RESPONSIVITAS DAN KAPASITAS ANDROGENESIS BEBERAPA GENOTIPE CABAI DAN TERONG DALAM KULTUR ANTERA PADA MEDIA DUA-LAPIS SANDI YUDA PRATAMA

Transkripsi

1 RESPONSIVITAS DAN KAPASITAS ANDROGENESIS BEBERAPA GENOTIPE CABAI DAN TERONG DALAM KULTUR ANTERA PADA MEDIA DUA-LAPIS SANDI YUDA PRATAMA DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 215

2

3 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Responsivitas dan Kapasitas Androgenesis Beberapa Genotipe Cabai dan Terong dalam Kultur Antera pada Media Dua-Lapis adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor dan PT BISI Internasional, Tbk. Bogor, Desember 214 Sandi Yuda Pratama NIM G34192 * Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait.

4

5 ABSTRAK SANDI YUDA PRATAMA. Responsivitas dan Kapasitas Androgenesis Beberapa Genotipe Cabai dan Terong dalam Kultur Antera pada Media Dua-Lapis. Dibimbing oleh ENCE DARMO JAYA SUPENA dan DIAN CATUR PRAYANTINI. Produktivitas cabai (Capsicum annuum L) dan terong (Solanum melongena L) dapat ditingkatkan melalui penggunaan benih berkualitas, seperti benih hibrida. Pengembangan benih hibrida memerlukan tetua-tetua berupa galur murni yang pembetukannya dapat dilakukan dengan cepat menggunakan kultur antera. Tujuan penelitian adalah menguji penerapan teknik kultur antera dengan sistem media dua-lapis yang sudah dikembangkan untuk cabai (metode cabai) dan tembakau (metode tembakau) untuk beberapa genotipe cabai dan terong. Sistem media dualapis adalah mengkulturkan antera pada media cair di atas media padat dan diinkubasi pada kondisi tertentu. Hasil pengujian adalah bahwa metode cabai berhasil menginduksi androgenesis ketiga jenis tanaman yang diuji yaitu semua genotipe cabai, terong var Antaboga, dan tembakau SR1, sedangkan metode tembakau hanya berhasil untuk tanaman tembakau SR1. Responsivitas androgenesis untuk genotipe yang dicoba adalah cabai besar var Tombak (77 %), cabai besar China (67 %), cabai keriting-1 (21 %), cabai keriting-2 (1 %), dan terong var Antaboga (7 %). Jumlah embrio total yang dihasilkan per kuncup untuk masing-masing genotipe cabai tersebut secara berurutan adalah 5.7, 1.7,.3, dan.5, serta.2 embrio per kuncup untuk terong var Antaboga. Hasil analisis ploidi salah satu tanaman hasil kultur antera untuk cabai keriting adalah haploid dan terong adalah mixoploid yang keduanya membuktikan hasil proses androgenesis. Kultur antera pada media dua-lapis metode cabai ini berpotensi untuk diujikan pada anggota genus Solanum lainnya, seperti tomat yang masih tergolong sulit untuk induksi androgenesisnya. Kata kunci: kultur antera, media dua-lapis, cabai, tembakau, terong.

6 ABSTRACT SANDI YUDA PRATAMA. Androgenic Responsiveness and Capacity on Several Genotypes of Pepper and Eggplant in Anther Culture at Double-Layered Medium. Under supervision of ENCE DARMO JAYA SUPENA and DIAN CATUR PRAYANTINI. Productivity of hot pepper (Capsicum annuum L) and eggplant (Solanum melongena L) can be improved through the use of good quality seeds, such as hybrid seeds. Development of hybrid seed requires parental in the form of a pure lines, which is can be produced quickly using anther culture. The purpose of the study was to test the application of anther culture technique with a double-layered medium system that has been developed in hot pepper (pepper method) and tobacco (tobacco method) for several genotypes of hot pepper and eggplant. A double-layered medium system was culturing anther in liquid medium above the solid medium and incubated under certain condition. The result was that the pepper method successfully induced androgenesis for three types of plant that were all genotypes of pepper, eggplant var Antaboga, and tobacco SR1, while tobacco method was only successful for tobacco SR1. Androgenic responsiveness for genotypes tested was big hot pepper var Tombak (77 %), China big hot pepper (67 %), curly type-1 hot pepper (21 %), curly type-2 hot pepper (1 %), and eggplant var Antaboga (7 %). The result of total embryos per bud for each genotype of pepper was 5.7, 1.7,.3, and.5, respectively. Total embryos for eggplant var Antaboga was.2 embryos per bud. The result of ploidy analysis at one anther culture derived plant for curly hot pepper was haploid and eggplant was mixoploid that both proved the androgenesis process. This method of anther culture with pepper method has the potential to be tested on other members of genus Solanum, such as tomato which still quite difficult to induce its androgenesis. Key words: anther culture, double-layered medium, pepper, tobacco, eggplant.

7 RESPONSIVITAS DAN KAPASITAS ANDROGENESIS BEBERAPA GENOTIPE CABAI DAN TERONG DALAM KULTUR ANTERA PADA MEDIA DUA-LAPIS SANDI YUDA PRATAMA Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 215

