Protoplasma. TEKNIK FUSI SEL: Isolasi Protoplasma Fusi protoplasma. Fusi Protoplas: Mengapa menggunakan ini? 10/16/2013

Transkripsi

1 Materi Kuliah Bioteknologi Pertanian TEKNIK FUSI SEL: Isolasi Protoplasma Fusi protoplasma Protoplasma Sel tanpa dinding sel Dapat digunakan sebagai eksplan Digunakan untuk rekayasa genetika Paling sering untuk ekspresi transien transformasi konifer Digunakan untuk membuat hibrid interspesifik Fusi Protoplas: Mengapa menggunakan ini? Jika secara persilangan tidak bisa dilakukan Mengatasi tanaman yang incompatibilitas Dimungkinkan untuk persilangan secara luas Digunakan untuk pengenalan ciri penyakit dan kualitas Potensi yg sangat besar untuk masa depan jika ingin memecahkan permsalahan yang sulit di masa kini Protoplas juga target untuk rekayasa genetika. 1

2 Terminologi dalam teknik fusi sel Hibridisasi genetik: fusi protoplasma sel yg berbeda jenisnya Heterokarion: gabungan 2 atau lebih inti sel protoplasma Cybrid: gabungan sitoplasma 2 sel atau lebih Perbedaan Hibrida somatik dan hibrida seksual : Hibrida Somatik 1.Mempunyai organel dr kedua sel tetua yang bersatu dalam satu sel 2.Hasil fusi terdapat genom inti dari kedua sel tetua 3. Menghasilkan tan ploidi 2 X lipat Hibrida Seksual Berisi organel yang berasal dari tetua betina Genom ½ berasal dr tetua betina dan ½ dari tetua jantan Ploidi sama dengan tetuanya Hibridisasi somatik 2

3 Produksi Hibrida Melalui Fusi Protoplas Empat tahap untuk produksi hibrida: Isolasi Protoplas FusiProtoplas Seleksi Hibrida Regenerasi tanaman Tahapan Fusi Protoplas 1. Mencari prosedur yang tepat untuk isolasi protoplas 2. Mencari prosedur yang tepat untuk mendapatkan hasil fusi yang mempunyai persentase tinggi dalam menghasilkan heterokarion binukleat 3. Seleksi heterokarion setelah fusi 4. Kultur heterokarion dengan persentase pembelahan sel dan regenerasi yang tinggi 5. Analisis karakter hibrid/sibrid dan konstitusi genetik dari tanaman yang dihasilkan Persyaratan fusi : Carlson et al. (1972), Power et al. (1975) persyaratan tumbuh diferensial hibrida untuk menghilangkan protoplas 2 (dua) dua donor spesies Ahli lain menggunakan senyawa kimia untuk menyeleksi protoplas hibrida atau menghilangkan protoplas tetua Metode seleksi : Menggunakan penanda genetik yang dapat dideteksi secara visual (defisiensi klorofil) 3

4 Metode Fusi Protoplas : 1. Pemilihan protoplas tetua 2. Induksi fusi secara kimia 3. Fusi secara elektrik 4. Praktek elektrofusi 5. Mikrofusi 1. Protoplas Tetua Asal : jaringan hipokotil/daun dari tunas kultur in vitro atau kultur suspensi sel umur 3-5 hari Protoplas mesopil dan hipokotil mempunyai kapasitas regenerasi lebih baik Enzim untuk isolasi protoplas kombinasi dari pektinase (untuk pemisahan sel) dan selulase (penghancuran dinding sel) Pemilihan enzim dan lamanya penghancuran dinding sel mempengaruhi viabilitas protoplas dan fusogenik Isolasi Protoplas secara enzimatik Daun: lapisan epidermis dibuang Letakkan daun dalam larutan(diberi osmotikum) Isotonik sampai larutan yang hipertonik ringan Biasanya mengandung mannitol atau sorbitol mm/l Tambahkan enzim Selulase, hemiselulase, pektinase Terjadi degradasi dinding sel Pencucian dan pemurnian dg sentrifugasi Inkubasi untuk memisahkan protoplasma viabel Pelaksanaan isolasi dan kultur protoplasma 20 ml suspensi sel, dipisahkan media dg selnya Tambahkan 10 ml larutan enzim, campur, masukkan ke petridish Inkubasikan 28 o C 6 jam, saring dg saringan μm Pindahkan filtrat ke dalam tabung centrifuge, cuci dg menambahkan 5ml washing medium melalui filter Centrifuge larutan pada 155xg selama 5 menit Buang supernatan, ulangi sentrifugasi, tambah 10 ml float medium, centrifuge lagi pada 155xg selama 5 menit Ambil larutan terkeruh, tambah 5 ml media kultur, centrifuge lagi Supernatant dibuang, tambah media kultur 5 ml, hitung kerapatan protoplasma dg haemacytometer (1x100000)/ml Teteskan protoplasma ke petridish yg diberi kertas saring lembab Inkubasi di cahaya rendah, tambahkan 100 ul media kultur setelah 7-10 hari 4

