecil nilai LC 5 menunjukkan potensi senyawa tersebut semakin kuat (Supardjan dan Da i. 25). Pada penelitian Djajanegara dan Wahyudi (29), fraksi kloroform daun srikaya (Annona squamosa) dan fraksi etanol 7% dinyatakan bersifat sitotoksik karena memiliki nilai LC 5 < 3 µg/ml. Fraksi kloroform sebesar 4,5467 µg/ml dan fraksi etanol 7% sebesar 7,6984 µg/ml. Pada penelitian ini, ekstrak n- heksan dan etil asetat daun sirsak memiliki nilai LC 5 < 3 µg/ml sehingga dinyatakan bersifat sitotoksik.

10 46 Pada penelitian Gajalakhsmi et al., (22), menyatakan ekstrak etil asetat daun sirsak (A. muricata L.) terhadap sel U 937 (sel kanker darah/leukemia) bersifat lebih aktif membunuh sel daripada ekstrak n-heksan dan metanol daun sirsak (A. muricata L.). Hal tersebut membuktikan bahwa daun sirsak bersifat sitotoksik untuk sel kanker. Berdasarkan nilai LC 5, dapat dikatakan ekstrak yang memiliki potensi sebagai senyawa antikanker dengan aktivitas sitotoksik terbesar adalah ekstrak n-heksan yang kemudian ekstrak n-heksan akan dilanjutkan untuk proses pemisahan kandungan senyawanya dengan fraksinasi. C. Deteksi Kandungan Senyawa Ekstrak Teraktif Deteksi kromatogram ekstrak n-heksan dengan sinar UV 254 memperlihatkan terjadinya peredaman yang ditandai dengan adanya beberapa zona gelap berlatar belakang flouresensi hijau (Gambar 4 dan 5). Peredaman tersebut menunjukkan adanya kandungan suatu senyawa. Selain itu, deteksi dengan sinar UV 366 memperlihatkan bercak yang berpendar dan berwarna. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa tersebut memiliki ikatan rangkap terkonjugasi yang panjang sehingga dapat berpendar pada penyinaran dengan UV gelombang panjang. Deteksi dengan sinar tampak (visibel) menunjukkan beberapa bercak berwarna. Profil KLT ekstrak n-heksan dengan berbagai profil kandungan senyawa dapat dilihat pada Gambar 4 dan 5.

11 47 Rf Rf,75,75,5,5,25,25 s st s st s st (a) (b) Rf Rf,75,75,5,5,25,25 s st s st s st (c) (d) Gambar 4. Profil kromatogram ekstrak n-heksan daun sirsak dengan berbagai metode kromatografi lapis tipis untuk masing-masing senyawa. Keterangan: (a) alkaloid, (b) antrakuinon, (c) flavonoid, (d) glikosida. () UV254, (2) UV366, dan (3) sinar visible. (s) sampel, (st) standard.

12 perpustakaan.uns.ac.id 48 Rf Rf,75,75,5,5,25 s st s st s 2 st, (a) s st s st 3 (b) s st Rf Rf,75,75,5,5,25,25 (c) 2 3 (d) Gambar 5. Profil kromatogram ekstrak n-heksan daun sirsak dengan berbagai metode kromatografi lapis tipis untuk masing-masing senyawa. Keterangan: (a) saponin, (b) steroid, (c) tanin, dan (d) terpenoid. () UV254, (2) UV366, dan (3) sinar visibel. (s) sampel, (st) standard.