8

9

10

11 PRAKATA Alhamdulillah, segala puji bagi Allah, yang karena-nya penulis dapat menyelesaikan tugas akhir ini dengan mudah. Keselamatan, semoga terlimpahkan bagi manusia yang terbaik di Dunia, Nabi terakhir, Muhammad bin Abdullah. Berkat hidayah dari Allah kemudian petunjuk dari Nabi Muhammad, hidup ini menjadi teratur dan bahagia. Semoga Allah memberikan kelapangan urusan bagi setiap orang yang berpegang teguh pada agama-nya. Bangsa Indonesia adalah bangsa yang terkaya di Dunia. Akan tetapi potensi kekayaannya itu belum seluruhnya dimanfaatkan. Salah satu potensi tersebut adalah melimpah-ruahnya tanaman hortikultura, terutama kelompok Solanacea. Skripsi ini yang berjudul, Responsivitas dan Kapasitas Androgenesis Beberapa Genotipe Cabai dan Terong dalam Kultur Antera pada Media Dua-Lapis, merupakan sebuah pendekatan teknologi dalam usaha meningkatkan kualitas dan produktivitas tanaman hortikultura yang berbasis pada pengembangan kultivar lokal. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Ir Ence Darmo Jaya Supena, MSi atas perhatian dan bimbingannya, dan juga kepada Ibu Dian Catur Prayantini, MSc. Terima kasih juga kepada dosen penguji karya ilmiah yaitu Ir Tri Heru Widarto, MSc. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada teman diskusi, Mas Bambang Sujatmiko, MSc, atas ilmunya, Mba Tari atas pengalamannya, Mas Nurdin, Mba Ida, dan Mas Dhike. Ucapan terima kasih takkan terlewatkan kepada guru, teman sekaligus lawan yaitu kepada Doni, Fauzi, dan Lutfi atas semuanya, kalian adalah peneliti terbaik dan berpengalaman. Penulis mengucapkan terima kasih juga kepada Dr Rudi, Dr Sigit, Mas Nana, Deni, Pak Ririt, Mba Kiki, Ririn, Lili, Ridwan, Margo, Rofiq, Pak Salam, Mas Chandra, dan seluruh warga BISI. Kepada Ibu Lasmi yang rajin, terima kasih ibu. Kepada para satpam BISI Tulungrejo, Pak Adi, Mas Yanto dan lainnya, terima kasih atas pintu gerbangnya yang selalu terbuka. Terakhir kepada Pak Jan, yang selalu setia menemani setiap perjalanan. Kepada teman-teman Biologi angkatan 47, dan seluruh sivitas akademika IPB, baik dalam maupun lingkar luar kampus. Rasa terima kasih ini tidak akan hilang selamanya untuk disematkan yakni kepada Ayahku dan Ibuku yang tercinta, semoga Allah mencintai kalian. Kepada para keluarga besarku, Adik-adikku, terima kasih atas doa yang kalian panjatkan selama ini. Tidak ada senjata yang paling ampuh, tidak ada metode yang paling responsif selain Do a. Semua hal yang terdapat pada penelitian ini adalah atas kehendak Allah Azza wa Jalla. Sandi Yuda Pratama Desember 214

12

13 DAFTAR ISI DAFTAR TABEL x DAFTAR GAMBAR x DAFTAR LAMPIRAN x PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Tujuan Penelitian 2 BAHAN DAN METODE 2 Waktu dan Tempat 2 Bahan dan Alat 2 Metode Penelitian 2 Pengamatan Stadia Mikrospora atau Polen 2 Pembuatan Media Dua-Lapis 3 Praperlakuan Kuncup Bunga dan Isolasi Antera 3 Kultur Antera dalam Sistem Media Dua-Lapis 3 Perkecambahan dan Pertumbuhan Tanaman 4 Analisis Ploidi 4 Pengamatan dan Pengolahan Data 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 5 Hasil 5 Hubungan Morfologi Kuncup Bunga dan Antera dengan Perkembangan Mikrospora 5 Androgenesis Beberapa Genotipe Cabai dengan Metode Cabai 6 Responsivitas dan Kapasitas Androgenesis Beberapa Genotipe Terong 8 Pembahasan 1 SIMPULAN DAN SARAN 12 Simpulan 12 Saran 12 DAFTAR PUSTAKA 12 LAMPIRAN 14

14 DAFTAR TABEL 1 Tahap perkembangan mikrospora pada beberapa fase perkembangan kuncup bunga 5 2 Responsivitas dan kapasitas androgenesis beberapa genotipe cabai (Capsicum annuum) pada metode cabai 6 3 Responsivitas dan kapasitas androgenesis beberapa genotipe terong dalam metode cabai dan tembakau 8 DAFTAR GAMBAR 1 Perkembangan embrio beberapa genotipe cabai setelah tujuh sampai delapan minggu kultur pada sistem media dua-lapis (metode cabai) 6 2 Perkecambahan dan beberapa tanaman hasil kultur antera cabai 7 3 Analisis ploidi tanaman cabai keriting hasil kultur antera dengan flow cytometry 7 4 Perkembangan embrio pada tanaman terong hasil kultur antera 9 5 Analisis ploidi tanaman terong hasil kultur antera dengan flow cytometry 9 DAFTAR LAMPIRAN 1 Komposisi media untuk metode cabai dan tembakau 14 2 Deskripsi beberapa genotipe tanaman yang digunakan pada percobaan 15

