I. PENDAHULUAN. A. JUDUL Isolasi DNA secara Sederhana.

Transkripsi

1 A. JUDUL Isolasi DNA secara Sederhana. I. PENDAHULUAN B. TUJUAN Praktikum ini bertujuan untuk memperkenalkan mahasiswa metode ekstraksi DNA secara sederhana dengan mempergunakan alat adan bahan yang umum ditemui, melakukan eksperimen sederhana tentang bahan materi sumber DNA dan membandingkan secara kuantitaif hasil ekstraksi DNA yang diperoleh dari materi sumber DNA tersebut.

2 II. METODE A. ALAT DAN BAHAN Alat yang dipergunakan dalam praktikum ini antara lain test tube, gelas beker, gelas ukur, saringan kopi, pro pipet, pipet ukur, blender dan rak tabung reaksi. Bahan yang dipergunakan dalam praktikum ini antara lain bawang putih, buah stroberi, saliva, larutan deterjen, jus nanas, pelunak daging, ethanol 70% dingin dan ethanol 90% dingin. B. CARA KERJA Sampel bawang putih atau buah stroberi sebanyak 20 gram ditambah dengan larutan deterjen sebanyak 100 ml dan diblender selama 1 menit. Kemudian sampel disaring dengan saringan kopi ke gelas beker dan ditambah dengan pelunak daging atau jus nanas sebanyak 30 ml. Untuk saliva, sampel sebanyak 10 ml ditambah dengan larutan deterjen sebanyak 10 ml dan diaduk sampai rata. Kemudian ditambah dengan pelunak daging atau jus nanas sebanyak 10 ml. Filtrat bawang putih atau buah stroberi atau saliva sebanyak 6 ml dimasukkan ke dalam tabung test dan ditambah dengan ethanol dingin 70% atau 90% sebanyak 6 ml (secara perlahan dan dimasukkan melalui dinding tabung test). DNA perlahan naik ke larutan ethanol dan hasil kuantitatif DNA secara visual dicatat.

3 III. HASIL DAN PEMBAHASAN A. HASIL B. PEMBAHASAN DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, plastida dan sentriol. Molekul DNA pada nukleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran (Suryo, 2012). Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007). Menurut Sadava (2004), DNA memiliki fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh. Hal tersebut disebabkan oleh DNA yang merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk hidup. Fungsi-fungsi DNA adalah: 1. Sebagai tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup 2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh 3. Fungsi autokatalis, DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri Menurut Jamilah (2005), isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapantahapan antara lain: preparasi esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Menurut Elrod (2007), dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara mekanik atau fisik dengan menumbuk atau menggerus bahan yang akan kita gunakan dengan mortar atau

4 blender. Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA) bisa keluar. Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan (Elrod, 2007). Teknik ekstraksi DNA adalah faktor penentu keberhasilan tahap selanjutnya. Berbagai teknik atau metode dapat dilakukan tergantung dari jenis tanaman, organ tanaman atau jaringan tanaman yang digunakan. Tetapi pada dasarnya ada tiga faktor penentu dalam ekstraksi secara optimal yaitu penghomogenan jaringan tanaman, Komposisi penambahan larutan pada saat penggerusan daun/jaringan tanaman sampel, dan penghilangan enzim penghambat polisakarida khususnya untuk tanaman tahunan (Syafaruddin dan Santoso, 2011). Menurut Lewis (2003), prinsip kerja dari ekstraksi DNA, yaitu: 1. Preparasi sel/jaringan 2. Lisis membran sel/organella (nukleus) 3. Denaturasi senyawa organik 4. Presipitasi DNA 5. Pencucian Menurut Zubaidah (2004) isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapantahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel, dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda. Hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air pada setiap buah berbeda antara satu dengan lainnya sehingga dapat memberikan hasil yang berbeda-beda pula.

