BAHAN DAN METODE Tempat dan waktu penelitian Bahan dan Alat Isolasi dan Uji Reaksi Hipersensitif Bakteri Penghasil Siderofor

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Tempat dan waktu penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, dari Oktober 2010 sampai dengan Juni Bahan dan Alat Bakteri penghasil siderofor yang digunakan dalam penelitian ini diisolasi dari perakaran tanaman tomat sehat pada lahan yang terinfestasi R. solanacearum di wilayah Cipanas dan Lembang. Isolat P. fluorescens RH4003 dan isolat R. solanacearum yang digunakan merupakan koleksi Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Benih tomat yang digunakan untuk pengujian kemampuan memacu pertumbuhan tanaman yaitu varietas Arthaloka dan Ratna. Media tanam yang digunakan yaitu campuran antara pupuk kompos dan tanah steril dengan perbandingan 1:1. Isolasi dan Uji Reaksi Hipersensitif Bakteri Penghasil Siderofor Bakteri penghasil siderofor diisolasi dari bagian rizosfer tanaman tomat sehat asal Cipanas dan Lembang, Jawa Barat. Tanaman tomat yang dipilih sebagai sampel dicabut kemudian tanah yang berada di bagian perakaran serta bagian akar-akar halus diambil sebanyak 10 g dan disuspensikan ke dalam 100 ml akuades steril. Suspensi tersebut kemudian digoyang menggunakan shaker dengan kecepatan 200 rpm selama 10 menit. Sebanyak 1 ml suspensi bakteri diambil, kemudian dilakukan pengenceran berseri menggunakan akuades steril hingga pengenceran Suspensi diambil dari pengenceran 10-3, 10-5, 10-7 masing-masing sebanyak 100 µl kemudian disebar pada media chrom azurol sulfat (CAS) secara duplo. Larutan indikator yang terkandung dalam media ini adalah Fe-CAS yang membantu pembentukan zona berwarna jingga di sekitar koloni bakteri yang menghasilkan siderofor. Zona berwarna jingga di sekitar koloni tersebut merupakan indikator yang digunakan dalam menentukan bakteri 10

2 11 penghasil siderofor. Bakteri penghasil siderofor kemudian diisolasi dan digunakan untuk berbagai pengujian. Sampel tanaman tomat asal Cipanas diberi kode Cp, kemudian diikuti dengan nomor sampel sehingga akan diperoleh sampel dengan kode Cp1, Cp2, dan Cp3. Sampel tanaman tomat asal Lembang diberi kode Lb, kemudian diikuti dengan nomor sampel, sehingga akan diperoleh sampel dengan kode Lb1 dan Lb2. Bakteri penghasil siderofor hasil isolasi disimpan dalam media cair dengan kombinasi 80% nutrient broth dan 20% gliserol pada suhu -20 o C. Sebelum perlakuan, bakteri dipindahkan untuk peremajaan pada media agar King s B dalam cawan petri. Uji reaksi hipersensitif (HR) bakteri penghasil siderofor dilakukan untuk mengetahui patogenisitas bakteri penghasil siderofor. Pengujian dilakukan dengan menggunakan daun tembakau sehat. Bakteri sebelumnya dibiakkan pada media Luria Bertani broth (LB). Setelah diinkubasi selama 24 sampai 48 jam, sebanyak 1 ml suspensi diambil dan disuntikkan pada daun tembakau. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam. Sebagai kontrol positif digunakan isolat R. solanacearum dan Erwinia carotovora. Bakteri dinyatakan bersifat HR positif apabila menimbulkan gejala nekrosis pada permukaan daun tembakau. Uji Antagonisme Bakteri Penghasil Siderofor terhadap R. solanacearum Uji antagonisme bakteri penghasil siderofor dilakukan pada media agar King s B. Biakan bakteri penghasil siderofor yang berumur 24 sampai 48 jam masing-masing disuspensikan dalam akuades steril dan kerapatannya diusahakan mencapai cfu/ml. Media agar King B yang telah disterilisasi dituang pada cawan berdiameter 9 cm dan ditunggu sampai membeku. Suspensi R. solanacearum diambil sebanyak 100 µl kemudian disebar di permukaan media tersebut. Setelah R. solanacearum yang disebar tersebut kering angin, satu potong kertas saring steril berdiameter 5 mm diletakkan di atas permukaan agar. Sebanyak 5 µl suspensi bakteri penghasil siderofor diteteskan di atas kertas saring tersebut. Sebagai kontrol, potongan kertas saring ditetesi dengan akuades steril. Setiap pengujian dilakukan sebanyak tiga ulangan. Diameter zona hambatan diukur setelah diinkubasi pada suhu ruang selama 24 sampai 48 jam.