15 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Solanaceae memiliki 85 genus yang terdiri lebih dari 22 spesies. Lima spesies diantaranya populer ditanam oleh petani di Indonesia dan memiliki nilai ekonomis yang tinggi yaitu: cabai (Capsicum annuum L), tomat (Solanum esculentum), terong (Solanum melongena L), kentang (Solanum tuberosum L), dan tembakau (Nicotiana tabacum L) (Bhattacharyya dan Johri 1998). Produktivitas cabai dan terong pada tahun 212 masing-masing sebesar 6.84 ton/ha dan 1.29 ton/ha. Produktivitas cabai ini masih lebih rendah dibandingkan produktivitas negara lain di Asia seperti China (22.59 ton/ha), India (8.5 ton/ha), dan Thailand (13.33 ton/ha). Begitu juga yang terjadi pada terong, produktivitasnya masih tertinggal dari China (35.97 ton/ha), India (17.43 ton/ha), dan Thailand (15.65 ton/ha) (FAOSTAT 214). Oleh karena itu, diperlukan adanya usaha untuk meningkatkan produktivitas cabai dan terong di Indonesia. Produktivitas tanaman, termasuk untuk Solanaceae dapat ditingkatkan melalui beberapa cara, diantaranya dengan menggunakan benih berkualitas yang berdaya hasil tinggi, contohnya benih hibrida. Pengembangan dan pembentukan benih hibrida memerlukan galur murni sebagai tetua. Proses pembentukan galur murni secara konvensional melalui penyerbukan sendiri terkendali memerlukan 6 sampai 1 generasi. Oleh karena itu, perlu dikembangkan teknik yang lebih cepat untuk menghasilkan galur murni. Teknik kultur antera merupakan cara yang tepat karena hanya membutuhkan 1 sampai 2 generasi untuk menghasilkan galur murni, yaitu dengan jalan memproduksi tanaman haploid atau haploid ganda (Evans et al. 23). Produksi tanaman haploid dan haploid ganda melalui induksi androgenesis (embriogenesis dari mikrospora) dapat dilakukan dengan teknik kultur antera pada media padat ataupun kultur isolasi mikrospora pada media cair (Evans et al. 23). Supena et al. (26) telah berhasil mengembangkan teknik kultur antera dengan sistem media dua-lapis untuk tanaman cabai besar dan cabai keriting Indonesia. Johansson et al. (1982) juga telah berhasil mengembangkan teknik tersebut untuk tanaman tembakau. Metode Supena et al. (26) juga telah berhasil diterapkan untuk tanaman cabai paprika (Parra-Vega et al. 212). Supena et al. (26) telah membandingkan ketiga metode induksi androgenesis yaitu kultur antera pada media padat, kultur isolasi mikrospora pada media cair, dan kultur antera pada media dua-lapis yang hasilnya adalah bahwa kultur antera pada media dua-lapis lebih efisien pada cabai lokal Indonesia. Metode kultur antera pada media dua-lapis ini belum pernah dicobakan dan dikembangkan untuk tanaman terong. Induksi androgenesis pada tanaman terong telah berhasil dilakukan melalui kultur antera pada media padat meskipun belum efisien (Salas et al. 211). Terong termasuk tanaman yang sulit (rekalsitran) dalam induksi androgenesis, lebih sulit dari cabai, namun lebih mudah dari tomat (Segui-Simarro et al. 211). Salas et al. (211) menyatakan bahwa induksi androgenesis pada terong sangat dipengaruhi oleh genotipenya.

16 2 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan menguji teknik kultur antera dengan sistem media dua-lapis yang sudah dikembangkan untuk tanaman cabai (Supena et al. 26) dan tembakau (Johansson et al. 1982) pada beberapa genotipe tanaman cabai dan terong untuk mengetahui responsivitas dan kapasitas androgenesisnya. BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Kegiatan penelitian dilakukan mulai awal bulan Februari 214 sampai dengan awal bulan Juli 214. Pertanaman tanaman sumber kuncup bunga dilaksanakan di rumah kaca (green house) PT BISI Internasional, Tbk mulai bulan November 213, sedangkan kultur in vitro dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman, PT BISI Internasional, Tbk di Pare, Kab Kediri. Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan adalah genotipe cabai besar var Tombak (penyerbukan terbuka (OP)) (kontrol), cabai besar Galaxy (OP), cabai besar China, cabai keriting dataran tinggi (Hibrida) var Keriting-1 dan Keriting-2 (ukuran buah lebih kecil daripada keriting-1) yang semuanya termasuk spesies Capsicum annuum L; terong (Solanum melongena L) var Antaboga, Ratih Ungu, dan F yang masing-masing varietas hibrida milik PT BISI Internasional, Tbk; serta tembakau SR1 (Nicotiana tabacum L) (kontrol). Bahan kimia yang digunakan antara lain media dasar Nitsch (Nitsch dan Nitsch 1969), media dasar MS (Murashige dan Skoog 1962), maltosa, sukrosa, arang aktif, agar gelrite, Plant Agar dan pewarna 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Alat-alat yang digunakan diantaranya mikroskop epifluoresens (Olympus BX 53) dengan UV filter, mikroskop cahaya, laminar air flow cabinet, flow cytometry, dan peralatan standar laboratorium kultur jaringan. Metode Penelitian Pengamatan Stadia Mikrospora atau Polen Penentuan stadium perkembangan kuncup bunga, antera, dan mikrospora untuk sumber eksplan tanaman cabai mengacu pada hasil Supena et al. (26), untuk tanaman tembakau mengacu pada stadia perkembangan panjang kuncup yang diukur dari bagian dasar bunga hingga ujung kelopak, dan untuk terong dari bagian tangkai bunga hingga ujung mahkota. Pengamatan untuk menentukan tahapan perkembangan mikrospora pada cabai menggunakan genotipe Galaxy, terong menggunakan genotipe Ratih Ungu, dan tembakau menggunakan genotipe SR1. Ketiga tanaman ini selanjutnya menjadi standar penentuan mikrospora untuk kultur antera pada masing-masing jenis tanaman lainnya. Antera dari kuncup