5 Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi akan menjadi sedikit. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA, prinsip kerja isolasi DNA yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung sedangkan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Maulana dkk., 2010). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah yaitu pelet dan supernatan. Pelet tersusun atas strukturstruktur yang lebih besar yang mengumpul pada bagian bawah tabung reaksi sedangkan supernatant tersusun atas bagian-bagian sel yang lebih kecil yang tersuspensi dalam cairan di atas pelet (Campbell dkk., 2002). Dalam proses isolasi DNA diperlukan beberapa bahan seperti detergen, NaCl, dan etanol dingin. Detergen berfungsi untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA karena deterjen mengandung sodium dodesil sulfat (SDS) yang dapat menghilangkan molekul lipid pada membran sel sehingga membran akan menjadi rusak dan lisis. NaCl berfungsi untuk pemekatan dan memisahkan DNA dari larutan sebagai purifikasi DNA. Penambahan etanol dingin setelah pemberian NaCl bertujuan untuk memisahkan DNA dengan pellet yang diendapkan pada dasar tabung Ependorf. Pellet dapat mengendap karena etanol memiliki kerapatan yang lebih kecil daripada air sehingga DNA yang mengandung gelembung akan naik ke lapisan larutan etanol. Pada proses isolasi DNA secara sederhana, dilakukan sentrifugasi secara sederhana dengan menggunakan blender yang tujuan untuk mengendapkan dan membuat DNA menempel di dasar tabung Ependorf (Campbell dkk., 2002). Presipitat DNA terlihat seperti serabut-serabut putih yang terkumpul diatas permukaan larutan karena masa jenis etanol lebih kecil dari pada masa jenis air. Etanol yang digunakan harus benar-benar dingin dan berasal dari lemari pendingin, hal ini bertujuan untuk menyempurnakan presipitasi. Apabila etanol yang digunakan kurang dingin, maka mengakibatkan pembentukan presipitat kurang sempurna. Menurut Doyle, (1987) dalam proses pembuatan sumber DNA untuk isolasi DNA hendaknya jangan terlalu encer karena semakin encer sumber

6 DNA, DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit kerena sel yang lisis di dalam air tentu lebih sedikit jika dibandingkan dengan sumber DNA yang lebih kental. Menurut Prima (2010), setiap maksud penggunaan DNA yang beragam membutuhkan persyaratan kualitas DNA yang berbeda. Kualitas DNA tersebut ditentukan oleh hal-hal berikut: 1. Kemurnian 2. Panjang DNA 3. Kemampuan untuk dipotong oleh sembarang enzim 4. Tidak mengalami modifikasi kimiawi selama proses isolasi berlangsung Zat pelunak daging biasanya mengandung enzim papain yang diekstrak secara halus serta memiliki konsentrasi enzim protease yang lebih tinggi. Sedangkan enzim bromelin diperoleh dari bonggol tengah nanas secara sederhana dari jus nanas. Zat pelunak daging dan enzim bromelin memiliki kandungan dasar yang sama yaitu protrease yang berfungsi untuk memecah ikatan protein pada strawberry dan bawang putih. Papain merupakan enzim protease yang terkandung dalam getah pepaya, baik dalam buah, batang, dan daunnya. Papain dapat digunakan dalam industri pengolahan daging. Enzim papain dapat mempercepat empuknya daging karena enzim papain dapat mencerna protein. Kerja papain yang paling efektif pada temperatur C (Tarwotjo, 1998). Bromelin merupakan enzim yang terdapat dalam bonggol buah nanas. Enzim ini memiliki kemampuan untuk memecah molekul-molekul protein menjadi bentuk yang lebih sederhana (asam amino). Untuk melunakkan daging enzim ini memerlukan waktu ±15 menit (Suprapti, 2008). Bawang Putih Tanaman bawang putih bisa ditemukan dalam bentuk terna (bergerombol), tumbuh tegak, dan mencapai tinggi cm. Dari tunas daun akan tumbuh umbiumbi kecil yang disebut dengan siung. Kandungan kimia dalam bawang putih per 100 gram ialah air (66,2-71,0 gram), kalori ( kal), kalsium (26-42 mg), saltivine, sulfur ( mg), protein (4,5-7 gr), lemak (0,2-0,3 gr), karbohidrat