13 49 Hasil uji KLT ekstrak n-heksan dengan deteksi sinar tampak (visibel) yang telah disemprot dan sinar UV secara spesifik disajikan pada Tabel. Tabel. Hasil uji KLT ekstrak n-heksan hasil ekstraksi dengan berbagai pereaksi semprot (uji). Uji Senyawa Rf Dragendroff KOH etanolik AlCl 3 (a) Alkaloid Ekstrak,56,8 Penampak Bercak (+) UV254 UV366 Sinar visibel /(-) Hijau Hijau Berpendar Berpendar Standard,5 Hijau Berpendar Oranye (b) Antrakuinon Ekstrak (-) (c) Flavonoid Ekstrak,84 Hijau Berpendar Kuning kecoklatan (+) Standard,62 Hijau Berpendar Kuning kecoklatan - - (-) Asam sulfat 3% Anisaldehid asam sulfat Lieberman burchad Feriklorid 5% dalam HCl, N Vanilin sulfat (d) Glikosida Ekstrak,94 Hijau Berpendar Coklat tua (+) (e) Saponin Ekstrak,87 - Berpendar - (-) Standard,56 - Berpendar - (f) Steroid Ekstrak,87,97 Hijau Hijau Berpendar Berpendar (h) Terpenoid Ekstrak.62 Hijau Berpendar Coklat Coklat (g) Tanin Ekstrak Standard,87,97 Abu-abu tua Abu-abu tua Berpendar Berpendar (+) Abu-abu (-) tua Abu-abu tua Merah muda (+)

14 5 Masing-masing senyawa dideteksi menggunakan metode yang berbeda dan pereaksi semprot yang berbeda pula. Berikut keterangan dari masing-masing metode. a. Deteksi senyawa alkaloid Fase gerak yang digunakan untuk mendeteksi alkaloid berupa metanol : amoniak % (:,5 v/v). Pereaksi semprot yang digunakan untuk mendeteksi senyawa ini adalah dragendroff yang merupakan pereaksi semprot untuk mendeteksi keberadaan senyawa yang mengandung basa nitrogen secara umum dan alkaloid. Apabila hasilnya positif, akan menunjukkan bercak berwarna coklat kekuningan setelah disemprot dengan pereaksi semprot dragendroff (Harborne, 987). Pada hasil kromatogram (Gambar 4.a) tidak muncul adanya bercak berwarna coklat kekuningan, sehingga dapat disimpulkan bahwa di dalam ekstrak n-heksan tidak terdapat senyawa golongan alkaloid. b. Deteksi senyawa antrakuinon Fase gerak yang digunakan untuk mendeteksi antrakuinon berupa n-heksan : etil asetat (6:4 v/v). Pereaksi semprot yang digunakan untuk mendeteksi senyawa ini adalah KOH etanolik. Apabila hasilnya positif, akan menunjukkan bercak berwarna semu merah atau merah coklat (Wagner and Bladt, 996). Pada hasil kromatogram (Gambar 4.b) tidak muncul adanya bercak berwarna semu merah atau merah coklat, sehingga dapat disimpulkan bahwa di dalam ekstrak n-heksan tidak terdapat senyawa yang mengandung antrakuinon.

15 5 c. Deteksi senyawa flavonoid Fase gerak yang digunakan untuk mendeteksi flavonoid berupa butanol : asam asetat : air (4 : : 5 v/v). Pereaksi semprot yang digunakan adalah AlCl 3 untuk mendeteksi senyawa ini. Flavonoid akan memberikan warna kuning jika diamati dengan sinar visible (Wagner, 984). Pada hasil kromatogram muncul bercak berwarna kuning dengan harga Rf,84 (Gambar 4.c), sehingga dapat disimpulkan bahwa di dalam ekstrak n-heksan mengandung senyawa golongan flavonoid. Flavonoid yang merupakan senyawa fenolik alam memiliki sifat antioksidan dan berpotensi dalam menghambat pertumbuhan sel kanker melalui mekanisme penghambatan siklus sel, memacu apoptosis, penghambatan angiogenesis, antiproliferatif atau kombinasi dari beberapa mekanisme tersebut. Jenis flavonoid, misalnya genestein dan kuersetin, mampu menghambat aktivitas protein kinase pada daerah pengikatan ATP. Peran dari protein kinase sendiri, yaitu sebagai sinyal pertumbuhan pada sel-sel kanker dan pada jalur antiapoptosis (Meiyanto et al., 27). d. Deteksi senyawa Glikosida Fase gerak yang digunakan untuk mendeteksi glikosida berupa kloroform : metanol (9: v/v). Asam sulfat 3% digunakan untuk mendeteksi senyawa glikosida. Menurut Wagner (984) glikosida akan menimbulkan bercak berwarna coklat tua pada sinar visible. Pada hasil kromatogram muncul bercak berwarna coklat tua dengan harga,94 (Gambar 4.d), sehingga dapat disimpulkan bahwa di dalam ekstrak n-heksan