17 3 bunga diisolasi dan digerus di dalam larutan B-medium atau Arumuganathan yang ditambah Triton X-1 dan gliserin. Selanjutnya, mikrospora disaring menggunakan saringan (4 µm) dan dilarutkan kembali di dalam larutan yang sama. Mikrospora yang terlarut diendapkan dengan sentrifuse pada kecepatan 4 rpm selama 4 menit pada suhu ruang. Pelet yang terbentuk diwarnai dengan 1 µg/ml DAPI yang ditambahkan pada larutan Arumuganathan yang ditambah gliserin. Fase perkembangan mikrospora diamati di bawah mikroskop epifluoresens dengan filter UV. Fase perkembangan mikrospora yang diidentifikasi, yaitu tetrad, uninukleat awal, uninukleat tengah, uninukleat akhir, binukleat awal, binukleat tengah, binukleat akhir, dan polen matang. Stadia kuncup yang mengandung mikrospora fase uninukleat akhir di atas 5 % digunakan dalam percobaan ini. Pembuatan Media Dua-Lapis Komposisi media padat dan media cair akan dijelaskan lebih lanjut pada sub-bab berikutnya. Komposisi media yang digunakan pada penelitian ini disajikan pada tabel lampiran 1. Pembuatan media dua-lapis diawali dengan pembuatan media padat sebanyak 3 ml pada bagian bawah cawan petri (6x15 mm), kemudian media padat ditambahkan media cair sebanyak 3 ml. Untuk mencegah kontaminasi digunakan kombinasi antibiotik rifampisin (2 mg/l) dan timentin (1 mg/l). Praperlakuan kuncup bunga dan isolasi antera Kuncup bunga diberi pra-perlakuan suhu dingin (suhu 4 o C selama satu hari atau 9 o C selama tujuh hari). Kuncup bunga didesinfeksi selama 1-2 menit dalam etanol 7 %, kemudian dibilas 1 kali dalam akuades steril. Desinfeksi dilanjutkan dalam NaOCl 1.3 % dengan penambahan Tween-2.5 % (v/v) selama ± 1 menit, kemudian dibilas 3 kali dalam akuades steril secara bertahap masingmasing ± 3 menit. Proses isolasi antera dari kuncup bunga yang sudah disterilisasi dilakukan dengan cara mengelupas kelopak dan mahkota terlebih dahulu. Antera dikulturkan pada media sesuai perlakuan atau kebutuhan dengan sistem dua-lapis. Di setiap cawan petri dikulturkan seluruh antera yang berasal dari satu buah kuncup bunga. Kultur Antera dalam Sistem Media Dua-Lapis Kultur antera sistem media dua-lapis yang digunakan dan menjadi perlakuan adalah dua jenis metode, yaitu Metode Cabai dan Metode Tembakau: 1 Metode Cabai. Metode Cabai yang digunakan pada penelitian ini adalah hasil penelitian kultur antera cabai yang dikembangkan oleh Supena et al. (26). Metode ini menggunakan media padat pada lapisan bawah yang mengandung komponen Nitsch (Nitsch dan Nitsch 1969) dan maltosa 2 g/l dengan penambahan arang aktif 1 g/l, dan agar gelrite 2 g/l. Lapisan atas berupa media cair dengan komponen sama seperti pada media padat, kecuali tanpa arang aktif dan agar. Media diatur pada ph 5.8 sebelum proses sterilisasi. Kuncup bunga diberi perlakuan suhu 4 o C selama satu hari (dalam kondisi

18 4 gelap). Kuncup bunga selanjutnya disterilisasi, dan antera diisolasi dan dikulturkan. Kultur diinkubasi pada suhu 9 o C selama satu minggu pertama (dalam kondisi gelap) dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 28 o C (dalam kondisi gelap). 2 Metode Tembakau. Metode Tembakau yang digunakan pada penelitian ini adalah kultur antera tembakau menurut Johansson et al. (1982) yang dimodifikasi Custers et al. (1999). Metode ini menggunakan media padat pada lapisan bawah yang mengandung media ½MS (Murashige dan Skoog 1962) dengan sukrosa 2 g/l, arang aktif 5 g/l, dan plant agar 6 g/l. Lapisan atas berupa media cair dengan komponen sama seperti pada media padat, kecuali tanpa arang aktif dan agar. Media diatur pada ph 6. sebelum proses sterilisasi. Kuncup bunga diberi perlakuan suhu dingin 9 o C selama tujuh hari (dalam kondisi gelap). Kuncup bunga selanjutnya disterilisasi, dan antera diisolasi dan dikulturkan. Kultur selanjutnya disimpan pada suhu 25 o C (dalam kondisi gelap). Perkecambahan dan Pertumbuhan Tanaman Embrio yang terbentuk dalam masa inkubasi dipanen pada 7-8 minggu setelah kultur untuk selanjutnya dikecambahkan. Embrio dikecambahkan di dalam medium yang mengandung ½MS, sukrosa 2 g/l dan 6-benzylaminopurin (BA).2 g/l, dipadatkan dengan gelrite 2 g/l. Perkecambahan diinkubasi pada suhu o C dengan pencahayaan selama 16 jam. Bibit yang telah berdaun 4-5 helai dan memiliki perakaran yang baik dipindahkan ke dalam botol kaca dengan media kokopit yang dilembabkan dengan media ½MS. Tanaman pada stadium berdaun 5-6 helai siap diaklimatisasi di dalam pot di rumah kaca. Analisis Ploidi Daun dipotong dari planlet atau tanaman hasil kultur antera dan tanaman kontrol, kemudian daun dicacah dengan silet atau scalpel (di dalam larutan Arumaganathan sebanyak 5 µl). Hasil cacahan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dengan saringan (4 µm) dan ditambahkan 1 µg/l DAPI yang dicampurkan dalam Arumuganathan (vol 5 µl). Tabung diinkubasi selama ± 3 menit di dalam ice box. Setelah itu, sampel di-running pada flow cytometer (Attune Acoustic focusing cytometter). Hasil running sampel dianalisis menggunakan Attune Cytometric Software. Pengamatan dan Pengolahan Data Perkembangan kultur diamati setiap minggu. Setelah kultur berumur 7-8 minggu, embrio yang terbentuk diamati dan dihitung. Embrio dikelompokkan ke dalam dua kategori yaitu embrio lengkap dan embrio tidak lengkap. Embrio lengkap merupakan embrio yang memiliki radikula, hipokotil, dan kotiledon, sedangkan embrio tidak lengkap adalah embrio yang tidak mempunyai kotiledon. Data hasil pengamatan kultur antera selanjutnya dihitung responsivitas androgenesisnya (persentase kuncup bunga yang menghasilkan embrio), dan jumlah embrio yang dihasilkan untuk menggambarkan kapasitas androgenesisnya, serta dihitung persentase embrio lengkap yang terbentuk.

