Tahapan dalam pembuatan tepung segar ubi jalar varietas sukuh dapat dilihat pada diagram berikut ini: Persiapan ubi jalar varietas sukuh

Transkripsi

1 36 Lampiran 1 Pembuatan tepung segar ubi jalar varietas sukuh Tahapan dalam pembuatan tepung segar ubi jalar varietas sukuh dapat dilihat pada diagram berikut ini: Persiapan ubi jalar varietas sukuh Pengupasan dan pengirisan Pengeringan pada suhu 55 o C, 5 jam Penggilingan dengan wiilley mill Pengayakan 60 mesh Tepung segar ubi jalar Gambar 13. Tahapan pembuatan tepung segar ubi jalar

2 37 Lampiran 2 Ekstraksi oligosakarida ubi jalar varietas sukuh Tahapan dalam ekstraksi ubi jalar varietas sukuh dapat dilihat pada diagram berikut ini: Tepung kukus ubi jalar varietas sukuh Ekstraksi dengan Etanol 70% Pengadukan dengan magnetic stirer, 18 jam Penggilingan dengan wiilley mill Penyaringan Pemekatan dengan evaporator vakum, 40 o C Sentrifugasi, 10 menit Penyaringan Ekstrak Ubi Jalar Gambar 14. Tahapan pembuatan tepung segar ubi jalar

3 38 Lampiran 3 Hasil penghitungan total padatan terlarut (TPT) dari ekstrak ubi jalar varietas sukuh Berikut ini adalah penghitungan total padatan terlarut (TPT) dari ekstrak ubi jalar varietas sukuh: Rumus perhitungan TPT : TPT = c a b 100 % Keterangan: a = berat cawan sebelum diisi ekstrak oligosakarida (g) b = berat larutan ekstrak kasar oligosakarida (g) c = berat cawan yang berisi ekstrak kering oligosakarida setelah dioven 24 jam (g) Hasil pengukuran TPT dari ekstrak ubi jalar varietas sukuh: a = 26,81108 g b = 1,05898 g c = 26,96922 g TPT = 0, , % TPT dari ekstrak ubi jalar varietas sukuh adalah 14,933% Rumus pengenceran : M1 x V1 = M2 x V2 14,933% x V1= 5% x 100 ml V1 = 33,483 ml Dengan demikian, untuk mendapatkan 100 ml ekstrak ubi jalar varietas sukuh TPT 5 % diperlukan 33,483 ml ekstrak ubi jalar varietas sukuh 14,933%.

4 39 Lampiran 4 Pembuatan mutan rifampisin resisten pada isolat bakteri SKT-b Berikut ini adalah tahapan dalam pembuatan bakteri menjadi resisten terhadap rifampisin (Rf R ): Sebanyak 1 ml biakan cair bakteri SKT-b disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan larutan fisiologis sebanyak supernatan yang dibuang (1 ml) lalu divorteks. Suspensi bakteri ini disentrifuse kembali pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit lalu supernatannya dibuang dan ditambahkan kembali larutan fisiologis sebanyak 1 ml. Sebanyak 100 µl suspensi bakteri uji lalu disebar secara merata pada permukaan Media Thiosulfate Citrate Bile Salt Agar (TCBS) yang telah mengandung antibiotik rifampisin (50µg/ml). Sebagai kontrol, sebanyak 100 µl suspensi bakteri uji hasil pengenceran serial 10-5, 10-6, dan 10-7 disebar secara merata pada permukaan media agar yang tidak mengandung antibiotik. Kultur diinkubasikan pada inkubator bersuhu ruang selama jam. Koloni bakteri yang tumbuh merupakan koloni bakteri yang telah resisten terhadap antibiotik rifampisin. Koloni bakteri yang telah resisten diambil dengan menggunakan ose dan dipindahkan pada agar miring sebagai stok inokulan.

5 40 Lampiran 5 Pengujian bakteri SKT-b dan Vibrio harveyi secara in vitro Berikut ini adalah hasil pengujian morfologi, fisiologi dan biokimia, sifat antagonistik, dan Total Plating Count (TPC) dari isolat bakteri SKT-b dan Vibrio harveyi (Tabel 5, 6 dan 7). Tabel 5. Karakteristik sifat fisiologi dan biokimia bakteri SKT-b dan Vibrio harveyi Parameter SKT-b V. harveyi Gram egatif egatif Bentuk sel Batang pendek Batang pendek Motilitas Motil Motil Amilase Positif (tidak diuji) Oksidase Positif Positif Uji O/F Positif Positif Tabel 6. Jumlah koloni bakteri SKT-b dan Vibrio harveyi dengan metode kultur bersama Jumlah Koloni Pengenceran 10 6 CFU/ml SKT-b R 10 6 CFU/ml V. harveyi 10-4 TBUD TBUD Tabel 7. Total Plating Count (TPC) bakteri SKT-b dan Vibrio harveyi Pengenceran Ulangan SKT-b R Jumlah Koloni V. harveyi

6 41 Lampiran 6 Komposisi proksimat pakan Berikut ini adalah komposisi proksimat pakan uji yang ditambahkan dengan sinbiotik dengan dosis berbeda (Tabel 8). Tabel 8. Komposisi proksimat pakan dalam bobot basah (%) Kode Sampel Kadar Kadar Protein Lemak Karbohidrat Air Abu Serat Kasar BET Pakan Kontrol 11,97 11,78 35,07 6,65 1,01 31,09 Pakan A 14,42 11,03 32,49 6,56 3,44 32,87 Pakan B 15,73 10,82 33,70 6,48 2,63 30,64 Pakan C 20,13 10,24 32,50 6,17 2,55 28,41