16 52 mengandung senyawa glikosida. Di dalam tanaman, glikosida tidak lagi diubah menjadi senyawa lain, kecuali bila memang mengalami peruraian akibat pengaruh lingkungan luar (misalnya terkena panas dan teroksidasi udara). Glikosida menghambat pertumbuhan tumor pada sel limfoid, sel tumor paru manusia, sel tumor serviks, dan melanoma tikus pada kisaran konsentrasi,38,46 mg/ml (Najib, 27). e. Deteksi senyawa saponin Fase gerak yang digunakan untuk mendeteksi saponin berupa kloroform : metanol (95:5 v/v). Pereaksi semprot yang digunakan untuk mendeteksi glikosida adalah anisaldehid asam sulfat. Saponin akan memberikan reaksi positif apabila menimbulkan bercak berwarna biru. Pada hasil kromatogram (Gambar 5.a) tidak menimbulkan bercak berwarna biru, sehingga dapat disimpulkan bahwa di dalam ekstrak n-heksan tidak mengandung senyawa saponin. f. Deteksi senyawa steroid Fase gerak yang digunakan untuk mendeteksi steroid berupa toluene : etil asetat (8:2 v/v). Pereaksi semprot yang digunakan adalah Lieberman Burchad. Apabila hasilnya positif, makaakan menimbulkan berwarna coklat (Wagner, 984). Pada hasil kromatogram (Gambar 5.b) menunjukkan adanya bercak berwarna coklat pada Rf,875 dan,97, sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak n-heksan mengandung senyawa steroid.

17 53 g. Deteksi senyawa tanin Fase gerak yang digunakan untuk mendeteksi tanin berupa etil asetat : asam formiat : asam asetat:air (:::27 v/v). Pereaksi semprot yang digunakan untuk mendeteksi senyawa ini adalah feriklorid 5% dalam HCl, N. Apabila ekstrak ini mengandung tanin, maka akan menunjukkan bercak berwarna abu-abu sampai gelap. Pada hasil kromatogram (Gambar 5.c) menunjukkan tidak adanya bercak berwarna abu-abu sampai gelap, sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak n-heksan tidak mengandung senyawa tanin. h. Deteksi senyawa terpenoid Fase gerak yang digunakan untuk mendeteksi terpenoid berupa toluen : etil asetat (93:7 v/v). Pereaksi semprot yang digunakan adalah vanillin sulfat.apabila hasilnya positif mengandung terpenoid, maka akan menimbulkan bercak berwarna merah muda (Wagner, 984). Pada hasil kromatogram (Gambar 5.d) menunjukkan adanya bercak berwarna merah muda pada Rf,62, sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak n-heksan mengandung senyawa terpenoid. D. Fraksinasi dan Uji Sitotoksisitas Fraksi Fraksinasi dilakukan menggunakan metode Vacuum Liquid Chromatography (VLC). Fraksinasi ini bertujuan untuk dapat mengeliminir senyawa-senyawa yang tidak dikehendaki dan dapat diperoleh konsentrasi senyawa aktif yang lebih tinggi. Metode ini mempunyai keuntungan bekerja