19 5 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Hubungan Morfologi Kuncup Bunga dan Antera dengan Perkembangan Mikrospora Hasil pengamatan stadia mikrospora tanaman model cabai Galaxy menunjukkan bahwa persentase mikrospora pada stadia uninukleat akhir di atas 5 % adalah ketika terdapat warna ungu pada antera di ujung sampai dengan pertengahan antera (Tabel 1). Kriteria antera tersebut dapat diperoleh dari kuncup bunga ketika ukuran mahkota lebih panjang sedikit daripada kelopaknya. Penentuan stadia mikrospora pada terong dan tembakau menggunakan interval panjang kuncup bunga. Kuncup bunga terong dengan panjang mm memiliki persentase mikrospora uninukleat akhir sebesar %. Untuk tembakau, pada panjang kuncup bunga 12 mm memiliki persentase stadia uninukleat akhir berkisar 53.3 % (Tabel 1). Tabel 1 Tahapan perkembangan mikrospora pada beberapa fase perkembangan kuncup bunga Genotipe Cabai besar var Galaxy Terong var Ratih Ungu Tembakau SR1 Penciri Warna ungu pada antera : a. Belum ada b. Hanya di ujung c. Sekitar ¼ panjang d. Sekitar ½ panjang e. Seluruh bagian Ukuran kuncup bunga : a. 12 mm b. 15 mm c. 16 mm d. 18 mm Ukuran kuncup bunga : a. 1 mm b. 12 mm c. 15 mm Fase Perkembangan Mikrospora (%) TE UA UT UK BA BT PM Keterangan : TE = tetrad, UA = uninukleat akhir, UT = uninukleat tengah, UK = uninukleat akhir, BA = binukleat awal, BT = binukleat tengah, PM = polen matang.

20 6 Androgenesis Beberapa Genotipe Cabai dengan Metode Cabai Hasil kultur antera menggunakan sistem media dua-lapis Metode Cabai menunjukkan bahwa semua genotipe cabai yang dicobakan, yaitu genotipe model (kontrol) Tombak, cabai besar China, Keriting-1, dan Keriting-2, mampu diinduksi proses androgenesisnya (Gambar 1). Tingkat responsivitas androgenesis terbesar dimiliki oleh Tombak sebesar 77 %, sedangkan yang terendah dimiliki Keriting-2 sebesar 1 % (Tabel 2). Gambar 1 Perkembangan embrio beberapa genotipe cabai setelah tujuh sampai delapan minggu kultur pada sistem media dua-lapis (metode cabai). a. Tombak; b. cabai besar China; c. Keriting-1; d. Keriting-2. Karakter-karakter embrio: el (embrio lengkap); et (embrio tidak lengkap); eb (embrio yang telah berkecambah). Garis skala: a-d = ± 3 mm. Tabel 2 Responsivitas dan kapasitas androgenesis beberapa genotipe cabai (Capsicum annuum) pada metode cabai Genotipe Tombak 1 Cabai Besar China Keriting-1 2 Keriting-2 3 Jumlah kultur (petri) Kultur terjadi respon androgenesis (%) Jumlah embrio total seluruh kultur Jumlah embrio total per kuncup Embrio lengkap (%) Keterangan : Jumlah kultur adalah jumlah kultur yang bebas dari kontaminasi. Jumlah kultur awal adalah 3 petri dari tiga periode ulangan. 1 = cabai besar (kontrol); 2,3 = cabai keriting hibrida (F1) tipe dataran tinggi; 4 = 1 kuncup bunga (5-6 antera) per petri

21 7 Embrio cabai Tombak, Keriting-1, Keriting-2 yang berhasil dikecambahkan (Gambar 2a,c-d), sedangkan cabai besar China kotiledonnya saling menempel dan tanamannya tidak dapat berkembang (Gambar 2b). Gambar 2 Perkecambahan dan beberapa tanaman hasil kultur antera cabai. a. Tombak; b. cabai besar China (kotiledon saling menempel); c. Keriting-1; d. Keriting-2; e. Tombak. Umur kultur (dari awal kultur) : a,b = ± 1 minggu, c = ± 11 minggu, d = ± 8 minggu, e = ± 12 minggu. Garis skala : a-e = ± 1 cm Analisis ploidi dilakukan pada tanaman kontrol (cabai besar yang ditanam dari biji) dan salah satu tanaman cabai keriting hasil kultur antera. Tanaman kontrol menunjukkan diploid (2C) dan fase G2 diploid (4C) (Gambar 3a). Tanaman cabai keriting hasil kultur antera menunjukkan haploid (C) dan fase G2 haploid (2C) (Gambar 3b). Hasil ini menguatkan bahwa tanaman hasil kultur antera berasal dari mikrospora yang memiliki jumlah kromosom haploid (n). Gambar 3 Analisis ploidi tanaman cabai keriting hasil kultur antera dengan Flow cytometery. a. diploid untuk tanaman kontrol; b. haploid untuk tanaman hasil kultur antera. ket : C = haploid, 2C = diploid atau fase G2 haploid, 4C = fase G2 diploid.

