BIOTEKNOLOGI MACAM KULTUR JARINGAN

Transkripsi

1 BIOTEKNOLOGI MACAM KULTUR JARINGAN

2 MACAM TEKNIK KULTUR JARINGAN ORGAN HAPLOID TEKNIK KULJAR KALUS PROTOPL ASMA

3 BAB 6 1. KULTUR ORGAN Kultur sel Kultur Akar dan Meristem Kultur Pucuk Embrio

4 1. KULTUR ORGAN KULTUR SEL Adalah pembudidayaan /pemeliharaan sel tunggal maupun gabungan beberapa sel, dalam lingkungan buatan (medium buatan) yang steril Kultur sel terdiri atas populasi sel dengan laju pertumbuhan yang cepat karena seluruh permukaan sel dapat kontak langsung dengan medium nutrisi Salah satu bagian yang sering dijadikan sumber eksplan dalam kultur sel adalah daun. Daun yang dipilih adalah daun yang sudah membuka sempurna, tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda, dan diperkirakan masih sebagai source Kultur sel mempunyai metabolisme yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan kultur kalus

5 1. KULTUR ORGAN KULTUR SEL Penanaman dalam media cair Potongan daun Chenopodium rubrum yang mengambang pada media MS, sel mesofilnya membelah dengan cepat. Setelah 4 hari, potongan daun terpisah sempurna dan membebaskan sel dalam jumlah yang besar Secara Mekanis Mengupas jaringan epidermis (dapat pula dengan cara di blender), kemudian jaringan yang tanpa epidermis disikat. Dimasukan larutan osmotikum (manitol, sorbitol, Mg Cl 2, Ca Cl 2 ) dengan ph 3 Secara Enzimatis Menggunakan enzim pektinase atau poligalacturonase, yang dapat melarutkan senyawa pektat sehingga lamella tengah melunak dan akhirnya sel sel terpisah

6 1. KULTUR ORGAN KULTUR SEL

7 1. KULTUR ORGAN KULTUR SEL KEGUNAAN KULTUR SEL Produksi metabolit sekunder, obat-obatan, senyawa flavor/pewangi, pewarna. Metabolit sekunder biasanya diekstrak dari akar tanaman, polong, buah dll Mempelajari metabolisme sel Menguji pengaruh berbagai senyawa terhadap sel Mendapatkan biomasa sel untuk kutur protoplas Kelebihan kultur sel : - Tanaman yang dihasilkan bebas dari hama penyakit serta faktor lingkungan lainnya - Dapat dilakukan secara terus menerus

8 1. KULTUR ORGAN KULTUR SEL LANGKAH PEMBENTUKAN

9 1. KULTUR ORGAN KULTUR SEL LANGKAH PEMBENTUKAN

10 1. KULTUR ORGAN KULTUR SEL - PERBEDAAN

11 1. KULTUR ORGAN KULTUR SEL STUDI KASUS PADA TEH Penggunaan kultur sel untuk pembentukan bibit teh : 1. Induksi kalus 2. Pembuatan suspensi sel 3. Agregat sel untuk induksi embrio 4. Pendewasaan embrio 5. Perkecambahan embrio dan seleksi bibit 1. Induksi Kalus : Tahap awal dari kultur sel adalah induksi kalus sebagai sumber suspensi sel Bahan tanaman (eksplan dikulturkan pada medium padat buatan dengan perlakuan sesuai untuk induksi kalus selama 6-8 hari

12 1. KULTUR ORGAN KULTUR SEL STUDI KASUS PADA TEH Penggunaan kultur sel untuk pembentukan bibit teh : 1. Induksi kalus 2. Pembuatan suspensi sel 3. Agregat sel untuk induksi embrio 4. Pendewasaan embrio 5. Perkecambahan embrio dan seleksi bibit 2. Pembuatan suspensi sel : Kalus yang terbentuk dipotong kecil-kecil (lembut) kemudian dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer yang berisi media cair dengan atau tanpa penambahan enzim untuk memisahkan agregat sel menjadi sel tunggal Tabung kemudian aduk dengan orbital shaker berkecepatan sekitar 80 rpm (putaran per menit) selama seminggu. Selanjutnya, media disaring dengan kain Marycloth yang mempunyai ukuran lubang atau mesh mđm,sehingga sel-sel yang terpisah atau berbentuk tunggal akan lolos dari saringan dan diperoleh suspensi sel murni. Suspensi sel ditumbuhkan pada medium baru, digojog secara orbital selama 6-8 hr sampai terbentuk agregat sel kompak

