BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat E. ictaluri Ikan Lele ( Clarias sp.)

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian telah dilaksanakan di Laboratorium Balai Uji Standar Karantina Ikan Departemen Kelautan dan Perikanan di Jakarta dan Bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB yang dimulai pada bulan Nopember 2006 sampai dengan Januari E. ictaluri E. ictaluri diisolasi dari ginjal ikan Bawal (Colossoma macropomum) yang berasal dari peternakan ikan di desa Pringgolayan, Yogyakarta. E. ictaluri tersebut telah diidentifikasi berdasarkan morfologi dan sifat-sifat biokimianya di Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada Yogyakarta (Amanu, komunikasi pribadi 2007). E. ictaluri tersebut dikultur kembali di Laboratorium Balai Uji Standar Karantina Ikan Jakarta, dilanjutkan dengan pengujian ulang morfologi dan biokimia, untuk membuktikan bahwa bakteri tersebut benar-benar E. ictaluri. Ikan Lele (Clarias sp.) Ikan lele yang digunakan dalam penelitian berukuran 9 10 cm (5 6 gram) yang berasal dari satu induk dan bebas dari infeksi E. ictaluri. Ikan lele tersebut diambil secara acak berasal dari peternakan ikan di daerah Cijeruk Kabupaten Bogor. Ikan tersebut diperiksa kesehatannya dan tidak menunjukkan gejala sakit. Sebelum digunakan dalam penelitian, ikan diaklimatisasi selama 48 jam dalam akuarium berukuran 30 x 25 x 20 cm 3 berisi air 10 liter dengan kondisi air statis yang telah difilter dan diberi aerasi. Pakan ikan berupa pakan pelet yang telah disterilkan dengan iradiasi sinar gamma dosis 10 K Gray di BATAN Jakarta. 31

2 Metode Penelitian Uji Pendahuluan Pengembalian Virulensi E. ictaluri Pengembalian virulensi bakteri dilakukan dengan cara menginfeksikan E. ictaluri dari sediaan kultur murni laboratorium pada ikan lele (Clarias sp.) sebagai inang target penyakit ESC. Sebelumnya bakteri dibiakkan pada media cair (BHI broth) dan diinkubasi pada suhu 28 o C selama jam (Inglis et al. 1993; Anonim, 2006a). Hasil pemanenan dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril dengan ditambah pelarut PBS dan diaduk dengan vortex mixer hingga homogen, setelah itu suspensi isolat bakteri yang diperoleh dihitung tingkat kekeruhannya dengan membandingkan kepadatan konsentrasi bakteri (10 9 cfu/ml) pada standar kepadatan bakteri menurut McFarland (Jang 1980). Biakan E. ictaluri konsentrasi kepadatan 10 9 cfu/ml sebanyak 0,1 ml disuntikkan secara intraperitoneal pada ikan lele ukuran ± 6 gram sebanyak 5 ekor. Setelah 2 3 hari masa inkubasi ikan yang menunjukkan gejala menciri penyakit ESC segera diisolasi dari organ ginjal dan dilakukan pemeriksaan sifatsifat biokimianya untuk mengetahui kemurnian isolat bakteri tersebut. Isolat bakteri dimurnikan dengan menggunakan media TSA. Isolat bakteri dari organ ginjal yang telah terbukti virulen kemudian digunakan untuk uji selanjutnya. Penentuan Dosis Infeksi (LD 50 ) Untuk memperbanyak biakan E. ictaluri yang akan digunakan pada uji penentuan LD 50, bakteri dipupuk pada media plat TSA, selanjutnya diinkubasi pada 27ºC. Bakteri dipanen setelah jam dan dibuat suspensi dalam larutan PBS steril untuk mendapatkan konsentrasi kepadatan 10 4, 10 6, 10 8, cfu/ml. Dalam menentukan nilai LD 50 digunakan 5 kelompok perlakuan masingmasing terdiri dari 10 ekor ikan. Ikan-ikan diinfeksi oleh 4 tingkat konsentrasi kepadatan bakteri 10 4, 10 6, 10 8 dan cfu/ml secara intraperitonial sebanyak 0,1 ml per ekor dan 1 kelompok kontrol yang tidak diinfeksi, masing-masing kelompok uji dilakukan 3 kali ulangan. Pasca infeksi ikan tersebut dimasukkan ke dalam akuarium dan diberi pakan pelet steril, selanjutnya dilakukan pengamatan gejala klinis, perubahan 32

