HASIL DAN PEMBAHASAN. dalam oven bersuhu 105ºC hingga bobotnya konstan.

Transkripsi

1 4 dalam oven bersuhu 105ºC hingga bobotnya konstan. Metode Modifikasi I a. Ekstraksi Sebanyak 250 gram simplisia temu lawak diekstraksi dengan cara maserasi dengan pelarut etanol 96% (v/v) selama 6 jam sambil sesekali diaduk, kemudian didiamkan sampai 24 jam. Maserat dipisahkan, dan proses diulang dua kali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Semua maserat dikumpulkan dan disaring dengan kertas saring. Kemudian ditambahkan natrium sulfat anhidrat untuk menghilangkan kandungan air yang masih ada. Selanjutnya disaring kembali sebanyak dua kali dan diuapkan dengan penguap vakum. Ekstrak kasar yang sudah dipekatkan membentuk dua fase sehingga dilakukan partisi menggunakan metode Sajuthi (2001) dengan cara menambahkan 200 ml heksana. Fase heksana dan fase etanol kemudian dianalisis kandungan xantorizolnya dengan metode HPLC. Sistem HPLC yang digunakan ialah kolom C18, detektor UV-Vis, volume injeksi 10 µl, elusi gradien (elusi H 3 PO 4 dan metanol), dan suhu kolom 40 C. b. Asetilasi Ekstrak kental yang diperoleh selanjutnya diasetilasi menggunakan prosedur yang sama dengan prosedur asetilasi metode Asriani yaitu dengan cara melarutkannya ke dalam piridin:asetat anhidrat (1:1, v/v) dengan perbandingan sampel dan pelarut 1:20 (b/v) dan direaksikan selama 24 jam pada suhu kamar. Produk asetilasi kemudian dicirikan dengan KLT dan FTIR. c. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Preparatif Senyawa hasil asetilasi yang diperoleh difraksinasi lanjut dengan KLT preparatif menggunakan eluen heksana:etil asetat (10:1, v/v). d. Deasetilasi Deasetilasi dilakukan dengan cara melarutkannya ke dalam metanol, lalu ditambahkan KOH hingga konsentrasi 3-7%, kemudian dimasukkan ke dalam resin penukar kation selama 3 jam sehingga diperoleh senyawa xantorizol. Pencirian dilakukan dengan menggunakan KLT, FTIR, dan HPLC. Metode Modifikasi II Metode modifikasi II ini sama seperti metode modifikasi I, namun setelah diekstraksi dengan heksana dilakukan ekstraksi kembali dengan dietil eter menggunakan metode Najib (2008). Ekstrak etanol dan heksana masing-masing dilarutkan dalam dietil eter (1:5), kemudian diaduk dengan pengaduk magnetik. Fraksi yang larut dalam dietil eter dikeluarkan dari labu, dan ke dalam labu ditambahkan lagi dietil eter yang baru lalu diaduk. Proses partisi ini dilakukan hingga pelarut dietil eter yang ditambahkan menjadi bening. Fraksi larut dietil eter dikumpulkan dan diuapkan untuk selanjutnya dilakukan proses asetilasi, KLTP, dan deasetilasi. Metode Modifikasi III Metode modifikasi III merupakan tambahan dari metode modifikasi I, yaitu dilakukan KLTP tahap II menggunakan eluen yang sama pada ekstrak hasil deasetilasi dari metode modifikasi I. Hasil KLTP dicirikan dengan KLT analitik, HPLC, dan GC-MS. HASIL DAN PEMBAHASAN Metode Modifikasi I Penentuan kadar air Penentuan kadar air simplisia temu lawak yang digunakan dilakukan selama 10 hari, yaitu sampai bobot sampel konstan. Berdasarkan data pada Lampiran 2, diperoleh kadar air sampel sebesar 12.81%. Kadar air temu lawak yang diperoleh digunakan untuk mengetahui bobot temu lawak kering yang sebenarnya sehingga persen rendemen xantorizol dan ekstrak kasarnya dapat diketahui. Ekstraksi temu lawak Ekstraksi 250 g temu lawak dengan etanol 96% menghasilkan ekstrak kasar etanol