13 1. KULTUR ORGAN KULTUR SEL STUDI KASUS PADA TEH Penggunaan kultur sel untuk pembentukan bibit teh : 1. Induksi kalus 2. Pembuatan suspensi sel 3. Agregat sel untuk induksi embrio 4. Pendewasaan embrio 5. Perkecambahan embrio dan seleksi bibit 3. Agregat sel untuk induksi embrio: Agregat sel dikulturkan dalam botol jam yang berisi medium padat untuk induksi embrio somatik Botol dikulturkan dalam ruang terang cahaya baur selama 6-8 hr. Mulai umur 4-5 hr, akan terlihat bulatan bulatan kuning keputihan yang sebenarnya adalah proses inisiasi pertumbuhan embrio Setelah berumur lebih dari 6 hr, bentuk dan ukuran embrio makin jelas dan membesar sehingga bisa dipindah atau disubkultur ke medium untuk pendewasaan embrio somatik.

14 1. KULTUR ORGAN KULTUR SEL STUDI KASUS PADA TEH Penggunaan kultur sel untuk pembentukan bibit teh : 1. Induksi kalus 2. Pembuatan suspensi sel 3. Agregat sel untuk induksi embrio 4. Pendewasaan embrio 5. Perkecambahan embrio dan seleksi bibit 4. Pendewasaan embrio : Pada tahap ini, digunakan botol jam sebagai tempat media padat dan kultur pro-embrio atau embrio muda Botol kemudian ditempatkan dalam ruang terang cahaya baur Pro-embrio atau embrio stadium muda (fase globular) dipindah atau disubkultur pada media padat untuk pendewasaan embrio sampai bentuk kotiledon dan siap dikecambahkan

15 1. KULTUR ORGAN KULTUR SEL STUDI KASUS PADA TEH Penggunaan kultur sel untuk pembentukan bibit teh : 1. Induksi kalus 2. Pembuatan suspensi sel 3. Agregat sel untuk induksi embrio 4. Pendewasaan embrio 5. Perkecambahan embrio dan seleksi bibit 5. Perkecambahan embrio dan seleksi bibit: Pada tahap ini, kecambah ditanam pada media padat dengan perlakuan untuk pembesaran kecambah (planlet muda). Kemudian ditempatkan pada ruang terang cahaya langsung dari lampu TL 40 W dengan lama penyinaran jam/hari. Pada umur 4-6 hr, bibit sudah membesar dengan daun dan akar yang makin banyak. Pada umur 8 hr atau lebih, perakaran makin baik sehingga bibit siap diseleksi untuk diaklimatisasi di rumah kaca pada media tumbuh berupa tanah, pasir dan bahan organik. Tempat kultur berupa plastik polibag warna hitam. Setelah bibit membesar dengan tunas, daun, dan perakaran yang makin kuat, bibit dipindahkan ke persemaian sampai siap ditanam di lapang atau kebun.