18 54 sangat cepat, sederhana dan dapat digunakan secara luas. Selain itu pemisahan dengan metode ini efisien dalam waktu, banyaknya adsorben dan volume solven yang digunakan (Dewi dkk., 29). Ekstrak n-heksan sebagai ekstrak aktif selanjutnya difraksinasi untuk memisahkan kandungan senyawa-senyawa di dalamnya berdasarkan polaritasnya (Dewi dkk.,29). Ekstrak n-heksan (,2 gram) dicampurkan dengan silika gel 6 PF 254 sehingga menjadi serbuk ( gram). Ekstrak tersebut dielusi dengan komposisi pelarut berdasarkan gradien polaritas, dimulai dengan gradien yang kepolarannya rendah kemudian tingkat kepolaran dinaikkan perlahan-lahan. Pemisahan dengan fraksinasi menghasilkan sebelas fraksi yang dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Fase gerak yang digunakan dalam fraksinasi ekstrak n-heksan daun sirsak dengan metode VLC dan berat kering fraksi yang diperoleh. Fraksi Fase gerak Berat kering yang diperoleh (mg) n-heksan % 4,3 2 n-heksan : etil asetat (9:) (v/v) 49,5 3 n-heksan: etil asetat (8:2) (v/v) 43, 4 n-heksan : etil asetat (7:3) (v/v) 448,5 5 n-heksan : etil asetat (6:4) (v/v) 63,8 6 n-heksan : etil asetat (5:5) (v/v) 29, 7 n-heksan : etil asetat (4:6) (v/v) 5,4 8 n-heksan : etil asetat (3:7) (v/v) 35,3 9 n-heksan : etil asetat (2:8) (v/v) 9,7 n-heksan : etil asetat (:9) (v/v) 24,6 etil asetat % 8,3

19 55 Kesebelas fraksi yang diperoleh kemudian dianalisis dengan KLT untuk kemudian dikelompokkan lagi berdasarkan kesamaan profil. Fase gerak yang digunakan adalah n-heksan : etil asetat (7:3 (v/v) yang dapat memberikan pemisahan yang cukup baik terhadap fraksi larut etil asetat. Profil kandungan kimia dideteksi dengan menggunakan sinar UV 254, sinar UV 366, dan secara visible. Berdasarkan profil kandungan kimia pada gambar 6, fraksi-fraksi tersebut tidak memiliki profil KLT yang sama, sedangkan untuk fraksi,, dan tidak tampak adanya spot atau bercak sehingga tidak diikutkan dalam uji sitotoksisitas untuk fraksi. Hal ini dikarenakan fraksi dimungkinkan masih murni n-heksan sehingga tidak menimbulkan bercak, sedangkan fraksi dan dimungkinkan sudah terlarut dengan etil asetat sehingga tidak menimbulkan bercak. Dari hasil KLT tersebut, maka F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, dan F9 di uji sitotoksik sehingga menjadi F, F2, F3, F4, F5, F6, F7, dan F8.

20 56 R f,75, (a) (b) R f,2 5,75, (c) (d),2 5 Gambar 6. Profil kromatogram penggabungan fraksi hasil fraksinasi dari ekstrak n-heksan daun sirsak dengan (a) UV 254, (b) UV 366, (c) Lieberman burchad, (d) vanillin sulfat. Fase diam : Silika gel 6 GF 254 Fase gerak : n-heksan:etil asetat 7:3 (v/v) Jarak pengembangan : 8 cm Keterangan : Fraksi = fraksi larut n-heksan % Fraksi 2 = fraksi larut n-heksan:etil asetat (9:) (v/v) Fraksi 3 = fraksi larut n-heksan:etil asetat (8:2) (v/v) Fraksi 4 = fraksi larut n-heksan:etil asetat (7:3) (v/v) Fraksi 5 = fraksi larut n-heksan:etil asetat (6:4) (v/v) Fraksi 6 = fraksi larut n-heksan:etil asetat (5:5) (v/v) Fraksi 7 = fraksi larut n-heksan:etil asetat (4:6) (v/v) Fraksi 8 = fraksi larut n-heksan:etil asetat (3:7) (v/v) Fraksi 9 = fraksi larut n-heksan:etil asetat (2:8) (v/v) Fraksi = fraksi larut n-heksan:etil asetat (:9) (v/v) Fraksi = fraksi larut etil asetat %

21 57 Selanjutnya, fraksi aktif tersebut diuji sitotoksik terhadap sel HeLa untuk mengetahui fraksi yang paling sitotoksik dan berpotensi sebagai antikanker. Metode yang digunakan untuk uji sitotoksik fraksi sama dengan uji sitotoksik pada ekstrak yaitu dengan menggunakan metode MTT Assay. Hasil uji sitotoksisitas masing-masing fraksi dapat dilihat pada Tabel 3.