22 8 Responsivitas dan Kapasitas Androgenesis Beberapa Genotipe Terong Penggunaan metode cabai dan metode tembakau telah berhasil menginduksi androgenesis pada tanaman kontrol tembakau SR1. Metode cabai juga telah berhasil menginduksi androgenesis pada tanaman kontrol cabai besar var Tombak, sedangkan metode tembakau tidak berhasil menginduksi androgenesis pada cabai (Tabel 3). Hal ini menunjukkan bahwa metode cabai lebih tepat untuk induksi androgenesis tanaman cabai daripada metode tembakau. Pada tanaman terong yang dicobakan, respon androgenesis hanya terjadi pada genotipe Antaboga yang dikulturkan menggunakan metode cabai. Tingkat responsivitas androgenesis pada terong Antaboga masih tergolong rendah yaitu 7 % (1 dari 14 kultur), karena masih jauh di bawah persentase androgenesis pada kontrol (cabai dan tembakau) (Tabel 3). Sedangkan, pada metode tembakau, ketiga genotipe terong tidak menunjukkan respon androgenesis (Tabel 3). Tabel 3 Responsivitas dan kapasitas androgenesis beberapa genotipe terong dalam metode cabai dan tembakau Metode Cabai Tembakau Genotipe Tembakau (SR1) a Cabai (Tombak) b Terong Antaboga Terong Ratih Ungu Terong F Tembakau (SR1) a Cabai (Tombak) b Terong Antaboga Terong Ratih Ungu Terong F Jumlah kultur (petri) Kultur terjadi respon androgenesis (%) Jumlah embrio total seluruh kultur td 74 3 td Jumlah embrio lengkap Keterangan : Jumlah kultur adalah jumlah kultur yang bebas dari kontaminasi. Jumlah kultur awal adalah 3 petri dari tiga periode ulangan. td = tidak dihitung (pada umumnya jumlah embrio tembakau lebih banyak daripada cabai Tombak dan hampir 1 % embrio lengkap); a,b = tanaman kontrol untuk metode yang dicobakan. Ketika umur kultur memasuki minggu kedelapan, embrio yang muncul pada antera dapat dilihat dengan jelas (Gambar 4a) dan setelah diisolasi terlihat ketiga embrio termasuk embrio lengkap (Gambar 4b). Ketiga embrio tersebut setelah dipindahkan pada media regenerasi dan berhasil berkecambah pada waktu satu minggu (Gambar 4c). Hasil perkecambahan semakin menguatkan bahwa ketiga embrio tersebut adalah lengkap. Tanaman dipindahkan pada media praaklimatisasi setelah muncul 6-7 daun dan sistem perakaran baik (Gambar 4d). Tanaman siap diaklimatisasi di rumah kaca setelah muncul 7-8 daun dan sistem perakaran semakin membaik (Gambar 4e) td 13 3 td

23 9 Gambar 4 Perkembangan embrio pada tanaman terong hasil kultur antera. a. embrio berdekatan dan menempel pada antera; b. embrio setelah diisolasi dan ketiganya lengkap; c. perkecambahan embrio; d. praaklimatisasi; e. aklimatisasi di rumah kaca. Umur kultur (dari awal kultur) : a,b = ± 8 minggu, c = ± 9 minggu, d = ± 13 minggu, e = ± 16 minggu. Garis skala : a,b = ± 5 mm, c-e = ± 1 cm Analisis ploidi dilakukan pada salah satu tanaman terong hasil kultur antera. Kontrol tanaman terong yang berasal dari biji menunjukkan diploid (2C) dan fase G2 diploid (4C) (Gambar 5a). Tanaman terong hasil kultur antera menunjukkan mixoploid (C+2C), yakni terdapat sebagian kecil sel haploid (C) dan sebagian besar sel diploid (2C) (Gambar 5b). Hal ini menguatkan bahwa tanaman hasil kultur antera berasal dari mikrospora yang memiliki jumlah kromosom haploid (n). Gambar 5 Analisis ploidi tanaman terong hasil kultur antera dengan flow cytometry. a. diploid untuk tanaman donor (kontrol); b. mixoploid untuk tanaman hasil kultur antera. ket : C = haploid, 2C = diploid atau fase G2 haploid, 4C = fase G2 diploid.

24 1 Pembahasan Hasil pengamatan mikrospora pada tanaman cabai model Galaxy menunjukkan bahwa stadia mikrospora uninukleat akhir dengan persentase lebih dari 5 %, yaitu ketika antera berwarna hijau kekuningan dengan terdapat warna ungu pada ujungnya sampai ½ bagian antera (Tabel 1). Hasil ini sesuai dengan yang dilaporkan Supena et al. (26), bahwa antera dengan warna ungu di ujungnya memiliki stadia mikrospora uninukleat akhir lebih dari 5 %. Hal yang sama dilaporkan oleh Kim et al. (24) bahwa antera dengan ½ bagian berwarna ungu memiliki stadia mikrospora uninukleat akhir lebih dari 5 %. Ciri penentu morfologi bunga ini selanjutnya digunakan pada genotipe cabai lainnya, berdasarkan bahwa keempat genotipe cabai yang diuji masih tergolong dalam satu spesies (C. annuum). Hasil pengamatan mikrospora terong menggunakan genotipe Ratih Ungu menunjukkan persentase stadia mikrospora unikleat akhir melebihi 5 % pada panjang kuncup mm. Hasil ini selanjutnya digunakan sebagai penciri kuncup bunga yang tepat pada genotipe terong lainnya. Dasar pemilihan stadia mikrospora ini adalah hasil penelitian Salas et al. (211) yang menunjukkan bahwa stadia kuncup bunga terong yang mengandung stadia mikrospora uninukleat akhir dan binukleat awal sekitar 7 % adalah fase yang tepat untuk induksi androgenesis. Seluruh genotipe cabai yang dicobakan menunjukkan respon androgensis pada metode cabai. Secara umum responsivitas androgenesis pada cabai besar lebih baik daripada cabai Keriting. Responsivitas cabai besar Tombak menurut Supena et al. (26) dapat mencapai 9 %, namun responsivitas Tombak pada penelitian ini hanya mencapai 77 %. Dalam penelitian Supena et al. (26) dilaporkan juga bahwa responsivitas cabai keriting lebih rendah dari cabai besar karena hanya mencapai sekitar 6 % dan tergantung dari genotipe yang digunakan. Responsivitas androgenesis yang bervariasi pada keempat tipe cabai yang diujikan ini menunjukkan adanya pengaruh genotipe. Selain genotipe cabai berpengaruh terhadap responsivitas androgenesis, hasil penelitian ini menunjukkan juga bahwa genotipe berpengaruh terhadap kapasitas androgenesis. Kapasitas androgenesis cabai besar Tombak lebih baik daripada ketiga jenis genotipe lainnya. Begitu pula kapasitas androgenesis cabai besar China lebih besar dari cabai keriting-1 dan cabai keriting-2. Supena et al. (26) melaporkan bahwa jumlah embrio total pada Tombak mencapai 26.2 per kuncup, sedangkan untuk Tombak pada penelitian ini hanya 5.7 per kuncup. Berbeda dengan cabai besar, jumlah embrio total pada cabai keriting menurut laporan Supena et al. (26) tidak dapat melebihi 4 embrio per kuncup. Persentase embrio lengkap yang dihasilkan pada keempat genotipe cabai yang diuji masih di bawah 3 % (Tabel 2). Hal ini juga menjadi masalah serius pada kultur androgenesis cabai lainnya (Kim et al. 24; Supena et al. 26). Supena dan Custers (211) telah mengembangkan metode kultur androgenesis cabai untuk peningkatan persentase embrio lengkap seperti penambahan zat pengatur tumbuh (ZPT), kombinasi ZPT, penambahan karbon aktif dan pengurangan suhu inkubasi pada umur kultur tertentu. Hasil percobaan kultur antera pada media dua-lapis dengan dua metode yang berbeda menunjukkan bahwa metode cabai dapat menginduksi androgenesis

