Protoplasma TEKNIK FUSI SEL. Fusi Protoplas: Mengapa menggunakan ini? Produksi Hibrida Melalui Fusi Protoplas. Sel tanpa dinding sel

Transkripsi

1 Materi Kuliah Bioteknologi Pertanian Prodi Agroteknologi Pertemuan Ke 4 TEKNIK FUSI SEL Ir. Sri Sumarsih, MP. Sumarsih_03@yahoo.com Weblog: Sumarsih07.wordpress.com Website: agriculture.upnyk.ac.id Sel tanpa dinding sel Protoplasma Dapat digunakan sebagai eksplan Digunakan untuk rekayasa genetika Paling sering untuk ekspresi transien transformasi konifer Digunakan untuk membuat hibrid interspesifik Fusi Protoplas: Mengapa menggunakan ini? Karena dapat dilakukan Dimungkinkan untuk persilangan secara luas Digunakan untuk pengenalan ciri penyakit dan kualitas Potensi yg sangat besar untuk masa depan jika ingin memecahkan permsalahan yang sulit di masa kini Protoplas juga target untuk rekayasa genetika. Produksi Hibrida Melalui Fusi Protoplas Empat tahap untuk produksi hibrida: Isolasi Protoplas FusiProtoplas Seleksi Hibrida Regenerasi tanaman 1

2 Sumber Protoplasma Dari organ tanaman spt daun, apex pucuk, buah, akar, bintil akar legum, koleoptil, lapisan aleuron pada serealia, atau dari kultur suspensi sel Daun yang paling mudah dari jaringan mesofil, biasanya menggunakan pucuk plantlet yang muda dan steril. Dari kultur suspensi sel umur 3-5 hari Isolasi Protoplas secara enzimatik Daun: lapisan epidermis dibuang Letakkan daun dalam larutan(diberi osmotikum) Isotonik sampai larutan yang hipertonik ringan Biasanya mengandung mannitol atau sorbitol mm/l Tambahkan enzim Selulase, hemiselulase, pektinase Terjadi degradasi dinding sel Pencucian dan pemurnian dg sentrifugasi Inkubasi untuk memisahkan protoplasma viabel Isolasi Protoplas Letakkan daun (atau menggunakan hasil kultur sel tanaman)dalam Buffer Isotonik sampai larutan yang hipertonik ringan Biasanya mengandung mannitol atau sorbitol Tambahkan enzim Selulase, pektinase Degradasi dinding sel Inkubasi (& pemurnian) Pelaksanaan isolasi dan kultur protoplasma 20 ml suspensi sel, dipisahkan media dg selnya Tambahkan 10 ml larutan enzim, campur, masukkan ke petridish Inkubasikan 28 o C 6 jam, saring dg saringan μm Pindahkan filtrat ke dalam tabung centrifuge, cuci dg menambahkan 5ml washing medium melalui filter Centrifuge larutan pada 155xg selama 5 menit Buang supernatan, ulangi sentrifugasi, tambah 10 ml float medium, centrifuge lagi pada 155xg selama 5 menit Ambil larutan terkeruh, tambah 5 ml media kultur, centrifuge lagi Supernatant dibuang, tambah media kultur 5 ml, hitung kerapatan protoplasma dg haemacytometer (1x100000)/ml Teteskan protoplasma ke petridish yg diberi kertas saring lembab Inkubasi di cahaya rendah, tambahkan 100 ul media kultur setelah 7-10 hari 2

3 Hasil isolasi protoplasma Daun plantlet kentang sbg sumber protoplasma Protoplas ma dalam larutan Media kultur protoplasma Umumnya menggunakan media MS atau B5 dan modifikasinya Diberi larutan osmotikum: manitol atau sorbitol mm/l Penambahan 1 mm/l CaCl2 meningkatkan pembelahan sel ZPT: auksin & sitokinin utk inisiasi Auksin yg digunakan: 2,4 D atau NAA Sitokinin yg digunakan: BAP, Kinetin, 2i-P Fusi sel pada bakteri Enzym lisosim yang dapat merusak dinding sel bakteri 3

4 Sel A Tambahkan Enzim Sel B FUSI PROTOPLAS: Tidak terjadi secara spontan Tambah promotor fusi PEG / Elektrik / Virus Kemudian diinkubasi Tiga kemungkinan produk hasil fusi: Sel A=Sel A Sel B=Sel B Sel A=Sel B Inti biasanya tidak berfusi (sel heterokarion) Terminologi dalam teknik fusi sel Hibridisasi genetik: fusi protoplasma sel yg berbeda Heterokarion: gabungan 2 atau lebih inti sel protoplasma Cybrid: gabungan sitoplasma 2 sel atau lebih 4

5 Tambah Promotor Fusi Fusi Protoplas PROTOPLASMA DILIHAT DI BAWAH MIKROSKOP HASIL FUSI PROTOPLASMA Regenerasi Protoplasma menjadi plantlet Osmotikum digunakan untuk proteksi osmotik dalam media kultur Dalam seminggu-10 hari, protoplasma viable telah meregenerasikan dinding selnya dan membelah diri Tekanan osmose media perlahan-lahan diubah dg cara meneteskan media tanpa manitol atau sorbitol Tekanan osmose media apbl tdk diubah, maka tekanan osmose media yg tinggi akan menghambat pembelahan sel 5

6 KULTUR PROTOPLASMA UNTUK MERAKIT TANAMAN HIBRIDA Regenerasi protoplasma menjadi plantlet bersifat hibrida 6