22 58 Tabel 3. Hasil uji sitotoksisitas fraksi aktif (F - F4) daun sirsak terhadap sel HeLa dan nilai LC 5. Konsentrasi (µg/ml) Presentase kematian (%) F F2 F3 F4 5,625 3,32 2,654 4,735 48,988 3,25 26,94 9,67 39,926 45,232 62,5 3,65 28,929 39,447 2, ,462 28,33 3,229 22, ,55 2,274 23,34 55, ,45 8,286 74,32 99,82 6,923 5,398 4,235, ,582 3,83 2,657 2,6 LC ,2 2,359 5,29 4,98 Tabel 4. Hasil uji sitotoksisitas fraksi aktif (F5 - F8 dan DMSO) daun sirsak terhadap sel HeLa. Konsentrasi (µg/ml) Presentase kematian (%) F5 F6 F7 F8 DMSO 5,625 44,465 7,435 39,823 5,95 46,475 3,25 47,787 46,774 47,7 45,743 4,4 62,5 45,64 39,482 49,54 47,577 44, ,472 5,247 79,982 8,94 4, ,735 99,699 99,725 2,58 4,27 5,749,74 2,399,694 43,329 2,643 4,552 3,94 2,23 38, ,42 3,754 2,43 2,5 35,893 LC 5 2,667,687,957, ,857

23 59 Berdasarkan data tabel di atas dapat diketahui bahwa fraksi yang bersifat sitotoksik yaitu antara fraksi 6, fraksi 7, dan fraksi 8 yang menunjukkan nilai ratarata kematian terbesar (Tabel 3). Nilai presentase kematian ketiga fraksi ini tidak jauh berbeda, hal ini dimungkinkan karena ketiga fraksi ini mempunyai kesamaan kandungan senyawa yang dapat menghambat kematian sel kanker. Seperti terlihat pada Gambar 6, bahwa fraksi 7, 8, dam 9 memiliki kemiripan profil senyawa kimia yang tidak jauh berbeda. Nilai rata-rata presentase kematian setiap fraksi yang diperoleh kemudian dibuat kurva regresi linier untuk menghitung nilai LC 5. Kurva regresi linier dapat dilihat pada Gambar 7 dan 8. mortalitas sel (%) F y = 9.67x R² = Log Konsentrasi mortalitas sel (%) F2 y = 26.7x R² = Log Konsentrasi mortalitas sel (%) F3 y = 33.72x 8.94 R² = Log Konsentrasi mortalitas sel (%) F4 y = 36.5x 2.26 R² = Log Konsentrasi Gambar 7. Grafik hubungan antara presentase kematian dengan log konsenstrasi fraksi aktif (F - F4) daun sirsak (A. muricata L.).

24 6 mortalitas sel (%) F5 y = 34.76x R² = Log Konsentrasi mortalitas sel (%) F6 y = 29.95x R² = Log Konsentrasi mortalitas sel (%) F7 y = 32.74x R² = Log Konsentrasi mortalitas sel (%) F8 y = 32.75x R² = Log Konsentrasi mortalitas sel (%) DMSO y = 3.232x R² = Log Konsentrasi Gambar 8. Grafik hubungan antara presentase kematian dengan log konsenstrasi fraksi aktif (F5 F8 dan DMSO) daun sirsak (A. muricata L.) Pada Gambar 8 dapat dilihat bahwa nilai R² grafik mendekati atau tidak kurang dari,6. Hal ini menunjukkan kedekatan hubungan antara konsentrasi ekstrak yang digunakan dengan presentase kematian sel, sehingga dapat diketahui bahwa kematian sel benar-benar disebabkan oleh perlakuan ekstrak (AOAC,