3 makroskopis dan jumlah kematian ikan selama 72 jam. LD 50 dihitung menurut metode Dragsted-Behrens (Hubert, 1980). Nilai LD 50 tersebut digunakan sebagai dosis infeksi pada uji utama. Uji Utama Uji utama bertujuan untuk mengetahui tahapan perubahan jaringan ikan lele (Clarias sp.) secara makroskopis dan mikroskopis akibat infeksi E. ictaluri dengan menggunakan dosis infeksi LD 50. Ikan lele sebanyak 50 ekor diinfeksi E. ictaluri secara intraperitoneal dengan konsentrasi kepadatan sesuai hasil uji LD 50 sebanyak 0,1 ml per ekor. Pasca infeksi ikan dimasukkan ke dalam 5 buah akuarium dan diberi pakan pelet steril. Tiap akuarium memiliki kepadatan jumlah ikan uji sebanyak 10 ekor/akuarium. Satu akuarium berisi 10 ekor ikan yang diinjeksi PBS bertindak sebagai kelompok kontrol. Penggantian air dilakukan bila air keruh yaitu sehari sekali selama pengujian berlangsung. Pengamatan perubahan jaringan secara makroskopik (Patologi Anatomi) dan mikroskopik (Histopatologi) dari ikan-ikan uji yang diinfeksi E. ictaluri dengan cara mengambil 1 ekor ikan sampel dari masing-masing akuarium pada jam ke-0, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, dan 72 pasca infeksi (pi), sehingga setiap waktu pengambilan sampel diperoleh 5 ekor ikan. Pengamatan Gejala Klinis Ikan Uji Pengamatan gejala klinis yang diamati lele meliputi tingkah laku ikan lele berupa reaksi terhadap rangsangan dan gerakan renang. Pengamatan gerakan renang dilakukan selama 72 jam, uji untuk mengetahui reaksi terhadap rangsangan dilakukan pada jam ke 0, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, dan 72 pi. Pemeriksaan Makroskopis dan Mikroskopis Setiap waktu pengambilan sampel dilakukan pemeriksaan makroskopis terhadap perubahan pada organ eksternal dan internal tubuh ikan. Pengamatan PA dilakukan terhadap bentuk, warna dan ukuran dari organ-organ tersebut. Untuk pemeriksaan histopatologi, sampel organ kulit, otot, mata, insang, jantung, 33