5 Media kultur protoplasma Hasil isolasi protoplasma Umumnya menggunakan media MS atau B5 dan modifikasinya Diberi larutan osmotikum: manitol atau sorbitol mm/l Penambahan 1 mm/l CaCl2 meningkatkan pembelahan sel ZPT: auksin & sitokinin utk inisiasi Auksin yg digunakan: 2,4 D atau NAA Sitokinin yg digunakan: BAP, Kinetin, 2i-P Daun plantlet kentang sbg sumber protoplasma Protoplas ma dalam larutan 2. Induksi Fusi secara Kimiawi Membran protoplas bermuatan negatif dan protoplas menjadi saling tolak menolak berdekatan mengubah ph medium dg polikation atau efek dehidrasi PEG menyebabkan aglutinasi (penggumpalan), tergantung suhu medium, BM PEG, konsentrasi dan lama perlakuan PEG Galur sel mempengaruhi optimasi fusi. Protoplas dg vakuola kecil lebih mudah fusi dibandingkan dg bervakuola besar FUSI PROTOPLAS: Tidak terjadi secara spontan Selain bisa diinduksi dengan menambah promotor fusi berupa senyawa kimia PEG, juga bisa diinduksi secara elektrik atau diberi virus Tiga kemungkinan produk hasil fusi: Sel A=Sel A Sel B=Sel B Sel A=Sel B Inti biasanya tidak berfusi (sel heterokarion) 5

6 Sel A Tambahkan Enzim Sel B Tambah Promotor Fusi PROTOPLASMA DILIHAT DI BAWAH MIKROSKOP HASIL FUSI PROTOPLASMA 6

7 Seleksi dan kultur heterokarion 1. Penanda yang dapat dilihat Misal : fluorochrome klorofil berwarna merah (mesofil) fluorescein diaceate kloroplas hijau kekuningan (kloroplas) 2. Sortasi sel menggunakan flowcytometer (pemilih sel yang diaktifkan dengan fluoresen) 3. Penanda biokimia menggunakan nitrat sebagai sumber nitrogen planlet yang tumbuh sebagai hibrid 4. Kultur heterokarion sangat tergantung materi yang difusikan Regenerasi Protoplasma menjadi plantlet Osmotikum digunakan untuk proteksi osmotik dalam media kultur Dalam seminggu-10 hari, protoplasma viable telah meregenerasikan dinding selnya dan membelah diri Tekanan osmose media perlahan-lahan diubah dg cara meneteskan media tanpa manitol atau sorbitol Tekanan osmose media apbl tdk diubah, maka tekanan osmose media yg tinggi akan menghambat pembelahan sel KULTUR PROTOPLASMA UNTUK MERAKIT TANAMAN HIBRIDA Regenerasi protoplasma menjadi plantlet bersifat hibrida Terjadi ketidakstabilan genetik dan atau kromosom Menghasilkan tanaman bebas patogen Contoh Fusi Protoplas: Hibrida Intergenerik Wortel X Aegopdium Wortel X Barlei Wortel X Petunia Wortel X Tembakau Jagung X Oat Jagung X Sorghum Petunia X Fava Bean Kedelai X Alfalfa Kedelai X Barlei Kedelai X Jagung Kedelai X Meadow Saffron Kedelai X Pea Kedelai X Tembakau Kedelai X Rape Petunia X Parthenocissus Tomat X Kentang 7

8 Contoh Fusi Protoplas : Hibrida interspesifik Dacus carota X D. capillifplius Datura innoxia X D. discolor Datura innoxia X D. stramonium Nicotiana glauca X N. langsdorffii Nicotiana sylvertris X N. knightiana Nicotiana tabacum X N. debneyi Nicotiana tabacum X N. sylvestris Petunia hybrida X P. parodii LATIHAN Jelaskan pengertian hibridisasi somatik, fusi protoplas, variasi somaklonal, kultur heterokarion! Jelaskan tahapan fusi protoplas dan contoh aplikasinya! Sebutkan beberapa cara dalam seleksi heterokarion! Sebutkan beberapa variasi somaklonal yang terjadi pada hibridisasi somatik! Mengapa dalam kultur anther diperlukan konfirmasi jumlah kromosom? Jelaskan perbedaan hasil hibridisasi secara seksual, hibridisasi somatik, dan tanaman sibrid! Lengkapi dengan gambar! 8