16 1. KULTUR ORGAN KULTUR AKAR Teknik kultur akar : Kultur akar adalah proses diferensiasi dan fungsi dari jaringan-jaringan khusus yang dieksplorasi dalam kultur in vitro Kultur akar yang sudah diisolasi : - Sifat morfologi sama seperti akar tanaman - Pola penyebaran pembuluh spesifik dari spesies (quiscent center) - Cabang-cabang lateral terbentuk (dapat diatur dengan pemberian hara tertentu dan penyinaran Ditumbuhkan dlm media cair dg pengocokan perlahan2 Garam makro & mikro ion jodium (White) Besi Sukrosa (utk bbrp jenis graminae, glukosa lebih baik) Kombinasi vitamin : thiamine, pyridoxine, nicotinic acid, glicyne (Pengganti fungsi ekstrak ragi) Auksin & sitokinin tdk selalu dibutuhkan. Auksin dibutuhkan akar pinus & bbrp graminae, menghambat kultur akar tomat

17 1. KULTUR ORGAN KULTUR AKAR Giberelin merangsang akar dr kultivar kerdil, tdk berpengaruh pd kultivar norma ph (perpanj akar) ; (inisiasi akar lateral) Cahaya rendah merangsang pertumb akar pd bbrp species Temperatur : 25 27oC Sumber eksplan : akar kecambah aseptik, akar adventif dlm kalus

18 1. KULTUR ORGAN KULTUR MERISTEM Kul-jar tanaman dg eksplan jaringan2 meristematik Meristem pucuk terminal / tunas aksilar Untuk mendapatkan tnm sempurna, memperbanyak tanaman Penerapan : Perbanyakan tanaman, terutama hortikultura Eliminasi virus dari bahan tanaman Penyimpanan plasma nutfah dg cryopreservation Tanaman yg dihasilkan berkembang dr jaringan vegetatif, planlet hasil merupakan klon (mericlone)

19 KULTUR MERISTEM STUDI KASUS PADA KALUS ANGGREK CYMBIDIUM (Morel, 1960 dalam Dodds dan Robert, 1982) Membentuk kalus protocorm massa protocorm Dipisah2, ditumbuhkan di media serupa massa protocorm baru Dipindahkan pd media lain unt proses pendewasaan dan pengakaran tnm baru yg sempurna, siap pindah lapang Media Murashige Kultur meristem & kultur pucuk teknik perbanyakan tnm hortikultura 10 thn mengemb teknik2 standard unt beberapa jenis tanaman (tnm hias sampai buah2 an) Penggunaan auksin dan sitokinin, perlu dlm kultur yg dikembangkan

20 KULTUR MERISTEM STUDI KASUS PADA KALUS ANGGREK CYMBIDIUM (Morel, 1960 dalam Dodds dan Robert, 1982) Membentuk kalus protocorm massa protocorm Dipisah2, ditumbuhkan di media serupa massa protocorm baru Dipindahkan pd media lain unt proses pendewasaan dan pengakaran tnm baru yg sempurna, siap pindah lapang Media Murashige Kultur meristem & kultur pucuk teknik perbanyakan tnm hortikultura 10 thn mengemb teknik2 standard unt beberapa jenis tanaman (tnm hias sampai buah2 an) Penggunaan auksin dan sitokinin, perlu dlm kultur yg dikembangkan

21 1. KULTUR ORGAN KULTUR PUCUK Pucuk (berisi meristem & jaringan2 di bawahnya), lebih mudah diisolasi Ukuran bahan awal : cm Tujuan praktis : perbanyakan vegetatif tanaman Pucuk awal, dlm media tepat membentuk pucuk baru dg jumlah tergantung jenis (4 20an). Stl diinduksi pembentukan akar, terbentuk tnm sempurna fotocopy induknya Merupakan dasar dr kegiatan perbanyakan dalam lab komersial Pertumbuhan pucuk : perlu zpt dlm media Auksin : IAA, NAA, IBA (2,4-D dihindarkan) Sitokinin : BAP, 2iP, kinetin (konsentrasi sitokinin > auksin) Teknik subkultur berulang tunas kentang : Eksplan awal : tunas kentang bebas virus Satu tunas pucuk/tunas ketiak ditumbuhkan dalam media perbanyakan Tumbuh buku-buku dg masing2 satu tunas ketiak Setiap 4 mgg tunas dipanen dan dipotong2 mjd buku2 tunggal atau bbrp buku (3-4 buku) Dikulturkan lagi dlm media baru Demikian seterusnya setiap 4 minggu dilakukan kultur berulang