7 (23,1-24,6 gr), fosfor ( mg), besi (1,4-1,5 mg), vitamin A, vitamin B, vitamin C, kalium ( mg), selenium, dan scordinin (Purwaningsih, 2007). Menurut Anonim a (2012), taksonomi dari tanaman bawang putih adalah: Kingdom : Plantae (Tumbuhan) Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) Kelas : Liliopsida (berkeping satu / monokotil) Sub Kelas : Liliidae Ordo : Liliales Famili : Liliaceae (suku bawang-bawangan) Genus : Allium Spesies : Allium sativum L. Straberry Buah stroberi (Fragaria vesca L.), yang berasal dari benua Amerika, pertama kali ditemukan di Chili dengan jenis Fragaria chiloensis L., namun yang persebarannya sangat pesat hingga masuk ke Indonesia adalah jenis Fragaria vesca L. Buah stroberi mengandung bahan-bahan aktif seperti salicilic acid, ellagic acid, katekin,dan antosianin. Taksonomi Klasifikasi botani tanaman strawberry adalah sebagai berikut : Kingdom Divisi Sub divisi Kelas Keluarga Genus Spesies : Plantae : Spermatophyta : Angiospermae : Dicotyledonae : Rosaceae : Fragaria : Fragaria sp. Nanas Nanas merupakan tanaman buah berupa semak yang memiliki nama ilmiah Ananas comosus. Bagian utama yang bernilai ekonomi penting dari tanaman nanas adalah buahnya. Rasa buah nanas manis sampai agak masam segar, sehingga disukai masyarakat luas. Di samping itu, buah nanas mengandung gizi cukup tinggi dan lengkap. Buah nanas mengandung enzim bromelain, yaitu enzim protease yang dapat menghidrolisa protein, protease atau peptida sehingga dapat digunakan untuk melunakkan daging (Anonim, 2000).

8 Menurut Anonim b (2012), taksonomi dari tanaman nanas adalah: Kingdom : Plantae (Tumbuhan) Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) Kelas : Liliopsida (berkeping satu / monokotil) Sub Kelas : Commelinidae Ordo : Bromeliales Famili : Bromeliaceae Genus : Ananas Spesies : Ananas comosus Merr. Faktor yang memengaruhi proses pemisahan DNA, yaitu jumlah materi sumber DNA yang banyak menyebabkan pemisahan DNA semakin lama atau pun sebaliknya, jenis atau bagian organisme sumber DNA, konsentrasi senyawa samping, ukuran molekul DNA, dan penggunaan buffer (seperti pelunak daging dan jus nanas pada percobaan ini) DNA yang telah terpisah dari komponen sel lainnya akan melayang-layang pada tabung reaksi, berbentuk seperti potongan-potongan benang. Semakin banyak jumlah sumber DNA yang digunakan maka semakin banyak hasil DNA dapat diperoleh, begitu pula sebaliknya jika pemakaian jumlah sumber DNA sedikit maka semakin sedikit hasil DNA diperoleh. Sebelum ditambahkan larutan etanol 90% ke dalam tabung reaksi yang telah tersedia materi DNA, pemisahan DNA belum terlihat antara komponen sel lainnya. Ketika sudah ditambahkan larutan etanol melalui dinding tabung dan didiamkan selama 2-3 menit baru terlihat adanya protein berwarna putih dan menggumpal naik ke permukaan. Pemisahan protein juga diikuti dengan pemisahan DNA yang terlihat melayang pada tabung reaksi. Jenis protease yang digunakan juga memengaruhi hasil akhir dari pemisahan DNA nya. Enzim papain yang terdapat pada pelunak daging akan memberikan pemisahan DNA yang lebih bagus dan jernih dibandingkan dengan enzim bromelin yang didapat dari jus nanas. Isolasi DNA yang dilakukan secara sederhana memiliki beberapa keuntungan diantaranya alat dan bahan yang digunakan mudah ditemukan, biaya yang relatif murah, dan memerlukan waktu yang relatif singkat. Di samping itu terdapat kelemahan pada metode secara sederhana yaitu sulit dalam pengambilan sampel DNA karena kemungkinan besar ketika diambil sampelnya, protein atau