sebanyak gram (11.86%). Hasil ekstraksi tersebut membentuk dua fase disebabkan kandungan lemak yang besar sehingga tidak dapat dilakukan analisis HPLC untuk mengetahui kandungan xantorizol awalnya. Oleh karena itu dilakukan partisi dengan heksana menggunakan metode Sajuthi (2001) dan diperoleh ekstrak dalam fraksi etanol sebanyak gram (30.75%), sedangkan ekstrak dalam fraksi heksana sebanyak gram (35.53%). Analisis HPLC dilakukan untuk mengetahui kandungan xantorizol pada masing-masing ekstrak. Standar xantorizol

2 5 Sebelum asetilasi Setelah asetilasi Sebelum asetilasi Setelah asetilasi Gambar 4 Perbandingan spektrum FTIR ekstrak etanol dan ekstrak heksana metode modifikasi I sebelum dan setelah asetilasi yang digunakan sebesar 100 ppm dengan profil kromatografi pada Lampiran 3. Hasil analisis HPLC dari masing-masing ekstrak menunjukkan kandungan xantorizol dalam fraksi heksana lebih besar daripada fraksi etanol. Pada Lampiran 4 dan 5 dapat dilihat bahwa area peak xantorizol pada fraksi heksana sebesar , sedangkan pada fraksi etanol hanya sebesar Dengan demikian, jika dibandingkan dengan area peak standar xantorizol, kandungan xantorizol pada fraksi etanol dan heksana masing-masing adalah ppm dan ppm. Asetilasi Asetilasi masing-masing ekstrak menggunakan piridin:asetat anhidrat (1:1, v/v) menghasilkan ekstrak etanol sebanyak gram dan ekstrak heksana sebanyak gram. Skema reaksi asetilasi xantorizol dapat dilihat pada Gambar 5. Gambar 5 Skema reaksi asetilasi xantorizol (Cheah et al 2009)

3 6 Perbandingan spektrum IR sebelum dan setelah asetilasi dapat dilihat pada Gambar 4. Hasil analisis FTIR untuk ekstrak etanol setelah asetilasi menunjukkan adanya serapan pada bilangan gelombang 1764 cm -1 yang mempresentasikan adanya gugus asetil, sedangkan pada spektrum sebelum asetilasi tidak ditemukan. Begitu pula dengan hasil analisis FTIR dari ekstrak heksana, terdapat serapan pada bilangan gelombang 1767 cm -1, sedangkan pada spektrum sebelum asetilasi tidak ditemukan. Selain itu, jika dilihat dari keberadaan gugus OH, pada spektrum ekstrak etanol dan heksana sebelum asetilasi terdapat serapan yang lebar pada bilangan gelombang 3400 cm -1, sedangkan pada spektrum ekstrak setelah asetilasi juga ditemukan namun intensitasnya jauh lebih kecil. Reaksi asetilasi xantorizol juga dapat diduga berdasarkan efek konjugasi dan induksi dari gugus-gugus fungsi yang terlibat. Gugus asetil dari anhidrida asetat akan cenderung memilih terikat pada gugus fenol dibandingkan terikat pada cincin benzena dari struktur xantorizol. Hal ini dikarenakan efek induksi dari atom oksigen (O) yang lebih dominan dibandingkan efek konjugasi. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Ekstrak etanol dan heksana hasil asetilasi selanjutnya difraksinasi dengan KLTP menggunakan eluen heksana:etil asetat (10:1). Hasil kromatografi dapat dilihat pada Gambar 6. Hasil KLTP ekstrak etanol menghasilkan 8 fraksi, sedangkan ekstrak heksana menghasilkan 12 fraksi. Terlihat spot dugaan xantorizol terasetilasi berwarna kuning dengan nilai Rf sebesar 0.75 Dugaan xantorizol terasetilasi Gambar 6 Profil KLTP ekstrak etanol dan ekstrak heksana (6a) dan 0.71 (6b). Larik tersebut dikerok, lalu dilarutkan dalam etanol dan diuapkan dengan rotavapor untuk memperoleh fraksi xantorizol terasetilasi dari masing-masing ekstrak. Deasetilasi Fraksi xantorizol terasetilasi selanjutnya