22 1. KULTUR ORGAN KULTUR PUCUK

23 1. KULTUR ORGAN KULTUR PUCUK

24 1. KULTUR ORGAN KULTUR PUCUK

25 1. KULTUR ORGAN KULTUR PUCUK

26 1. KULTUR ORGAN KULTUR EMBRIO Isolasi secara steril embrio matang ataupun belum matang, dengan tujuan memperoleh tanaman yang viabel macam kultur embrio: 1. kultur embrio yg belum matang, utk mencegah keguguran : embryo rescue 2. Kultur embrio matang, utk merangsang perkecambahan : embryo culture Tujuan : membantu perkecambahan embrio mjd tanaman lengkap Diperlukan dlm embrio yg memp masalah : Menunjukkan masa dormansi yang panjang Embrio hibrida hasil penyilangan interspesifik yg tidak kompatibel dg endospermnya Embrio dg endosperm yg rusak spt kelapa kopyor Embrio tanpa endosperm spt pd anggrek Penting dlm ilmu fisiologi, dlm hal perkembangan embrio Pengertian ttg kebutuhan nutrisi embrio pd berbagai tahap perkembangan (Percobaan media perlakuan ) Kemampuan regenerasi dr potongan2 embrio Sangat penting dlm pemuliaan tanaman

27 KULTUR EMBRIO CONTOH DAN FAKTOR YANG MEMPENGARUHI KEBERHASILAN 1. Memecahkan dormansi - Pd Musa balbisiana, tdk mungkin memperoleh perkecambahan secara normal - Cherry, hazel, acer : tanaman yg memiliki dormansi panjang 2. Mencegah gugurnya embrio pd persilangan interspesifik - Persilangan ini sering menghasilkan biji dengan endosperm yg tdk sempurna, atau embrio yg lemah, kecil. Contoh: Kacang, Kapas, Tomat, Padi. 3. Hibridisasi utk produksi triploid (buah tanpa biji) - Jeruk triploid Citrus sinensis Diploid citrus X tetraploid citrus = jeruk tanpa biji - Pisang triploid Musa acuminata (AA) X Musa balbisiana (BB) = pisang tanpa biji (AAB)

28 KULTUR EMBRIO CONTOH DAN FAKTOR YANG MEMPENGARUHI KEBERHASILAN Faktor yang mempengaruhi Genotip Tahap embrio diisolasi Tanaman inang Media kultur embrio Lingkungan Genotip mennetukan mudah tidaknya embrio diisolasi dan ditumbuhkan Prinsipnya embrio yang lebih besar akan lebih baik Sebaiknya ditumbuhkan di rumah kaca / kondisi terkontrol - Hara makro dan mikro - ph 5,0 6,0 - Sukrosa sbg sumber energi, embrio belum matang perlu 8-12%, embrio matang perlu 3% - Auksin dan sitokinin tidak diperlukan. GA untuk memecah dormansi - Vitamin - Senyawa organik - Oksigen (perlu oksigen tinggi) - Cahaya : kadang embrio perlu ditumbuhkan dalam gelap selama 14 hari. Kemudian ditransfer ke cahaya untuk merangsang sintesa protein - Suhu : kadang perlu perlakuan dingin untuk memecah dormansi

29 1. KULTUR ORGAN KULTUR EMBRIO Embrio rescue pada anggrek : Biji mrpkan sumber eksplan yg bagus 1 kapsul anggrek berisi juta biji Biji sangat kecil, hampir tdk memiliki cadangan makanan, shg benih sulit berkecambah di tanah. Mudah terancam kekeringan dan serangan hama penyakit Perbanyakan in vitro memberi alternatif lingkungan terproteksi, nutrisi yg cukup, dan bebas serangan bakteri atau jamur

30 1. KULTUR ORGAN KULTUR EMBRIO Proses Perkecambahan : Benih menyerap air melalui testa Embrio mengalami imbibisi, membengkak, pembelahan sel dimulai, dan embrio menembus kulit biji Protocorm terbentuk dari massa embrio Diferensiasi organ dimulai dg pembentukan meristem tunas & rhizoid Jk ada chy, daun terbentuk, diikuti oleh akar sejati. Rhizoid & protocorm tdk berfungsi lagi dan terdegenerasi