25 pada ketiga spesies Solanaceae, yaitu cabai, terong, dan tembakau, sedangkan metode tembakau hanya menunjukkan respon positif pada tembakau. Metode tembakau sebelumnya telah dicobakan pada cabai dan memiliki respon androgenesis, walaupun tidak sebaik metode cabai (Supena et al. 26). Hasil percobaan ini lebih memperluas prospek penerapan metode kultur antera pada media dua-lapis yang awalnya dikembangkan untuk cabai lokal Indonesia (Supena et al. 26), ternyata kemudian dapat diaplikasikan untuk cabai paprika (Parra- Vega et al. 212), serta pada penelitian ini dapat diaplikasikan untuk tembakau dan terong. Fenomena ini memperlihatkan adanya potensi untuk mengujikan metode cabai pada famili Solanaceae anggota genus Solanum lainnya, seperti tomat yang masih tergolong sulit untuk induksi androgenesisnya. Metode cabai lebih responsif dari metode tembakau dapat disebabkan karena perbedaan perlakuan dan atau kondisi kultur, diantaranya perlakuan suhu rendah pada kuncup sumber antera maupun pada awal tahapan kultur, sumber karbon, dan konsentrasi arang aktif. Pada metode cabai, dilakukan perlakuan suhu 4 o C selama 1 hari pada kuncup bunga sebelum antera dikulturkan pada suhu 9 o C selama 1 minggu, sedangkan untuk metode tembakau hanya perlakuan kuncup bunga pada suhu 9 o C selama 1 minggu (Supena et al. 26). Peningkatan konsentrasi karbon aktif dari 5 g/l pada metode tembakau menjadi 1 g/l pada metode cabai, juga memberikan efek pada peningkatan kapasitas embriogenesis pada cabai (Supena et al 26). Selain itu penggunaan maltosa sebagai pengganti sukrosa juga dapat meningkatkan kapasitas androgenesis pada kultur antera cabai, karena maltosa lebih lambat dirubah menjadi glukosa dibandingkan sukrosa (Dolcet-Sanjuan 1997). Finnie et al. (1989) berasumsi bahwa mikrospora sensitif terhadap glukosa dan fruktosa, sehingga memberikan efek menghambat pada androgenesis. Kultur antera pada media dua-lapis untuk pertama kalinya dicobakan pada tanaman terong. Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa tanaman terong var Antaboga responsif untuk induksi androgenesis dengan menggunakan metode cabai sehingga menghasilkan embrio dan tanaman haploid (haploid ganda) yang berasal dari mikrospora. Androgenesis pada terong var Antaboga selain pertama kali dilaporkan berhasil menggunakan kultur antera pada media dua-lapis, juga merupakan pertama kalinya dilaporkan dapat menghasilkan tanaman haploid (haploid ganda). Hasil penelitian ini telah menambah jumlah protokol dan genotipe yang responsif untuk memproduksi tanaman haploid (haploid ganda) pada terong. 11

26 12 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Kultur antera pada media dua-lapis untuk metode cabai selain responsif untuk semua genotipe cabai yang dicoba (Cabai besar var Tombak, cabai besar China, cabai var Keriting-1, dan cabai var Keriting-2) dan genotipe tembakau SR1, juga responsif untuk genotipe terong var Antaboga, sedangkan metode tembakau hanya berhasil untuk tanaman tembakau SR1. Responsivitas androgenesis untuk genotipe yang dicoba adalah cabai besar var Tombak (77 %), cabai besar China (67 %), cabai var keriting-1 (21 %), cabai var keriting-2 (1 %), dan terong var Antaboga (7 %). Jumlah embrio total yang dihasilkan per kuncup untuk masingmasing genotipe cabai tersebut secara berurutan adalah rata-rata 5.7, 1.7,.3, dan.5 serta.2 embrio per kuncup untuk terong var Antaboga. Hasil analisis ploidi salah satu tanaman hasil kultur antera untuk cabai keriting adalah haploid dan terong adalah mixoploid yang keduanya membuktikan hasil proses androgenesis. Saran Penggunaan tanaman donor sumber antera disarankan tidak menggunakan tanaman yang telah melebihi periode pembungaan optimal atau tanaman yang sudah tua, karena selain mempengaruhi dan menurunkan kapasitas embriogenesis, juga dapat meningkatkan kontaminasi kultur. DAFTAR PUSTAKA Bhattacharyya B, Johri BM Flowering Plants Taxonomy and Phylogeny. New Delhi (IN): Narosa Publishing House. Custers JBM, Snepvangers SCHJ, Jansen HJ, Zhang L, van Lookeren Campagne MM The 35S-CaMV promoter is silent during early embryogenesis but activated during nonembryonic sphorophytic development in microspore culture. Protoplasma 28: Dolcet-Sanjuan R, Claveria E, Huerta A Androgenesis in Capsicum annuum L effects of carbohydrate and carbon dioxide enrichment. J Amer Soc Hort Sci 122: Evans DE, Coleman JOD, Kearns A. 23. Plant Cell Culture. New York (US): BIOS Scientific Publishers. FAOSTAT Production: crops. [Internet]. (diakses 214 Jun 19). Tersedia pada: fao. org. Finnie SJ, Powell W, Dyer AF The effect of carbohydrate composition and concentration on anther culture response in barley (Hordeum vulgare L). Plant Breeding 13: Johansson L, Andersson B, Eriksson T Improvement of anther culture technique: activated charcoal bound in agar medium in combination with liquid medium and elevated CO 2 concentration. Physiol Plant 54: 24-3.