3 12 Karakterisasi Bakteri Penghasil Siderofor Karakterisasi dilakukan untuk mengetahui karakter dari masing-masing bakteri penghasil siderofor yang memiliki kemampuan antagonisme terhadap R. solanacearum. Karakterisasi meliputi pengamatan morfologi, produksi senyawa fluoresens, reaksi Gram, kemampuan melarutkan fosfat, kemampuan bertahan pada suhu 80 o C, dan kemampuan dalam memacu pertumbuhan tanaman tomat yang meliputi daya kecambah, pertambahan tinggi tanaman, dan bobot kering tanaman. Morfologi Bakteri Penghasil Siderofor Pengamatan morfologi bakteri penghasil siderofor dilakukan dengan cara menggores kuadran bakteri penghasil siderofor pada media agar King s B. Pengamatan dilakukan setelah biakan berumur 24 sampai 48 jam. Pengamatan morfologi meliputi diameter, bentuk, warna, elevasi, dan tepian dari koloni tunggal masing-masing isolat bakteri. Produksi Senyawa Fluoresens Bakteri Penghasil Siderofor Produksi senyawa fluoresens oleh bakteri penghasil siderofor dideteksi dengan cara menggoreskan bakteri penghasil siderofor pada media agar King s B. Setelah berumur 24 sampai 48 jam biakan bakteri kemudian diamati dibawah lampu near ultraviolet (NUV) yang memiliki panjang gelombang sekitar 200 sampai 380 nm. Sebagai pembanding digunakan isolat bakteri P. fluorescens RH4003 (P1). Uji Gram Bakteri Penghasil Siderofor Sifat Gram suatu bakteri dapat diketahui dengan metode sederhana menggunakan KOH 3%. Biakan bakteri yang sebelumnya telah ditumbuhkan di media padat diambil sebanyak satu lup, kemudian dilarutkan dalam KOH 3%. Bakteri yang menghasilkan lendir mengindikasikan bahwa bakteri tersebut termasuk kelompok Gram negatif, sedangkan yang tidak menghasilkan lendir mengindikasikan bahwa bakteri tersebut termasuk kelompok Gram positif

4 13 Uji Aktivitas Pelarutan Fosfat oleh Bakteri Penghasil Siderofor Uji aktivitas pelarutan fosfat dilakuan dengan cara menumbuhkan isolatisolat bakteri penghasil siderofor pada media Pikovskaya padat menurut meode Rao dan Sinha (1963). Setelah diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang, dilakukan pengamatan zona bening di sekeliling koloni bakteri. Adanya zona bening mengindikasikan bahwa bakteri penghasil siderofor tersebut memiliki kemampuan melarutkan fosfat. Uji Kemampuan Bertahan pada Suhu 80 o C Bakteri yang akan diuji kemampuan bertahan pada suhu 80 o C sebelumnya dibiakkan pada media LB. Setelah diinkubasi selama 24 jam bakteri tersebut dipanaskan pada suhu 80 o C selama 15 menit, kemudian disebar pada media tryptic soy agar. Bakteri yang tumbuh pada media TSA mengindikasikan bahwa bakteri tersebut dapat bertahan pada suhu panas sampai 80 o C. Uji Pemacuan Pertumbuhan Tanaman Tomat oleh Bakteri Penghasil Siderofor Kemampuan bakteri penghasil siderofor dalam memacu pertumbuhan tanaman diukur berdasarkan kemampuannya dalam meningkatkan daya kecambah, pertambahan tinggi, bobot basah, bobot kering, dan kadar air tanaman tomat. Jenis tanaman tomat yang digunakan yaitu varietas Arthaloka dan Ratna. Pengaruh bakteri penghasil siderofor terhadap daya kecambah. Media tanam yang digunakan berupa tanah steril dan kompos yang dicampur dengan perbandingan 1:1. Media tanam tersebut dimasukkan dalam pot tray berukuran 50 cm x 30 cm dengan jumlah lubang tanam sebanyak 128 lubang. Sebelum ditanam, benih diberi perlakuan dengan cara direndam dalam suspensi bakteri penghasil siderofor selama 16 jam atau semalaman sambil digoyang menggunakan shaker. Sebagai kontrol, benih direndam dalam akuades steril. Benih ditanam sebanyak satu benih per lubang tanam. Jumlah perlakuan untuk setiap varietas sebanyak delapan perlakuan termasuk kontrol dengan masingmasing perlakuan tiga ulangan. Masing-masing ulangan terdiri atas 15 unit.