dideasetilasi dengan menggunakan resin penukar kation jenis Amberlite IR 120 tipe H + sehingga menghasilkan fraksi dugaan xantorizol dengan prinsip menukarkan kembali ion asetil yang diperoleh dari hasil asetilasi dengan ion H + yang berasal dari resin. Fraksi dugaan xantorizol tersebut dikarakterisasi dengan FTIR, HPLC, dan KLT analitik. Perbandingan spektrum IR ekstrak etanol dan heksana sebelum dan setelah asetilasi dapat dilihat pada Gambar 7. Hasil analisis FTIR ekstrak etanol menunjukkan adanya kembali serapan yang lebar pada bilangan gelombang cm -1 yang menunjukkan terbentuknya kembali gugus OH xantorizol. Kemudian telah hilangnya gugus asetil ditunjukkan dengan hilangnya pula serapan pada daerah 1700 cm -1. Hal ini menunjukkan bahwa reaksi deasetilasi berhasil dengan baik. Spektrum IR ekstrak heksana menunjukkan masih adanya serapan dengan intensitas cukup besar pada daerah serapan 1700 cm -1, sedangkan pada daerah serapan 3300 cm -1 terdapat serapan cukup lebar namun tidak terlalu berbeda dengan serapan sebelum deasetilasi. Dengan demikian xantorizol pada ekstrak heksana belum terdeasetilasi seluruhnya. Hasil analisis HPLC dugaan xantorizol dari ekstrak etanol dan heksana dapat dilihat pada Lampiran 9 dan 10. Berdasarkan hasil kromatogram ekstrak etanol, terlihat peak dugaan xantorizol dengan luas area cukup besar pada waktu retensi menit. Sama halnya pada kromatogram ekstrak heksana, terlihat peak dugaan xantorizol yang besar pada waktu retensi Jika dibandingkan dengan kromatogram standar xantorizol (Lampiran 8) yang menunjukkan waktu retensi xantorizol adalah menit, maka metode ini diduga berhasil mengisolasi xantorizol. Diketahui bahwa xantorizol pada ekstrak etanol memiliki persen area peak sebesar 78.15%, sedangkan xantorizol pada ekstrak heksana memiliki persen area peak sebesar 80.09%. Kemudian dari data luas area xantorizol masing-masing ekstrak diperoleh konsentrasi xantorizol pada ekstrak etanol sebesar ppm sedangkan pada ekstrak

4 7 Sebelum deasetilasi Setelah deasetilasi Sebelum deasetilasi Setelah deasetilasi heksana sebesar ppm. Dengan demikian xantorizol yang diperoleh pada ekstrak heksana memiliki kemurnian dan konsentrasi yang lebih tinggi dibandingkan pada ekstrak etanol. Namun berdasarkan perhitungan dengan standar, ekstrak etanol memiliki kemurnian 87.5%, sedangkan ekstrak heksana hanya 61.43%. Hasil KLT analitik dugaan xantorizol dapat dilihat pada Gambar 8. Spot dugaan xantorizol pada ekstrak etanol memiliki nilai Rf sebesar 0.49, sedangkan pada ekstrak heksana memiliki nilai Rf Hasil KLT dari kedua ekstrak menunjukkan masih adanya dua spot lain dengan nilai Rf 0.75 dan 0.81, sehingga metode modifikasi I ini belum berhasil mengisolasi xantorizol dengan murni. Spot lain yang muncul tersebut diduga salah Gambar 7 Perbandingan spektrum FTIR ekstrak etanol dan ekstrak heksana metode modifikasi I sebelum dan setelah deasetilasi satunya adalah xantorizol yang masih terasetilasi karena belum optimalnya proses deasetilasi yang dilakukan. Berdasrkan hasil perhitungan diketahui kandungan xantorizol total pada sampel adalah 3.9 x 10-5 %. Metode modifikasi I ini awalnya Dugaan xantorizol Gambar 8 Profil KLT ekstrak etanol dan ekstrak heksana hasil deasetilasi

