HASIL DAN PEMBAHASAN

Transkripsi

1 HASIL DAN PEMBAHASAN RT-PCR Konvensional dan Real Time Percobaan membandingkan RT-PCR konvensional dan real time dilakukan untuk mengetahui perbedaan sensitivitas kedua uji dalam mendeteksi VAI H5. Virus yang digunakan sebagai kontrol positif (A/chicken/Indonesia/SmiWN 18/2009; GenBank accession number: JF302895) diencerkan secara serial 1:1 kemudian diekstraksi dan dilakukan RT-PCR H5 secara konvensional maupun real time. Dengan RT-PCR konvensional, virus dapat terdeteksi hingga pengenceran 2-14 sedangkan menggunakan teknik real time, virus dapat terdeteksi hingga pengenceran 2-22 (Gambar 5). Perbedaan pengenceran hingga 2 8 ini menunjukkan bahwa RRT-PCR dapat mendeteksi sampel dengan konsentrasi hingga 250 kali lebih rendah dibandingkan RT-PCR konvensional. Lee dan Suarez (2004) menemukan bahwa RRT-PCR H5 memiliki limit deteksi salinan gen atau 10 EID 50 dan kuantitas RNA yang ditentukan dengan metode RRT-PCR berkorelasi erat dengan EID 50 yang ditentukan dengan metode isolasi virus pada embrio ayam. a b Gambar 5. Perbandingan hasil PCR konvensional dan real time (a) elektroforesis gel RT-PCR konvensional, H5 terdeteksi hingga pengenceran 2-14 dan (b) grafik amplifikasi RRT-PCR hingga pengenceran Pada pengenceran virus 2-6 diperoleh nilai C t 19,97 sehingga pengenceran ini digunakan untuk mengencerkan stok virus yang kemudian diekstraksi dan RNA hasil isolasi dibagi kedalam tabung-tabung berisi 8 µl untuk digunakan sebagai kontrol positif PCR. Pembagian kontrol kedalam tabung-tabung dengan

2 37 volume satu atau dua kali run dilakukan untuk menghindari frezee-thaw. Untuk kontrol positif isolasi RNA, stok virus diencerkan 2-15 dan dibagi kedalam tabungtabung berisi 100 µl sehingga dapat digunakan pada dua kali isolasi RNA. Gambar 6. Grafik amplifikasi real time RT-PCR (a) matriks sampel bulan kedua dan (b) subtipe H5 berbagai bulan pengambilan sampel. Grafik eksponensial yang melewati threshold (garis hijau) menunjukkan hasil positif sedangkan background noise di bawahnya merupakan hasil negatif.

3 38 Gambar 6 menunjukkan hasil RRT-PCR MA sampel bulan kedua dan H5 berbagai bulan pengambilan sampel dengan kontrol positif dan negatif isolasi RNA dan PCR Teknik RT-PCR konvensional mendeteksi RNA setelah reaksi PCR selesai dan dilanjutkan dengan elektroforesis gel yang memerlukan waktu serta melibatkan bahan kimia berbahaya seperti etidium bromida dan sejenisnya. Sedangkan bahan kimia yang digunakan dalam RRT-PCR lebih aman dan memungkinkan deteksi dilakukan pada tahap awal reaksi sehingga dalam hal ini teknik real time lebih menguntungkan dibandingkan konvensional. Secara konvensional hasil yang diperoleh bersifat kualitatif sedangkan secara real time hasil yang diperoleh merupakan konsentrasi relatif RNA target dalam bentuk nilai C t dari perpotongan antara kurva amplifikasi dengan garis threshold. Influenza A Tingkat kesepakatan antara pengujian RRT-PCR matriks (MA RRT-PCR) untuk mendeteksi keberadaan virus influenza A dan isolasi virus pada embrio ayam tidak 100% sehingga RRT-PCR MA positif/isolasi virus negatif dan RRT- PCR MA negatif/isolasi virus positif pada sampel usap dapat terjadi (Spackman et al. 2002; Cattoli et al. 2004). Sensitivitas diagnostik relatif RRT-PCR terhadap isolasi virus adalah 85,1% dengan spesifisitas 98,9% (Elvinger et al. 2007) sehingga hasil RRT-PCR diinterpretasikan pada tingkat kandang/peternakan daripada tingkat individu. Dari sampel yang diharapkan, berhasil dikoleksi sampel karena faktor kematian atau itik yang tidak ditemukan saat pengambilan sampel. Virus influenza A dapat ditemukan di ketiga tipe peternakan, dan telah ada sejak awal pengambilan sampel di peternakan tipe 1 dan 2. Pada peternakan tipe 1, VAI terdeteksi hampir setiap bulan pengambilan sampel kecuali Januari (Tabel 2). Keberadaan VAI di peternakan tipe 2 terdeteksi saat screening di bulan September, Desember, Januari, dan Maret. Sedangkan pada peternakan tipe 3, VAI hanya ditemukan di akhir pengambilan sampel bulan Maret pada sampel usap kloaka dan orofaringeal itik sentinel maupun non sentinel. Dari total 614 pool sampel usap kloaka dan orofaringeal yang diambil selama tujuh bulan, didapati 98 (16%) pool positif VAI. Perbandingan usap