5 Pengamatan dilakukan untuk melihat persentase daya kecambah (DK) dari masing-masing perlakuan yang dihitung dengan menggunakan rumus : DK (%) = jumlah benih yang berkecambah X 100% jumlah benih yang diamati 14 Pengaruh bakteri penghasil siderofor terhadap tinggi tanaman. Sebagai media tanam digunakan campuran tanah dan kompos dengan perbandingan 1:1. Tanah dimasukkan ke dalam polybag berukuran 10 cm x 15 cm. Sebelum ditanam benih tersebut diberi perlakuan dengan cara direndam dalam suspensi bakteri selama 16 jam atau semalaman sambil digoyang menggunakan shaker. Sebagai kontrol, benih direndam dalam akuades steril. Benih kemudian ditanam sebanyak satu benih per polybag. Jumlah perlakuan untuk setiap varietas sebanyak delapan perlakuan termasuk kontrol. Masingmasing perlakuan diulang sebanyak tiga kali dan masing-masing ulangan terdiri atas lima unit. Pengamatan tinggi tanaman dilakukan setelah muncul daun pertama sampai 30 hari setelah tanam. Selain itu dihitung nilai AUHPGC (area under height of plant growth curve) dengan rumus yang dinyatakan oleh Van der Plank (1963) sebagai berikut: Keterangan: y i+1 = data pengamatan ke-i+1 y i = data pengamatan ke-i t i+1 = waktu pengamatan ke-i+1 t i = waktu pengamatan ke-i Pengaruh bakteri penghasil siderofor terhadap bobot basah, bobot kering, dan kadar air tanaman tomat. Bobot basah tanaman tomat diukur setelah panen dengan menggunakan timbangan digital. Bobot kering tanaman diperoleh dengan cara mengeringkan terlebih dahulu tanaman yang dicabut kemudian ditimbang sampai mendapatkan nilai bobot kering yang konstan. Kadar air dihitung dengan menggunakan rumus:

6 15 Kadar air (%) = Bobot basah Bobot Kering x 100% Bobot Basah Semua data yang diperoleh dari pengukuran daya kecambah, pertambahan tinggi tanaman, nilai AUHPGC, bobot kering, bobot basah, dan kadar air tanaman diubah dalam bentuk persentase peningkatan atau penurunan yang dibandingkan dengan nilai kontrol masing-masing. Analisis Data Data populasi bakteri hasil isolasi dianalisis menggunakan uji t, dengan bantuan program Minitab versi Rancangan percobaan yang digunakan untuk menentukan pengaruh bakteri penghasil siderofor terhadap pertumbuhan tanaman adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan varietas sebagai faktor pertama dan isolat bakteri penghasil siderofor sebagai faktor kedua. Data ditata menggunakan program Microsoft Excel 2007, kemudian dianalisis menggunakan analisis ragam dengan program Statistical Analysis System (SAS) versi 9.1 Windows. Perlakuan yang berbeda nyata diuji lanjut dengan uji selang berganda Duncan pada taraf nyata 5%.