27 Kim M, Kim J, Yoon M, Choi DI, Lee KM. 24. Origin of multicellular pollen and pollen embryos in cultured anthers of pepper (Capsicum annuum L). Plant Cell Tiss Org Cult 77: Murashige T, Skoog F A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: Nitsch JP, Nitsch C Haploid plants from pollen grains. Science 163: Parra-Vega V, Ranau-Morata B, Sifres A, Segui-Simarro JM Stress treatments and in vitro culture conditions influence microspore embryogenesis and growth of callus from anther walls of sweet pepper (Capsicum annuum L. ). Plant Cell Tiss Org Cult 112: Salas P, Prohens J, Segui-Simarro JM Evaluation of androgenic competence through anther culture in common eggplant and related species. Euphytica 182: Segui-Simarro JM, Corral-Martinez P, Parra-Vega V, Gonzalez-Garcia B Androgenesis in recalcitrant solanaceous crops. Plant Cell Rep 3: Supena EDJ, Suharsono S, Jacobsen E, Custers JBM. 26. Successful development of a shed-microspore culture protocol for double haploid production in Indonesian hot pepper (Capsicum annuum L). Plant Cell Rep 25: 1-1. Supena EDJ, Custers JBM Refinement of shed-microspore culture protocol to increase normal embryos production in hot pepper (Capsicum annuum L. ). Sci Hort13:

28 14 LAMPIRAN Tabel Lampiran 1 Komposisi media untuk metode cabai dan tembakau Metode Cabai Metode Tembakau Media Dasar NN (Nitsch & Nitsch 1969) ½MS (Murashige & Skoog 1962) Komposisi (mg/l) Komposisi (mg/l) Makronutrisi : NH 4 NO KNO CaCl 2. 2H 2 O MgSO 4. 7H 2 O KH 2 PO Mikronutrisi : KI -.83 H 3 BO MnSO 4. 4H 2 O MnSO 4. H 2 O - - ZnSO 4. 7H 2 O Na 2 MoO 4. 2H 2 O CuSO 4. 5H 2 O CoCl 2. 6H 2 O -.25 Na 2 EDTA FeSO 4. 7H 2 O Vitamin dan lain-lain : Inositol 1 1 Glycine 2 2 Thiamine HCl.5.1 Pyridoxine HCl.5.5 Nicotinic acid 5.5 Biotin.5 - Folic acid.5 - Maltosa 2 - Gula Sukrosa - 2 Gelrite 2 - Agar Plant Agar - 6 Arang Aktif 1 5 ph Media Keterangan: Komposisi medium pada tabel adalah untuk media padat, sedangkan untuk media cair adalah seperti untuk media padat hanya tidak menggunakan arang aktif dan agar.

29 15 Tabel Lampiran 2 Deskripsi beberapa genotipe tanaman yang digunakan pada percobaan Genotipe Deskripsi Agronomis Umum Buah Cabai var Tombak Daya adaptasi luas, tanaman tegap dan kuat pertumbuhannya Buah besar, lebat, berwarna merah ketika masak, kulit buah halus dan rasanya pedas saat masak Terong var Antaboga Cocok ditanam di dataran rendah sampai menengah, pertumbuhan tanaman kuat, percabangan banyak Buah mudah terbentuk dan lebat. Warna buah ungu dengan kelopak buah berwarna hijau. Buah berbentuk silindris Terong var Ratih Ungu Cocok ditanam di dataran rendah sampai menengah, pertumbuhan tanaman kuat, percabangan banyak Buah mudah terbentuk dan lebat. Warna buah ungu dengan kelopak buah berwarna hijau. Buah berbentuk silindris Panjang Buah ± 12 cm ± 27 cm ± 28 cm Diameter ± 1.5 cm ± 5 cm ± 5 cm Buah Umur Panen ± 85 hari setelah pindah tanam (HSPT) ± 6 HSPT ± 6 HSPT Potensi Hasil ± 2 ton/ha ± 4 kg/tanaman ± 3.5 kg/tanaman Kebutuhan ± 2 g/ha 2 g/ha 2 g/ha Benih Resistan - Terhadap penyakit layu Terhadap penyakit layu

30 16 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Pasar Minggu, Jakarta, pada tanggal 3 Juli Penulis merupakan buah hati dari pasangan setia Alex Rachman dan Susanti, dan merupakan anak pertama, sebagai tauladan, dari dua adik tercinta, Tiara dan Syahrul. Di tahun 21, Penulis pertama kali merasakan indahnya belajar di Institut Pertanian Bogor, setelah berjuang melalui Ujian Mandiri IPB pada pilihan utama yaitu Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan Alhamdullilah, cita-cita tersebut tersampaikan. Sebelum sampai pada tingkat perguruan tinggi, penulis telah menghabiskan masa-masa indah SD, SMP, dan SMA di kota bersih, Tangerang.