4 39 kloaka positif hampir seimbang dengan usap orofaringeal yaitu masing-masing 52 (53,1%) dan 46 (46,9%) dengan nilai C t yang bervariasi (Tabel 2). Virus AI terdeteksi secara berulang sejak saat screening pada bulan September di tiga peternakan dari tipe 1 dan 2. Umumnya pengulangan terjadi pada dua waktu pengambilan sampel kemudian virus menghilang dan terdeteksi kembali pada bulan berikutnya atau virus hilang timbul pada tingkat pool dari waktu ke waktu pengambilan sampel. Di tingkat peternakan, VAI dapat ditemukan hampir setiap bulan pada peternakan tipe 1, kecuali bulan Januari pada P1 dan Januari-Februari pada P2. Pada peternakan tipe 2 VAI lebih jarang ditemukan dan hanya berulang pada P3 yaitu September, Desember, dan Januari. Sedangkan pada P4 VAI hanya ditemukan di bulan Maret setelah itik dalam peternakan diganti dengan itik yang dibeli dari peternak lain. Hal ini menunjukkan peran introduksi itik baru dalam penularan VAI pada peternakan itik angon. Tabel 2. Virus AI di tiga tipe peternakan itik angon Kabupaten Indramayu. Peternakan Waktu pengambilan sampel C t MA Subtipe H5 September Oktober November Tipe 1 Desember Januari Februari Maret September Oktober November Tipe 2 Desember Januari Februari Maret September Oktober November Tipe 3 Desember Januari Februari Maret Pengulangan kemunculan VAI dalam peternakan menunjukkan bahwa VAI bersirkulasi di satu peternakan untuk waktu yang lama dan mungkin melibatkan lebih dari satu strain virus meskipun shedding virus terjadi dalam rentang waktu tertentu pada tingkat pool. Penelitian eksperimental pada itik berumur 2-16

5 40 minggu yang diinfeksi virus A/Mallard/MN/ /00 (H5N2) mengeluarkan virus yang terdeteksi dengan RRT-PCR hingga hari ke 16 pascainfeksi kemudian virus tidak terdeteksi pada hari ke 21 (Costa et al. 2010). Percobaan lain menunjukkan bahwa itik yang direinokulasi setelah 28 hari pascainfeksi awal dengan virus yang sama (LPAI H7N2) tidak mengeluarkan virus melalui kloaka maupun trakhea (Kida et al. 1980). Namun infeksi yang pernah terjadi tidak dapat melindungi itik terhadap infeksi berikutnya oleh subtipe virus lain. Sebagai contoh, itik yang diinfeksi subtipe H4N6 terlindungi dari infeksi ulang dengan virus yang sama tetapi mengeluarkan virion selama 8 hari setelah ditantang dengan isolat H11N3 (Austin dan Hinshaw 1984). Tabel 3. Persentase sampel usap kloaka/orofaringeal positif di 6 peternakan itik Tipe P VAI Sep-N Sep Okt Nov Des Jan Feb Mar Mar-N MA 0/0 0/33 33/50 17/17 33/17 0/0 0/0 20/0 17/0 1 H5 0/0 0/0 10/33 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 1 MA 17/0 17/0 33/17 0/0 67/17 0/0 17/0 33/100 33/50 2 H5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/4 0/0 MA 50/50 50/17 0/0 0/0 33/0 67/67 0/0 0/0 0/0 3 H5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 94/71 0/0 0/0 0/0 2 MA 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 67/33 50/100 4 H5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 8/0 0/43 MA 0/0 0/0 0/0 17/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 5 H5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 3 MA 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 100/ /100 6 H5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 Virus AI lebih banyak ditemukan pada peternakan tipe 1, diikuti tipe 2, dan terendah pada peternakan tipe 3 selama periode pengambilan sampel. Pada P1 dan P2 (tipe 1) terlihat pola pengulangan kemunculan VAI yang mirip satu sama lain. Pada P3 dan P4 (tipe 2) pengulangan kemunculan VAI hanya terjadi pada P3 yang memelihara itik hasil penetasan sendiri dengan wilayah angon sempit yaitu disekitar kandang. Sedangkan pada P4 yang wilayah angonnya lebih luas dan berinteraksi dengan P2 (tipe 1), VAI terdeteksi pada sampel usap sentinel pada bulan akhir pengambilan sampel di lokasi yang sama dan setelah keduanya mengganti itik. Hal ini menunjukkan bahwa kesamaan wilayah angon mungkin mempengaruhi kemunculan VAI pada peternakan, sama seperti kontak intensif antar itik dalam satu peternakan dan introduksi itik baru. Pada P5 dan P6 (tipe 3), hanya salah satu peternakan yang terdeteksi VAI positif yaitu di akhir pengambilan sampel sehingga tidak terlihat adanya pengulangan. Perbedaan