5 8 merupakan verifikasi dari metode Asriani. Akan tetapi, hasil ekstraksi dengan etanol menghasilkan ekstrak kasar yang membentuk dua fase sehingga dilakukan partisi dengan heksana dan ternyata xantorizol justru lebih banyak terlarut di dalam heksana dibandingkan etanol. Hal ini menyebabkan tidak dapat dilakukannya verifikasi metode Asriani. Metode Modifikasi II Ekstraksi 250 g temu lawak dengan etanol 96% menghasilkan ekstrak kasar etanol sebanyak 27,1933 gram. Sama halnya dengan metode modifikasi I, hasil ekstraksi tersebut membentuk dua fase sehingga dilakukan partisi dengan heksana dan dihasilkan ekstrak dalam fraksi etanol sebanyak gram (23.57%), sedangkan ekstrak dalam fraksi heksana sebanyak gram (31.55%). Begitu pula dengan hasil analisis HPLC dari masing-masing ekstrak, kandungan xantorizol dalam fraksi heksana lebih besar daripada fraksi etanol. Pada Lampiran 6 dan 7 dapat dilihat bahwa area peak xantorizol pada fraksi heksana sebesar , sedangkan pada fraksi etanol hanya sebesar Dengan demikian, kandungan xantorizol pada fraksi etanol dan heksana masing-masing adalah ppm dan ppm. Hal ini disebabkan sifat xantorizol yang cenderung non-polar sehingga lebih terlarut ke dalam pelarut non-polar. Masing-masing ekstrak diekstraksi ulang dengan dietil eter menggunakan metode Najib (2008). Hal ini bertujuan untuk menghilangkan kemungkinan senyawa yg lebih non-polar dari xantorizol. Ekstraksi ulang dengan dietil eter menghasilkan ekstrak sebanyak gram (32.78%) untuk ekstrak etanol, dan gram (3.30%) untuk ekstrak heksana. Asetilasi masing-masing ekstrak dilakukan menggunakan metode yang sama dengan Asriani (2010), yaitu menggunakan piridin:asetat anhidrat (1:1, v/v). Dihasilkan ekstrak etanol sebanyak gram (85.99%) dan ekstrak heksana sebanyak gram (79.67%). Ekstrak sebelum dan sesudah asetilasi dianalisis dengan FTIR. Hasil analisis FTIR untuk ekstrak etanol dan heksana sebelum dan setelah asetilasi dapat dilihat pada Gambar 9. Hasil analisis FTIR untuk ekstrak etanol setelah asetilasi menunjukkan adanya serapan pada bilangan gelombang 1765 cm -1 yang mempresentasikan adanya gugus asetil, sedangkan pada spektrum sebelum asetilasi tidak ditemukan. Begitu pula dengan hasil analisis FTIR dari ekstrak heksana, terdapat serapan pada bilangan gelombang 1752 cm -1, sedangkan pada spektrum ekstrak sebelum asetilasi tidak ditemukan. Selain itu, sama halnya dengan ekstrak hasil metode modifikasi I, pada spektrum ekstrak etanol dan heksana sebelum asetilasi terdapat serapan yang lebar pada bilangan gelombang 3400 cm -1, sedangkan pada spektrum ekstrak setelah asetilasi juga ditemukan namun intensitasnya jauh lebih kecil. Hal ini menunjukkan bahwa proses asetilasi berhasil dilakukan namun efisiensi reaksi tidak mencapai 100%. Ekstrak etanol dan heksana hasil asetilasi selanjutnya difraksinasi dengan KLTP menggunakan eluen yang sama dengan metode Asriani (2010), yaitu heksana:etil asetat (10:1). Hasil KLTP menunjukkan terdapat 9 fraksi pada ekstrak etanol dan 11 fraksi pada ekstrak heksana. Terlihat spot dugaan xantorizol dengan nilai Rf sebesar Larik tersebut dikerok, lalu dilarutkan dalam etanol dan diuapkan dengan rotavapor untuk memperoleh fraksi xantorizol terasetilasi dari masing-masing ekstrak. Fraksi xantorizol terasetilasi selanjutnya dideasetilasi menggunakan resin penukar kation jenis Amberlite IR 120 sehingga menghasilkan fraksi dugaan xantorizol. Setelah itu fraksi dugaan xantorizol tersebut dikarakterisasi dengan KLT analitik, FTIR dan HPLC. Hasil KLT analitik dari