9 komponen sel lainnya ikut terbawa, DNA yang diperoleh hanya untuk mengetahui keberadaan DNA pada suatu organisme, dan tidak dapat dilakukan uji selanjutnya seperti yang diuji melalui alat elektroforesis. Percobaan pertama yang dilakukan adalah mengetahui pengaruh jenis sampel terhadap kuantitas DNA. Sampel yang digunakan adalah bawah putih dan buah stroberi. Pada percobaan ini digunakan jus nanas sebagai sebagai enzim lisis. Diketahui jus nanas mengandung enzim papain yang dapat aduh aku lupa tlg tambahin dong.dari percobaan ini bawang putih didapati untai DNA yang sangat sedikit (+), sedangkan sampel buah stroberi didapat hasil untai DNA yang sedikit (++). Buah stroberi didapati memiliki lebih banyak untai DNA karena buah stroberi memiliki inti sel yang banyak (oktaploid), sehingga lebih mudah terlihat dibandingkan bawang putih. Percobaan selanjutnya yaitu mengetahui pengaruh enzim lisis terhadap kuantitas DNA. Pada percobaan ini sampel yang digunakan adalah bawang putih. Enzim lisis yang digunakan yaitu jus nanas dan pelunak daging. Diketahui pelunak daging dan jus nanas memiliki kemanpuan dalam memisahkan DNA dari komponen lain seperti bagian sel yang lain dan denaturasi senyawa organik.dari percobaan yang telah dilakukan, sampel bawang putih dengan menggunakan enzim lisis jus nanas didapati jumlah untai DNA yang sangat sedikit (+). Sedangkan bawang putih dengan menggunakan enzim lisis pelunak daging didapati terdapat jumlah untai DNA yang cukup banyak (+++). Dari hasil tersebut diketahui jumlah untai DNA terbanyak didapat pada sampel bawang putih dengan menggunakan enzim lisis pelunak daging. Hal tersebut membuktikan bahwa enzim lisis pelunak daging lebih baik dibandingkan jus nanas untuk memisahkan DNA bawang putih. Percobaan selanjutnya yang dilakukan yaitu untuk mengetahui pengaruh konsentrasi ethanol terhadap kuantitas DNA. Sampel yang digunakan pada percobaan ini yaitu saliva yang didapat dari praktikan. Enzim lisis yang digunakan pada percobaan ini adalah jus nanas. Konsentrasi ethanol yang digunakan yaitu ethano dengan konsentrasi 70% dan ethanol dengan konsentrasi 90%. Ethanol sendiri digunakan untuk presipitasi DNA karena perbedaan polaritasnya. Dari

10 percobaan yang telah dilakukan didapat hasil sampel saliva dengan menggunakan konsentrasi ethanol didapati jumlah untai DNA yang sangat sedikit. Sedangkan untai DNA saliva dengan pemeberian konsentrasi 90% didapati jumlah untai DNA yang cukup banyak. Dari hasil tersebut menyatakan bahwa semakin banyak konsentrasi ethanol maka hasil yang didapatkan semakin baik. DAPUS :. Anonim Nanas (Ananas comusus). pertanian/nenas.pdf. 24 Maret Anonim a Bawang Putih. plant= Maret Anonim b Nanas Maret Campbell, N. A., Reece, J. B., dan Mitchell, L. G Biologi. Jilid 1. Edisi Kelima. Erlangga. Jakarta. Lewis, R., Human Genetics: Concepts and Applications. The McGraw- Hills Company, Inc. Boston. Maulana, R., dkk Isolasi DNA Tanaman dan Elektroforesis DNA. Jurusan Pendidikan Biologi. Universitas Pendidikan Indonesia. Purwaningsih, E Bawang Putih. Ganeca Exact. Jakarta. Prima, S Isolasi DNA dan Elektroforesis. Jurusan Pendidikan Biologi. Universitas Pendidikan Indonesia. Suprapti, L Produk-Produk Olahan Ikan, Kecap, Dendeng, dan Kamaboko. Penerbit Kanisisus. Yogyakarta Elrod, S., Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.

11 Jamilah Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Esktrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah. Naskah Skripsi. Universitas Negeri Malang. Sadava, D Life: The Science of biology. Sinauer Association, Massachusetts. Suryo Genetika Strata 1. UGM Press, Yogyakarta. Sfaruddin dan Santoso, J. K Optimasi Teknik Isolasi Dan Purifikasi Dna Yang Efisien Dan Efektif Pada Kemiri Sunan (Reutalis Trisperma (Blanco) Airy Shaw). Jurnal Litri. 17(1):11-17