25 6 22). Hasil perhitungan menunjukkan bahwa nilai LC 5 daun sirsak < 3 µg/ml (Tabel 3) sehingga dapat terlihat bahwa ekstrak daun sirsak memiliki efek sitotoksik dan berpotensi sebagai anti kanker (Meyer et al., 982). Perhitungan lengkap LC 5 dapat dilihat pada Lampiran 9. Berdasarkan perhitungan LC 5 fraksi yang memiliki aktivitas sitotoksik terbesar adalah F6 dengan nilai LC 5 sebesar,687 µg/ml. Penelitian sebelumnya menyatakan bahwa ekstrak etanol dari daun sirsak (A. muricata L.) memiliki aktivitas sitotoksik dalam cell line kanker payudara T47D dengan IC 5 sebesar 7,49 mg/ml dan dapat menginduksi apoptosis. Fraksi etil asetat memiliki potensi terbaik dari sitotoksik diantara fraksi lainnya terhadap cell lines dari kanker payudara T47D dengan nilai IC 5 adalah 3,268 mg/ml (Rachmani et al., 22). Pada penelitian ini, menggunakan sampel yang sama dengan pelarut yang berbeda terbukti memiliki aktivitas sitotoksik pada sel kanker yang berbeda dari penelitian sebelumnya yaitu menggunakan sel HeLa. Pada penelitian Aziza (2) menyatakan bahwa fraksi buah kuning memiliki aktivitas sitotoksik karena memiliki nilai LC 5 < 3 µg/ml. Nilai LC 5 untuk F A (ekstrak wash benzene : eter) sebesar,72 µg/ml, F B (ekstrak wash benzene : etil asetat) sebesar,76 µg/ml, dan Fc (ekstrak metanol) sebesar,35 µg/ml. Senyawa yang terdapat dari daun sirsak, dapat menembus membran sel melalui beberapa mekanisme transport, antara lain difusi pasif, transport terfasilitasi, transport aktif, dan endositosis. Sifat-sifat senyawa yang dapat menembus membran sel secara difusi pasif yaitu relatif larut dalam lemak, ukuran

26 62 partikelnya kecil dan relatif tidak terionisasi. Lemak merupakan senyawa nonpolar sehigga senyawa yang dapat larut dalam lemak juga merupakan senyawa nonpolar (Priyanto, 29). Ekstrak n-heksan yang bersifat nonpolar terbukti merupakan ekstrak yang paling aktif untuk menghambat sel kanker, sehingga dapat diperkirakan ekstrak menembus membran sel melalui difusi pasif. Setelah senyawa menembus membran sel, senyawa tersebut akan mampu mencapai sitoplasma dan menuju organel target. Struktur utama membran sel terdiri dari phospholipids bi layer, yaitu fosfat sebagai kepala yang bersifat polar dan asam lemak sebagai ekor yang bersifat nonpolar. Adanya perbedaan polaritas menyebabkan membran sel bersifat selektif permeabel sehingga hanya dapat dilewati senyawa tertentu (Rahman et al., 2). Senyawa obat yang telah melewati membran sel kemudian masuk ke sitoplasma dan berinteraksi dengan sel kanker yang menyebabkan kematian sel. Kematian sel dapat terjadi melalui dua mekanisme yaitu apoptosis dan nekrosis. Apoptosis ditandai dengan munculnya badan-badan apoptosis pada pengamatan dengan metode imunohistokimia. Nekrosis merupakan proses kerusakan sel yang ditandai dengan bertambahnya volume sel dan biasanya diikuti respon inflamasi (Nursid et al., 26). E. Deteksi Kandungan Senyawa Fraksi Teraktif Berikut adalah hasil deteksi kandungan senyawa fraksi teraktif dengan metode KLT. Profil KLT ekstrak n-heksan dengan berbagai profil kandungan senyawa dapat dilihat pada Gambar 9.

27 perpustakaan.uns.ac.id 63 Rf Rf,75,75,5,5,25,25 Rf UV366 UV254,75,5, Gambar 9. Profil kromatogram fraksi 6 daun sirsak dengan berbagai pereaksi semprot. Keterangan: () dragendroff, (2) KOH etanolik, (3) AlCl3, (4) asam sulfat 3%, (5) anisaldehid asam sulfat, (6) Lieberman burchad, (7) Feriklorid 5% dalam HCl, N, dan (8) Vanilin sulfat. Fase diam : Silika gel 6 GF254 Fase gerak : n-heksana:etil asetat 7:3 (v/v) Jarak pengembangan : 8 cm Hasil uji KLT fraksi 6 dengan deteksi sinar tampak (visibel) yang telah disemprot dan sinar UV secara spesifik disajikan pada Tabel 5.