kedua ekstrak dapat dilihat pada Gambar 10. Spot dugaan xantorizol pada ekstrak etanol memiliki nilai Rf 0.47, sedangkan pada ekstrak heksana memiliki nilai Rf sebesar Spot dugaan xantorizol pada ekstrak etanol memiliki nilai Rf lebih kecil karena laju elusi tidak lurus. Laju elusi sempat berbelok ke samping kiri. Profil kromatografi kedua ekstrak menunjukkan masih adanya beberapa spot lain sehingga xantorizol yang diperoleh dari metode ini masih belum murni. Diduga spotspot tersebut adalah senyawa turunan xantorizol yang masih terasetilasi. Perbandingan spektrum IR sebelum dan setelah deasetilasi dapat dilihat pada Gambar 11. Berdasarkan spektrum FTIR yang diperoleh, baik pada ekstrak etanol maupun heksana terlihat kembali serapan dengan intensitas yang cukup besar pada daerah serapan 3400 cm -1 yang menunjukkan telah terbentuknya kembali gugus OH dari xantorizol.

6 9 Sebelum asetilasi Setelah asetilasi Sebelum asetilasi Setelah asetilasi Gambar 9 Perbandingan spektrum FTIR ekstrak etanol dan ekstrak heksana metode modifikasi II sebelum dan setelah asetilasi Dugaan xantorizol Gambar 10 Profil KLT fraksi dugaan xantorizol ekstrak etanol dan ekstrak heksana metode modifikasi II Jika dilihat dari serapan gugus asetil, pada spektrum ekstrak etanol sudah tidak terdapat serapan pada daerah 1760 cm -1, namun pada ekstrak heksana masih terdapat serapan dengan intensitas rendah. Hal ini menunjukkan masih terdapatnya xantorizol yang belum terdeasetilasi. Hasil analisis HPLC ekstrak etanol dan heksana metode modifikasi dapat dilihat pada Lampiran 11 dan 12. Berdasarkan hasil kromatogram ekstrak etanol, terlihat peak dugaan xantorizol dengan luas area cukup besar pada waktu retensi menit. Sama halnya pada kromatogram ekstrak heksana, terlihat peak dugaan xantorizol yang besar pada waktu retensi Jika dibandingkan dengan kromatogram standar xantorizol

7 10 Sebelum deasetilasi Setelah deasetilasi Sebelum deasetilasi Setelah deasetilasi Gambar 11 Perbandingan spektrum FTIR ekstrak etanol dan ekstrak heksana metode modifikasi II sebelum dan setelah deasetilasi (Lampiran 8) yang menunjukkan waktu retensi xantorizol sebesar menit, maka metode modifikasi II ini diduga berhasil mengisolasi xantorizol. Diketahui bahwa xantorizol pada ekstrak etanol memiliki persen area peak sebesar 80.09%, sedangkan xantorizol pada ekstrak heksana memiliki persen area peak sebesar 88.07%. Kemudian dari data luas area xantorizol masing-masing ekstrak diperoleh konsentrasi xantorizol pada ekstrak etanol sebesar ppm sedangkan pada ekstrak heksana sebesar ppm. Namun berdasarkan perhitungan dengan menggunakan data kromatogram standar, xantorizol pada ekstrak etanol hanya memiliki kemurnian 62.5%, sedangkan pada ekstrak heksana hanya 65%. Xantorizol pada ekstrak heksana memiliki konsentrasi dan kemurnian yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak etanol. Berdasarkan hasil perhitungan xantorizol dari kedua ekstrak, diketahui kandungan xantorizol total pada sampel adalah 1.7 x 10-5 %. Dengan demikian metode ini b erhasil mengisolasi xantorizol namun belum 100% murni. Metode Modifikasi III Metode modifikasi III ini merupakan tambahan dari metode modifikasi I, yaitu dilakukan KLTP tahap II pada ekstrak hasil deasetilasi dari metode modifikasi I. Ekstrak