31 1. KULTUR ORGAN KULTUR EMBRIO

32 1. KULTUR ORGAN KULTUR EMBRIO Teknik kultur embrio anggrek : 1. Sterilisasi kapsul/benih anggrek: - Lebih baik menggunakan kapsul (buah anggrek) yg belum terbuka, karena sterilisasi lebih mudah - Sterilisasi kapsul yg belum terbuka dg cara merendam dlm 95% alkohol dan flaming - Di dalam laminer, buka kapsul dg menggunakan skalpel steril. Biji dlm kapsul biasanya steril. - Jk kapsul sdh terbuka, benih perlu disterilisasi. Rendam dlm 2% NaOCl 2. Cara penanaman benih anggrek - Benih ditaburkan pd permukaan media padat dlm wadah dg permukaan luas, misal. Botol jam atau botol saus yang diletakkan mendatar. - Jangan terlalu banyak benih yg ditanam, supaya setelah benih berkecambah tidak terlalu rapat - Perlu subkultur 2-3 kali sebelum ditransfer ke tanah

33 2. KULTUR KALUS Pengertian kalus : Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus menerus Sel-sel penyusun kalus adalah sel-sel parenkhim yang mempunyai ikatan yang renggang antar sel satu dg sel lain

34 2. KULTUR KALUS Aplikasi kultur kalus : Dalam beberapa hal, perlu fase pertumbuhan kalus sebelum regenerasi via somatik embryogenesis atau organogenesis Untuk menghasilkan varian somaklonal (genetik atau epigenetik) Sebagai bahan awal kultur protoplast dan kultur suspensi Untuk produksi metabolit sekunder Digunakan untuk seleksi in vitro Pengertian kultur kalus : Kultur kalus bertujuan untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali Kalus diharapkan memperbanyak diri (massa selnya) secara terus menerus. Kalus dihasilkan dari kultur organ, dengan media diberi auksin atau sitokinin, kecuali untuk eksplan yang mengandung kambium dapat membentuk kalus tanpa diberi ZPT

35 2. KULTUR KALUS

36 2. KULTUR KALUS

37 2. KULTUR KALUS Perbedaan kebutuhan ZPT untuk pembentukan kalus : Jaringan yang membutuhkan auksin, gula, dan garam mineral. Misal umbi artichoke Jaringan yang membutuhkan auksin, sitokinin, gula dan garam mineral. Misal empulur tembakau Jaringan yang hanya membutuhkan gula dan garam mineral, tanpazpt. Misal jaringan kambium Jaringan yang membutuhkan sitokinin, gula dan garam mineral. Misal parenkhim xylem akar Turnip Kemampuan pembentukan kalus dari jaringan dipengaruhi : Umur fisiologis jaringan Musim saat bahan tanaman diisolasi Bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan Jenis tanaman Jenis tanaman yangmenghasilkan kalsu : Dikotil berdaun lebar, monokotil, gymnospermae dan pakis

38 2. KULTUR KALUS Induksi kalus : Kalus dapat diinduksi dengan pemberian ZPT auksin dan sitokinin, namun kebutuhannya berbeda-beda tgt macam jaringan tanaman Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman, tetapi dari organ yang berbeda kecepatan pembelahan selnya berbeda pula Bagian tanaman yang mudah dediferensiasi dan menghasilkan kalus: embrio muda, hipokotil, kotiledon, dan batang muda Optimasi pertumbuhan kalus : Media yang digunakan dapat menggunakan media padat maupun cair Pada media cair, keuntungannya dapat digunakan untuk produksi massal, dan terbentuk embrio somatik yang terpisah sehingga lebih mudah di subkulturkan untuk inisiasi pertumbuhan plantlet Lingkungan diatur dengan ketersediaan oksigen tinggi, ketersediaan hara dan cahaya yang cukup

