II. METODE PENELITIAN. 1. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat. /./. Bahan

Transkripsi

1 II. METODE PENELITIAN 1. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat /./. Bahan Penelitian ini menggunakan ikan Kerapu Macan (Epinephelus fuscoguttatus) sebanyak 14 ekor, berukuran gram, diperoleh dari perairan laut Situbondo, Jawa Timur. Penelitian ini dilakukan dari bulan Agustus sampai dengan bulan Nopember 2010 di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Hama dan Penyakit Ikan Jurusan Perikanan Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri asam laktat adalah media agar MRS (de Mann, Rogosa, Sharpe) dan MRS cair (Merck, Darmstadt, Germany) dengan ph 5,7 (Bucio et al., 2006). Untuk menentukan koloni yang tumbuh adalah dari kelompok bakteri asam laktat, maka koloni direisolasi pada medium agar GYP (Glucose-Yeast Extract-Peptonj+CaCOz dengan komposisi per liter akuades: glukosa 1%, yeast extract 0,5%, trpton 0,5%, agar bakteriologi 1,5% dan CaCO 3 0,5% Prosedur Isolasi Bakteri Asam Laktat Isolasi bakteri asam laktat (BAL) dilakukan menurut prosedur Bucio et al. (2006). Saluran pencernaan ikan Kerapu Macan diambil, dibuka, dibuang isinya, kemudian dinding usus bagian dalam dikerik dengan menggunakan spatula steril. Cairan mukosa usus ini diambil sebanyak 1 ml dan dihomogenkan di dalam 9 ml larutan PBS (phosphate buffer saline) ph 7,4, kemudian dilakukan pengenceran 10" 1 hingga 10" 4 secara berurutan. Dari setiap pengenceran diambil 0,1 ml dan disebarkan 12

2 pada medium agar MRS, dan diinkubasi pada suhu 30 C selama jam. Koloni yang tumbuh terpisah, berwarna putih dan berukuran 0,1-3 mm pada MRS agar diinokulasi kembali pada medium GYP+CaCOs. Selanjutnya koloni yang tumbuh terpisah, berwarna putih dan terdapat zona jernih disekitarnya diisolasi dan disimpan pada medium MRS agar miring, MRS broth (untuk penyimpanan jangka pendek) dan di dalam MRS broth + glycerol (untuk penyimpanan jangka panjang pada suhu - 20 C). Identifikasi BAL Identifikasi isolat bakteri asam laktat berdasarkan karakteristik fenotip, yaitu morfologi, biokimia dan fisiologi. Pengamatan morfologi (merujuk pada Cappucino & Sherman, 2001) meliputi bentuk, tepi, elevasi, warna dan ukuran koloni yang tumbuh terpisah pada medium GYP+CaCOs. Pengamatan morfologi sel mencakup bentuk, sifat Gram dan motilitas di bawah mikroskop binokuler pada perbesaran lox dan 40x. Uji biokimia meliputi uji-uji katalase, oksidase, OF, MR-VP, Simmon citrate, TSIA dan gelatinase, produksi amoniak (NHa) dan uji fermentasi gula-gula menurut prosedur Mac Faddin (1983). Pengamatan fisiologi meliputi uji pertumbuhan pada suhu 15 dan 45 C, pada ph 4 dan 9, dan pada konsentrasi NaCl 6,5, 10 dan 18% (w/v) dalam medium MRS broth (Ghanbari et a/., 2009). Pertumbuhan bakteri diamati setelah waktu inkubasi 3-5 hari. 2. Seleksi Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik 2.1. Bahan Isolat bakteri yang diseleksi sebagai probiotik adalah dua puluh satu isolat BAL yang telah diisolasi dari ikan Kerapu Macan. Untuk uji antagonisme, bakteri 13

3 patogen Vibrio alginolyticus yang digunakan berasal dari Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Payau (BBPBAP) Jepara dan medium Zobell 2216E dengan komposisi polypepton (Oxoid) 5g/l dan yeast extract (Oxoid) lg/1 yang dilarutkan dalam 75% air laut (Isnansetyo & Triyanto, 2007). Sedangkan untuk uji patogenisitas, ikan Kerapu Macan yang digunakan berukuran cm, dan dilakukan di Balai Budidaya Air Payau (BBAP) Situbondo, Jawa Timur Prosedur Uji aktivitas antibakteri Aktivitas antibakteri dari isolat bakteri yang diduga bakteri asam laktat terhadap Vibrio alginolyticus diuji dengan metode paper disc diffusion agar pada double layer agar (Davidson & Parish, 1989). Medium lapis ganda (double layers) terdiri dari 1,5% agar dan 0,7% agar (Isnansetyo & Kemei, 2003). Sebanyak satu ose dari masing-masing isolat diinokulasi pada 5 ml medium Zobell 2216E cair dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30 C. Kepadatan bakteri dari tiap kultur cair ditentukan pada absorbansi 0,1. Sebanyak 50 \JL\ dari kultur cair tersebut diteteskan pada paper disc, kemudian didiamkan selama 15 menit (aseptis) supaya meresap sempurna. Paperdisc selanjutnya diletakkan di atas taburan patogen V. alginolyticus pada medium agar Zobell double layer dengan kepadatan 10 6 sel/ml merujuk kepada prosedur Buntin et a/., (2008), dan diinkubasi pada suhu 30 C selama 24 jam. Kepadatan 10 6 sel/ml ditentukan dari total plate count (TPC) pada medium TSA air laut. Kemampuan penghambatan pertumbuhan patogen ditandai dengan terbentuknya zona jernih disekitar paper disc. Sebagai kontrol positif digunakan chloramphenicol, dan kontrol negatif digunakan MRS broth. Zona hambat dihitung dengan mengukur 14