4 lambung, usus, pankreas, hati, limpa dan ginjal difiksasi dalam larutan Buffer Netral Formalin (BNF) 10%, selama 48 jam. Sampel selanjutnya di proses untuk pembuatan sediaan histopatologi menggunakan automatic tissue processor (Sakura, Jepang), ditanam pada parafin menggunakan alat tissue embedding console (Sakura, Jepang) dan dipotong menggunakan mikrotom (Spencer, USA) setebal 5 µm. Sediaan histopatologi diwarnai dengan pewarnaan hematoxylin-eosin (HE) dan Giemsa (Lampiran 1). Pengamatan makroskopis dan mikroskopis berdasarkan adanya lesio pada kulit, otot, mata, insang, jantung, lambung, usus, pankreas, hati, limpa dan ginjal ikan uji. Pengamatan dilakukan pada jam ke 2, 4, 8,12, 24, 36, 48, dan 72 pi. Data-data yang diperoleh dari pengamatan patologi dianalisa secara deskriptif, baik data mengenai perubahan patologi anatomi (PA) maupun perubahan histopatologi (HP). Pada pengamatan perubahan histopatologi (HP), frekuensi kejadian lesio pada setiap organ ikan lele dihitung dengan cara : Jumlah sampel ikan yang mengalami lesio x 100 % Jumlah sampel ikan Pengujian E. ictaluri Pada Ikan Sampel Selama uji utama dilakukan pengujian adanya E. ictaluri pada jaringan ikan sampel pada setiap pengamatan. Jaringan yang diambil yaitu ginjal, limpa dan hati, selanjutnya dilakukan isolasi dan dikultur pada media TSA kemudian diinkubasi pada suhu 27 C selama 24 jam, dan koloni yang tumbuh terpisah diuji lanjut sifat-sifat morfologi dan biokimianya (gula-gula). Pengujian adanya E. ictaluri pada ikan sampel dilakukan pada pengamatan jam ke-2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, dan 72 setelah infeksi. Penghitungan Jumlah Koloni Bakteri Pada uji utama, dilakukan reisolasi bakteri pada limpa dan penghitungan jumlah koloni E. ictaluri dengan tujuan untuk mengetahui tingkat perkembangan sepsis pada ikan. Penghitungan jumlah koloni pada organ dengan menggunakan 34

5 metoda hitungan cawan (HC). Metode HC ini dilakukan dengan cara : 1 gram limpa dimasukkan ke dalam 9 ml larutan bufer pepton water. Kemudian ditumbuhkan pada media TSA diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 27 C. Isolat 1 (satu) koloni bakteri dipindahkan dan dikultur ke dalam 10 ml BHI broth, diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 27 C. Kemudian 0,1 ml contoh yang telah mengalami satu seri pengenceran diulaskan dengan spatula pada permukaan TSA sebanyak 2 cawan (duplo). Setelah inkubasi, dilakukan perhitungan jumlah koloni dengan menggunakan Colony Counter (Fardiaz 1987). Penghitungan koloni bakteri ini dilakukan pada pengamatan jam ke 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, dan 72 pi. Penghitungan koloni bakteri dilakukan terhadap cawan yang mengandung 30 sampai 300 koloni. Jumlah bakteri yang terdapat dalam tabung asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan, dengan rumus sebagai berikut : Faktor pengenceran = Pengencaran x Pengenceran x Jumlah yang awal selanjutnya ditumbuhkan Koloni per ml = Jumlah koloni x 1 Faktor Pengenceran Kualitas Air Kualitas air yang diamati pada uji utama terdiri dari Nitrit (test kit), Nitrat (test kit), ph (test kit), Oksigen terlarut, dan Suhu (termometer). Pengamatan nitrit dan nitrat dilakukan pada saat awal dan akhir uji. Sedangkan pengamatan ph, oksigen terlarut dan suhu air dilakukan setiap hari pagi dan sore. 35

6 Uji Pendahuluan : Isolat E. ictaluri Re-kultur (inkubasi 28 o C, jam) Injeksi 0,1 ml ke ikan Reisolasi dan identifikasi Infeksi 10 4,10 6,10 8, cfu/ml Injeksi 0,1 ml intraperitoneal Kontrol 10 ekor ikan/dosis Diamati mortalitas Dosis LD 50 Uji Utama : 50 ekor ikan/5 akuarium Diamati selama 72 jam (5 ekor sampel pada jam ke-2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 72 pi) Kontrol 10 ekor ikan /akuarium Gejala Klinis Makroskopis (PA) Mikroskopis (HP) Pengamatan morfologi dan uji biokimia bakteri Penilaian tahapan sepsis dengan reisolasi bakteri dari limpa Kualitas air Gambar 5. Denah alur penelitian kajian patogenesis infeksi E. ictaluri pada ikan lele (Clarias sp.) 36