28 64 Tabel 5. Hasil uji KLT fraksi teraktif ( 4) dengan berbagai pereaksi semprot. Rf Penampak Bercak UV 254 UV ,37 Peredaman berpendar Coklat (-) - Coklat (-) Coklat (-),47 Hijau Berpendar - Coklat (-) - -,75 Peredaman Berpendar ,87 Peredaman Berpendar ,94 Peredaman Berpendar Tabel 6. Hasil uji KLT fraksi teraktif (5 6) dengan berbagai pereaksi semprot Rf Penampak Bercak UV 254 UV ,37 Peredaman berpendar ,47 Hijau Berpendar , Coklat (+) - -, Coklat (+) - Merah muda (+),75 Peredaman Berpendar ,87 Peredaman Berpendar ,94 Peredaman Berpendar - - -, Merah muda (+) Merah muda (+) Keterangan: () dragendroff, (2) KOH etanolik, (3) AlCl 3, (4) asam sulfat 3%, (5) anisaldehid asam sulfat, (6) Lieberman burchad, (7) Feriklorid 5% dalam HCl, N, dan (8) Vanilin sulfat.

29 65 Hasil dari KLT menunjukkan bahwa F6 memiliki kandungan senyawa steroid karena pada Gambar 2.6 terlihat adanya bercak berwarna coklat pada Rf,59 dan,72. Menurut Wagner (984), suatu sampel dinyatakan positif memiliki senyawa steroid apabila hasil kromatogramnya menampakkan bercak berwarna coklat. Selain steroid, F6 juga terdeteksi adanya kandungan senyawa terpenoid karena terlihat adanya bercak berwarna merah muda pada Rf,72,,94, dan,97 (Gambar 2.8). Menurut Wagner and Bladt (996), terpenoid akan memberikan warna merah muda apabila diamati pada sinar visible. Senyawa terpenoid dapat pula memblok siklus sel pada fase G2/M dengan menstabilkan benang-benang spindle pada fase mitosis sehingga proses mitosis dapat terhambat. Terpenoid juga dapat memicu apoptosis melalui mekanisme inhibisi enzim topoisomerase (Sugianto dkk., 23). Salah satu golongan terpenoid yaitu monoterpen, dilaporkan memiliki aktivitas antitumor, salah satu diantaranya yaitu limonene. Senyawa ini mempunyai kemampuan kemoprevensi pada beberapa tipe sel kanker. Mekanisme aksi dari monoterpenoid yaitu dengan cara memblok dan menekan aktivitas antitumor (Crowell, 999). Contoh lainnya seperti taxol yang merupakan senyawa golongan diterpen dari tanaman Taxus brevifolia yang telah digunakan secara luas untuk pengobatan kanker serviks dan kanker payudara. Mekanisme aksi antikanker taxol yaitu dengan cara menstabilkan tubulin sehingga mencegah terjadinya pembelahan sel (Artanti et al., 25). Taxol diketahui dapat menghambat mitosis dengan cara menyebabkan kerusakan pada mikrotubul, karena menghalangi terbentuknya mikrotubul sehingga akan terjadi pengeblokan pada proses mitosis (Lesney,

30 66 24). Steroid bekerja dengan menghambat kerja enzim DNA topoisomerasie. Enzim itu berperan dalam proses replikasi dan proliferasi sel kanker (Harfia, 26). Beberapa literatur menyebutkan bahwa kandungan acetogenins dalam Annona muricata memiliki efek kuratif terhadap sel kanker melalui mekanisme inhibisi kompleks I mitokondria yang akan mengganggu proses transfer elektron. Inhibisi kompleks I mitokondria oleh Acetogenins akan menyebabkan menurunnya produksi ATP. Penurunan jumlah ATP tersebut justru akan menginduksi terjadinya apoptosis (Bri ere et al., 29; Apte et al., 29). Selain itu hipoksia akibat penurunan produksi ATP juga dapat mengaktifkan p53, suatu tumor supressor genes, yang menyebabkan terhentinya siklus sel pada fase G sehingga dapat mencegah proliferasi sel yang berlebihan (Gonzalez et al., 29).