4 diameter zona jemih dalam mm disekitar paper disc dengan menggunakan caliper. Pengujian dilakukan dua kali untuk setiap isolat dan kontrol. Toleransi terhadap ph Uji ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan isolat BAL untuk tumbuh pada ph 3, 4, 5 dan 6. Prosedur pengamatan dilakukan menurut Hardiningsih et al. (2006). Isolat BAL diinokulasi pada medium cair de Mann, Rogosa, Sharpe (MRS broth, Merck, Darmstadt, Germany) yang telah diatur ph nya sesuai dengan ph uji dengan penambahan HC1 1% atau NaOH 1%. Setelah diinkubasi selama 48 jam dilakukan pengukuran OD (Optical Density) dengan Spektrofotometer (APEL AP- 101 Photoelectronic Colorimeter, Japan) pada panjang gelombang 600 nm. Sebagai kontrol dan blanko digunakan MRS broth tanpa inokulasi bakteri. Setiap perlakuan diulang sebanyak dua kali. Toleransi terhadap bile salt Uji ini dilakukan untuk mengamati kemampuan isolat BAL untuk tumbuh pada berbagai konsentrasi garam empedu (bile salt). Pengamatan dilakukan menurut prosedur yang dilakukan Buntin et al. (2008). Isolat BAL digoreskan pada medium agar MRS (Merck), masing-masing ditambahkan dengan bile salt (Oxoid) pada konsentrasi 0,2, 0,3,0,4 dan 0,5%. Uji Patogenisitas Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah isolat bakteri asam laktat (BAL) yang telah diisolasi dari usus ikan Kerapu Macan bersifat patogen atau tidak. Dean Kerapu Macan yang digunakan berukuran cm sebanyak 250 ekor, terlebih dahulu diadaptasikan dalam bak penampungan selama 3 hari dan diberi pakan pelet 15

5 banyak 3% dari berat ikan dengan frekuensi pemberian pakan 3-4 kali per hari. emudian ikan dipindahkan ke dalam 21 buah akuarium yang berukuran 60x40x40 i3 sebanyak 10 ekor ikan per akuarium (untuk 20 isolat BAL dan 1 kontrol). Penelitian ini dilakukan menurut prosedur Aly et al. (2008a). Isolat BAL tumbuhkan pada media MRS broth pada suhu 30 C, setelah 48 jam sel bakteri panen dengan disentrifugasi pada kecepatan 3500 rpm selama 10 menit pada suhu 'C. Pelet dicuci dua kali dengan larutan PBS (ph 7,4), disentrifugasi seperti ibelumnya. Bakteri disuspensikan dalam larutan PBS dengan menggunakan standar [cfarlan ekuivalen dengan kepadatan bakteri 10 7 sel/ml. Kemudian ikan dari tiap ;lompok diinjeksi dengan suspensi tiap-tiap isolat BAL 10 7 cfit/ml secara injeksi 3ritoneal (IP). Sebagai kontrol, ikan disuntikkan dengan PBS sebanyak 0,1 ml/ikan. elama masa pengujian, air akuarium diganti sebanyak 50% dan diaerasi, dan ikan iberi makan pelet sebanyak 3% dari berat ikan dengan frekuensi pemberian pakan 3- kali per hari. Ikan dipelihara dan diamati selama 7 hari. Pengamatan dilakukan srhadap gejala klinis, kualitas air dan mortalitas. Pengamatan gejala klinis meliputi erakan ikan, reaksi terhadap rangsangan, nafsu makan, pernafasan, posisi ikan dalam kuarium, perubahan warna, jumlah lendir, adanya gripsis dan lesi eksternal lainnya. Iji Ko-kultur Uji ini dilakukan untuk mengamati kemampuan enam isolat BAL (KSBU Aa, KSBU 5Da, KSBU 9, KSBU 11B, KSBU 12B dan KSBU 12C) dalam aenghambat pertumbuhan V. alginolyticus. Isolat-isolat tersebut dipilih berdasarkan ona hambat terluas pada uji antibakteri, toleransi terhadap ph dan bile salts. Uji ini tilakukan menurut prosedur Vaseeheran dan Ramasamy (2003). Isolat BAL dan V. 16

6 alginolyticus sebelumnya dikultur secara terpisah di dalam media Tripticase soya broth (TSB, Oxoid). V. alginolyticus diinokulasi ke dalam TSB dengan konsentrasi 10 3 cfiilrra per tabung reaksi, kemudian tiap tabung ditambahkan dengan isolat BAL dengan konsentrasi 0 (kontrol), 10, 10 dan 10 c/w/ml. Perlakuan ini dilakukan dengan dua kali ulangan. Semua tabung ko-kultur tersebut diinkubasi pada suhu 30 C dan pertumbuhan koloni V. alginolyticus diamati setiap hari selama 5 hari. Jumlah V. alginolyticus dihitung dengan menyiapkan serial pengenceran lo'-lo 7, dan sebanyak 0,1 ml dari tiap pengenceran diinokulasi pada agar Thiosuphate citrate bile salts sucrose (TCBS, Merck)), kemudian diinkubasi pada suhu 30 C selama jam. 3. Analisis Data Data hasil penelitian ini disajikan dalam bentuk tabel dan gambar, selanjutnya data diuraikan secara deskriptif dan dibandingkan dengan hasil-hasil penelitian terdahulu. 17