8 11 heksana dipilih karena memiliki kemurnian dan konsentrai yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak etanol. KLTP tahap II ini masih menggunakan eluen yang sama yaitu heksana:etil asetat (10:1). Hasil KLTP tahap II dicirikan dengan KLT analitik, HPLC, dan GC-MS. Profil KLT fraksi dugaan xantorizol hasil KLTP tahap II dapat dilihat pada Gambar 12. Terlihat bahwa hanya ada satu spot pada hasil KLT tersebut yang diduga adalah xantorizol dengan nilai Rf sebesar 0.42, sehingga metode ini diduga berhasil mengisolasi xantorizol dengan murni. xantorizol Gambar 12 Profil KLT dugaan xantorizol hasil KLTP tahap II Berdasarkan hasil analisis HPLC pada Lampiran 14, terlihat satu peak yang luas pada waktu retensi menit dengan luas area sebesar %. Jika dibandingkan dengan kromatogram standar xantorizol (Lampiran 13), waktu retensi xantorizol adalah menit dengan luas area sebesar %. Hal ini menunjukkan metode ini berhasil mengisolasi xantorizol dengan kemurnian yang lebih tinggi daripada standar xantorizol yang digunakan. Namun berdasarkan hasil perhitungan dengan menggunakan data kromatogram standar xantorizol, diketahui kemurnian xantorizol yang diperoleh adalah 90%. Kemudian pada hasil analisis HPLC terlihat masih adanya dua peak lain yang muncul yaitu pada waktu retensi dan menit dengan persen area masingmasing sebesar 1.435% dan 0.961%. Jika diperhatikan, pada semua hasil analisis HPLC baik standar xantorizol maupun sampel, selalu muncul peak pada waktu retensi sekitar 2.4 menit, sehingga diduga peak yang muncul tersebut merupakan pelarut. Dengan demikian hasil analisis HPLC menunjukkan bahwa xantorizol yang diisolasi masih belum murni karena masih ditemukan campuran dengan satu senyawa lain yang belum teridentifikasi Hal ini dibuktikan pula dengan hasil analisis GC-MS pada Lampiran 15. Berdasarkan hasil analisis, diperoleh dua puncak pada waktu retensi dan menit. Puncak pada waktu retensi 11.4 menit dipastikan merupakan xantorizol dengan BM 218.0, sedangkan puncak pada waktu retensi teridentifikasi sebagai senyawa 2- etoksikarbonil benzotiazol. Jika dibandingkan dengan puncak pada waktu retensi 11.36, puncak xantorizol memiliki luas area yang jauh lebih besar yaitu , sedangkan puncak pada waktu retensi hanya memiliki luas area , sehingga jika xantorizol tersebut dianggap murni 100%, maka pengotor pada isolat tersebut sebesar 6.09%. Akan tetapi berdasarkan perhitungan total keseluruhan, diperoleh luas area sebesar 94.26% untuk xantorizol, dan 5.74% untuk senyawa 2-etoksikarbonil benzotiazol. Puncak lain yang muncul tersebut memiliki waktu retensi yang cukup berdekatan dengan xantorizol. Hal ini menunjukkan senyawa tersebut memiliki kepolaran yang hampir sama dengan xantorizol sehingga sulit dipisahkan. Dengan demikian metode modifikasi III ini pun belum berhasil mengisolasi xantorizol dengan kemurnian 100%, yaitu hanya diperoleh xantorizol dengan kemurnian 97.60%. Perbandingan Hasil Isolasi Xantorizol menggunakan Metode Asriani dengan Metode Modifikasi Perbandingan kemurnian dan rendemen xantorizol hasil isolasi menggunakan metode Asriani dengan metode modifikasi dapat dilihat pada tabel di bawah ini. Tabel 1 Data kemurnian dan rendemen xantorizol hasil isolasi dengan metode Asriani dan metode modifikasi Metode Asriani etanol Modifikasi I etanol heksana Modifikasi II etanol heksana Modifikasi III heksana Kemurnian Kemurnian Rendemen (%) a (%) b (%) a berdasarkan persen area (HPLC) b berdasarkan perhitungan dengan standar