39 2. KULTUR KALUS Aspek anatomis kalus : Pada jaringan yang membentuk kalus, pembelahan sel tidak terjadi pada semua sel eksplan, hanya di lapisan periphery yang membelah terus menerus, shg terbentuk lapisan: Lapisan luar dengan sel sel yang pecah Lapisan kedua terdiri dari dua lapisan sel dorman Lapisan dengan sel yang aktif membelah, terdiri dari 1-6 lapis sel Lapisan tengah (core) yang selnya tidak membelah Sel sel heterogen pada kalus : Eksplan batang, akar, daun menghasilkan kalus dg sel yang heterogen Setelah disubkultur berkali-kali dapat mengakibatkan : - Aberasi kromosom - Mutasi gen - Endoreduplikasi yg menghasilkan poliploidi - Transposisi urutan DNA - Amplifikasi gen: jmlh gen utk suatu sifat tertentu per genom haploid bertambah - Hilangnya suatu gen (deletion)

40 3. KULTUR PROTOPLASMA Apa itu protoplasma : Sel tanpa dinding sel Dapat digunakan sebagai eksplan Digunakan untuk membuat hibrid interspesifik Fusi sel untuk menghasilkan hibrida somatik Mendapatkan sifat tanaman lebih baik melalui variasi somaklonal Digunakan untuk rekayasa genetika Produksi hibrid melalui protoplas : Empat tahap untuk produksi hibrid : Isolasi Protoplas FusiProtoplas Seleksi Hibrid Regenerasi mjd plantlet (tanaman lengkap)

41 3. KULTUR PROTOPLASMA Sumber protoplasma : Dari organ tanaman spt daun, apex pucuk, buah, akar, bintil akar legum, koleoptil, lapisan aleuron pada serealia, atau dari kultur suspensi sel Daun yang paling mudah dari jaringan mesofil, biasanya menggunakan pucuk plantlet yang muda dan steril. Dari kultur suspensi sel umur 3-5 har

42 3. KULTUR PROTOPLASMA Asolasi protoplas secara enzimatik : Daun: lapisan epidermis dibuang Letakkan daun dalam larutan (diberi osmotikum) - sotonik sampai larutan yang hipertonik ringan - Biasanya mengandung mannitol atau sorbitol mm/l Tambahkan enzim - Selulase, hemiselulase, pektinase - Terjadi degradasi dinding sel Pencucian dan pemurnian dg sentrifugasi Inkubasi untuk memisahkan protoplasma viabel

43 3. KULTUR PROTOPLASMA Media kultur protoplas : Umumnya menggunakan media MS atau B5 dan modifikasinya Diberi larutan osmotikum: manitol atau sorbitol mm/l Penambahan 1 mm/l CaCl2meningkatkan pembelahan sel ZPT: auksin & sitokinin utk inisiasi Auksin yg digunakan: 2,4 D atau NAA Sitokinin yg digunakan: BAP, Kinetin, 2i-P Mengapa menggunakan fusi protoplas : Karena dapat dilakukan Dimungkinkan untuk persilangan secara luas Digunakan untuk pengenalan ciri penyakit dan kualitas Potensi yg sangat besar untuk masa depan jika ingin memecahkan permsalahan yang sulit di masa kini Protoplasma digunakan untuk rekayasa genetika tanaman

44 3. KULTUR PROTOPLASMA

45 3. KULTUR PROTOPLASMA Fusi protoplas : Tidak terjadi secara spontan Tambah promotor fusi (PEG / Elektrik / Virus) Kemudian diinkubasi Tiga kemungkinan produk hasil fusi : - SelA = SelA - SelB = SelB - SelA = SelB Inti biasanya tidak berfusi (sel heterokarion)