6 41 penemuann VAI dalam satu tipe peternakann ini menunjukkan bahwa kemunculan VAI sangat dipengaruhi oleh keadaan lingkungan masing-masingg peternakan. Itik yang selalu dikandangkan memiliki kecenderungan lebih sedikit/jarang mengeluarkan virus influenza A karena kebersihan dan keamanan biologis lebih mudah untuk dikendalikan. Namun bila terjadi infeksii maka penularan juga akan lebih mudah akibat kontak intensif antar itik dalam kandang seperti terjadi pada P6 di akhir pengambilan sampel pada bulan Maret (Tabel 3). Subtipe H5 Virus AI subtipe H5 hanya ditemukan pada peternakann tipe 1 dan 2 (Gambar 7). Dari total 98 sampel pool yang positif terhadap influenza A, diperiksa 453 sampel individu dan didapati 49 (10,9%) sampel yang positif terhadap subtipe H5 dengan perbandingann sampel usap kloaka dan orofaringeal positif H5 masing-masing 18 (36,7%) dan 31 (63,3%). Hal ini menunjukkan bahwa itik angon yang diteliti mengeluarkan VAI subtipe H5 lebih sering melalui saluran pernafasan dibandingkann pencernaan. 60% Tipe 1 60% Tipe 2 Tipe 3 50% 50% 60% 40% 40% 50% 30% 20% 10% 30% 20% 10% 40% 30% 20% 10% 0% 0% 0% Sep-09 N Sep-09 Okt-09 Nov-09 Des-09 Jan-10 Feb-10 Mar-10 Mar-10 N Sep-09 N Sep-09 Okt-09 Nov-09 Des-09 Jan-10 Feb-10 Mar-10 Mar-10 N Sep-09 N Sep-09 Okt-09 Nov-09 Des-09 Jan-10 Feb-10 Mar-10 Mar-10 N Kloaka Orofaring H5 Kloaka H5 Orofaring Gambar 7. Distribusii temporal VAI di tiga tipe peternakan itik angon Subtipe H5 erdeteksi pada sampel usap kloaka dan orfaringeal di peternakann tipe 1 (P1 Oktober, P2 Maret) dan tipe 2 (P3 Januari, P4 Maret). Tidak seperti kemunculan virus influenza A, subtipe H5 tidak ditemukan secara berulang di tingkat peternakan. Hal ini menunjukkan bahwa subtipe H5 dapat muncul di satu peternakan namun tidak bertahan lamaa karena kemudian menghilang seiring

7 42 kematian itik yang terinfeksi atau pembersihan virus (clearance). Temuan ini didukung oleh hasil penelitian yang menginfeksi virus H5N1 HPAI maupun LPAI pada itik dan menghasilkan shedding virus terdeteksi hingga hari ke pascainfeksi kemudian virus menghilang (Hulse-Post et al. 2005). Jumlah VAI subtipe H5 yang ditemukan bervariasi selama pengambilan sampel. Dilihat dari tipe peternakan, VAI H5 lebih banyak ditemukan pada tipe 2, diikuti tipe 1, dan tidak ditemukan pada tipe 3 (Tabel 4). Pada P1 dan P2 (tipe 1) subtipe H5 lebih banyak ditemukan pada sampel usap orofaringeal. Subtipe H5 ditemukan di P1 setelah sebelumnya 10 ekor sentinel mati. Temuan ini membuka kemungkinan bahwa virus yang ada di peternakan tipe 1 merupakan HPAI pada itik yang dicirikan oleh virus lebih tinggi/sering ditemukan pada usap orofaringeal dibandingkan usap kloaka (Sturm-Ramirez et al. 2004; Keawcharoen et al. 2008). Hal ini juga didukung oleh hasil penelitian yang menginfeksi itik dengan isolat HPAI H5N1 setelah 2002 dan menemukan bahwa shedding virus melalui trakhea secara signifikan lebih tinggi dibandingkan kloaka (Sturm-Ramirez et al. 2005) terlepas dari rute infeksi. Penemuan VAI H5 yang kemungkinan merupakan HPAI pada peternakan tipe 1 yang sepenuhnya memelihara itik dengan cara diangon ini dikhawatirkan akan berdampak pada penyebaran virus ke lingkungan maupun unggas lain dalam wilayah yang luas. Hal senada juga dilaporkan oleh Gilbert (2006) yang menemukan keterkaitan erat antara tingginya H5N1 di Thailand dengan besarnya jumlah itik angon yang didukung oleh luasnya pertanian basah serta tingginya populasi unggas darat, dan manusia. Tabel 4. Virus AI subtipe H5 di peternakan itik angon, Indramayu Tipe P Keadaan Asal itik Bulan Rute Jml C t peternakan 10 ekor sentinel mati Penetasan Oktober kloaka sendiri orofaringeal itik baru, 4 ekor Peternakan Maret orofaringeal sentinel mati lain kematian meningkat, Penetasan Januari kloaka ekor sentinel mati sendiri orofaringeal itik baru, 3 ekor Peternakan Maret kloaka sentinel mati lain 4 Maret- orofaringeal NS

8 43 Padaa P3 (tipe 2) 2 VAI H5 lebih l banyaak ditemukaan pada sam mpel usap kloaka k di bulan Januari mengikuti kemaatian 2 itik sentinel (terrendah dianntara peternakan) dengan ratta-rata konssentrasi viruus yang diek kskresikan melalui klooaka sedikit lebih tinggi dibbandingkan orofaring, terlihat darri nilai Ct masing-mas m sing 27,68 (STD 5,32) dan 27,83 (STD D 5,64). Hall ini membu uka kemunggkinan bahw wa VAI H5 di P3 tersebut merupakan m v virus LPAI pada itik yang y dicirikaan oleh jum mlah usap kloaka k positif lebbih tinggi dibbandingkann orofaringeeal dan biasaanya ditularrkan melalu ui rute fekal-oral (Webster et e al ). Temuan yang bertoolak belakaang dengan hasil ni bisa saja terjadi karrena situs utama u yang dipeeroleh padaa peternakann tipe 1 in infeksi VA AI sebelum tahun yang umumnya tidakk patogen paada itik adallah di epitel saluuran pencernnaan (Websster et al ). a b Gambar 8. Distribusii wilayah angon itik k Kabupatenn Indramayyu. (a) wiilayah angon keeenam peteernakan dan n (b) lokassi peternakkan tipe 3 yang didatangi peternakann angon pad da bulan terrtentu. Angkka menunju ukkan bulan pengambilan sampel (1 1-6 = Oktoober-Maret)). Angka merah m menunjukkkan bulan ditemukan d subtipe s H5.

9 44 Meskipun sesama tipe 2 yang memelihara itik dengan cara dikandangkan dan diangon, P3 memiliki luas wilayah angon yang lebih sempit dibandingkan P4 (Gambar 8). Hal ini menjadi alasan mengapa infeksi VAI H5 lebih tinggi pada P3 dibandingkan P4, mengingat wilayah yang sempit meningkatkan intensitas kontak antar itik dalam kandang. Temuan ini didukung oleh hasil penelitian yang melaporkan bahwa kepadatan populasi dapat meningkatkan prevalensi (Okazaki et al. 2000; Munster et al. 2007; Wallensten et al. 2007). Pada P4 yang wilayah angonnya lebih luas dibandingkan P3 (sesama tipe 2) dan berpotongan dengan P2 (tipe 1) di bulan yang sama dengan penemuan VAI H5 yaitu Maret, subtipe H5 lebih banyak ditemukan pada sampel usap orofaringeal itik non-sentinel yang baru dibeli dari peternak lain (sama seperti P2) (Gambar 8). Hal ini menimbulkan kecurigaan bahwa itik sentinel terpapar pada virus yang dibawa oleh itik baru dari tempat pembibitan meskipun perpotongan wilayah angon juga dapat berperan dalam meningkatkan kontak itik antar peternakan. Namun demikian, penularan yang terjadi tidak berlangsung intensif karena kerenggangan populasi (Hinshaw et al. 1985) sehingga prevalensi VAI H5 pada P4 lebih rendah dibandingkan P3. Keberadaan VAI H5 pada itik angon dalam penelitian ini menunjukkan indikasi bahwa populasi itik angon berperan penting sebagai reservoir dan pembawa VAI H5 yang efektif serta berpotensi mempertahankan keberadaan dan menyebarkan virus ke lingkungan maupun unggas lain yang rentan.