46 3. KULTUR PROTOPLASMA

47 3. KULTUR PROTOPLASMA Regenerasi protoplas menjadi planlet : Osmotikum digunakan untuk proteksi osmotik dalam media kultur Dalam seminggu-10 hari, protoplasma viable telah meregenerasikan dinding selnya dan membelah diri Tekanan osmose media perlahan-lahan diubah dg cara meneteskan media tanpa manitol atau sorbitol Tekanan osmose media apbl tdk diubah, maka tekanan osmose media yg tinggi akan menghambat pembelahan sel

48 4. KULTUR HAPLOID

49 4. KULTUR HAPLOID Pembentukan tanaman haploid : Kultur Anther (androgenesis) - produksi tanaman haploid dengan eksplan anther - Kurang lebih 250 spesies berhasil dikulturkan - Jenis tanaman Solanaceae, Cruciferae, Gramineae, Ranunculaceae Kultur Ovule (gynogenesis) - produksi tanaman haploid dengan eksplan sel telur yang belum dibuahi Kultur Haploid : Tan haploid sangat penting bagi pemulia tanaman, yaitu untuk memperpendek masa pemuliaan tanaman Karena hanya ada 1 set kromosom, maka mudah digunakan untuk mengidentifikasi mutasi resesif Dapat menghasilkan homozygote double haploid (diploid) atau poliploid dengan diberi colchicin untuk inbreeding dengan hasil hibrida unggul (super) Anther untuk eksplan kultur disebut kultur anther

50 4. KULTUR HAPLOID Kultur anther /Pollen : Metode untuk memproduksi tanaman haploid Sering terjadi secara spontan Dapat diinduksi dengan perlakuan fisik atau kimia Utk eliminasi kromosom yang digunakan untuk hibridisasi interspesifik

51 4. KULTUR HAPLOID Faktor yang mempengaruhi kultur anther : 1. Genotip 2. Kondisi tanaman donor a) Umur, kondisi fisiologis : pilih yang sehat dan kuat b) Gunakan bud yang baru muncul 3. Tahapan perkembangnan mikrospora a) Anther umumnya responsif pd tahap uninucleate b) Saat menyiapkan protokol/prosedur, catat ukuran, warna, bentuk bunga, lalu disesuaikan dg tahap mikrospora yg tepat. Sehingga dikemudian hari, memudahkan pengambilan eksplan yg tepat

52 4. KULTUR HAPLOID Faktor yang mempengaruhi kultur anther : 4. Perlakuan awal dan inkubasi awal a) Pd tembakau, kuncup diinkubasi pd 7-8 o C selama 12 hr sebelum dikulturkan b) Pada B. campestris, 35 o C selama 1-3 hr 5. Media a) Yg umum : media MS (Murashige & Skoog, 1962) dan N6 (Chu, 1978) b) Kadang perlu ekstrak kentang, air kelapa, casein hydrolisate, sukrosa c) Media padat atau cair Problem dalam kultur anther : Hasil rendah Ketidakstabilan genetik Pada serealia, tan haploid selalu albino Perlu memodifikasi media, tahap perkembangan mikrospora dan faktor lain Double haploid tidak selalu homosigot

53 4. KULTUR HAPLOID Prosedur umum kultur anther : Koleksi kuncup bunga - Keseluruhan inflorescence atau kuncup bunga dipanen dan dijaga kelembabannya sampai siap dikulturkan - Jika kuncup perlu pre-treatment, bungkus dg kertas tisu yg sdh diperciki air, lalu masukkan ke dlm plastik Desinfestation, excision & culture - Sterilisasi umum dg 5% NaOCl, Anther lalu diambil, hati2 jgn sampai terluka. Hilangkan filamen - Tanam dlm media, biasanya pake petridish

54 4. KULTUR HAPLOID Prosedur umum kultur anther : Penentuan tahap mikrospora - Ditentukan dg cara memencet anter dlm acetocarmine atau propiocarmine dan diamati di bwh mikroskop

55 4. KULTUR HAPLOID Penanganan planlet haploid : Plantlet kecil akan muncul 4 8 mg setelah dikulturkan Pisah2kan dan disubkultur ke media akar Lalu dipindah ke pot kecil Perlakuan colchicine untuk menghasilkan tan double haploid