7 42 Lampiran 7 Prosedur pembuatan media kultur bakteri a. Media Sea Water Complete (SWC): Media SWC merupakan media umum untuk kultur bakteri air laut. Komposisi bahan media SWC per 100 ml terdiri dari bacto peptone 0,5 g, bacto agar 1,7 g, yeast extract 0,1 g, gliserol 0,3 ml, akuades 25 ml, air laut 75 ml. Semua bahan-bahan tersebut dihomogenkan pada penangas air atau waterbath bersuhu 100 o C, lalu disterilkan pada suhu 121 o C selama 15 menit. Media SWC yang sudah steril dibiarkan hingga hangat, kemudian dituang ke dalam cawan petri steril. Untuk pembuatan media cair SWC, bacto agar tidak ditambahkan ke dalam media. b. Media Thiosulfate Citrate Bile Salt Agar (TCBS): Media TCBS merupakan media selektif untuk menumbuhkan bakteri Vibrio. Sebanyak 8,9 g media TCBS dilarutkan dalam 100 ml akuades steril. Kemudian media dihomogenkan pada penangas air atau waterbath bersuhu 100 o C. Media yang telah homogen dapat langsung dituang ke dalam cawan petri steril. Untuk media TCBS yang mengandung antibiotik rifampisin (konsentrasi 50 µg/ml), media yang telah homogen, ditambahkan 200µl larutan stok rifamfisin (konsentrasi 25 mg/ml). Setelah itu dihomogenkan kembali dengan menggunakan magnetic stirer dan dapat langsung dituang ke dalam cawan petri steril. c. Phosfat Buffer Saline (PBS) Media PBS dibuat dengan mencampurkan acl 0,8 g, KH 2 PO 4 0,2 g, a 2 HPO 4 1,5 g, KCl 0,2 g dan akuades 1000 ml. Bahan-bahan tersebut dihomogenkan pada penangas air atau waterbath bersuhu 100 o C, lalu disterilkan pada suhu 121 o C selama 15 menit.

8 43 Lampiran 8. Penghitungan bakteri dengan metode hitungan cawan Metode hitungan cawan didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni. Untuk memenuhi persyaratan statistik, cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni adalah yang mengandung antara koloni. Jumlah sel bakteri pada suatu sampel diketahui dengan menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada media tersebut dikalikan dengan faktor pengencernya dengan satuan Colony Forming Unit (CFU/ml atau CFU/g). Eppendorf diisi dengan PBS sebanyak 0,9 ml dan disusun secara berderet Sampel suspensi bakteri divortex hingga kekeruhannya merata Sampel suspensi bakteri diencerkan dengan metode pengenceran serial Pengenceran serial suspensi bakteri dilakukan dengan cara: 0,1 ml dimasukkan ke eppendorf 0,9 ml pertama (10-1 ), kocok atau vortex agar homogen; lalu secara aseptik diambil 0,1 ml sampel dari eppendorf pengencer pertama dan dimasukkan ke dalam tabung pengencer kedua (10-2 ); dan seterusnya untuk tabung-tabung pengencer selanjutnya Disiapkan tiga cawan petri berisi media agar, beri kode sesuai dengan kode eppendorf pengencer yang akan disebar Metode penyebaran: mikropipet 0,1 ml sampel dari 3 eppendorf pada pengenceran tertinggi, disebar pada media agar dengan menggunakan batang penyebar Setelah itu diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam Kemudian jumlah koloni yang tumbuh (30-300) dihitung dan dikalikan dengan faktor pengencernya. Kelimpahan bakteri dihitung dengan menggunakan rumus (Madigan et al. 2003): Total Bakteri Koloni x Keterangan : fp = faktor pengenceran 1 fp x ml 1 sampel 0,1 ml 0,1 ml 0,9 ml Media Agar Sampel dalam cawan Gambar Prosedur hitungan cawan sebar

9 44 Lampiran 9 Teknik pengambilan hemolymph dan penghitungan Total Haemocyte Count (THC) pada udang vaname Hemolimph diambii sebanyak 0,1 ml dari pangkal kaki renang pertama dengan syringe 1 ml yang sudah berisi 0,3 ml antikoagulan. Campuran dihomogenkan dengan cara menggoyangkan tangan membentuk angka delapan. Tetesan pertama dibuang, selanjutnya diteteskan ke haemositometer (Improved eubauer type). Sel hemosit diamati dan dihitung jumlah selnya per ml di bawah mikroskop cahaya binokuler dengan pembesaran 400 kali. Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat antikoagulan adalah: 30 mm trisodium citrate 0,34 M sodium chloride 10 mm EDTA Semua bahan dilarutkan ke dalam akuades dengan menggunakan botol scott, dihomogenkan dan siap untuk digunakan.

10 45 Lampiran 10 Teknik preparasi Differential Haemocyte (DH) Hemosit udang penaeid dapat dibedakan atas tiga tipe yaitu hemosit bergranula besar (large granule haemocyte, LGH), hemosit bergranula kecil (small granule haemocyte, SGH) dan hemosit tidak bergranula atau sel hialin (hyaline cell, HC). Pengamatan Differential Haemocyte (DH) pada penelitian ini, digunakan untuk mengetahui persentase tipe sel hemosit hialin dan tipe sel hemosit granular yang terdapat dalam hemolymph. Cara melakukan uji ini adalah: Hemolimph diteteskan pada gelas obyek dan dibuat ulasan, kemudian dikeringkan di udara Preparat difiksasi dengan metanol selama 5-10 rnenit kemudian dikeringkan di udara kembali Preparat direndam dalam larutan pewarna Giemsa selama menit Dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan kering Ulasan hemolimph diperiksa di bawah mikroskop dengan pembesaran 100 kali dan diidentifikasi jenis selnya Jumlah hemosit dihitung hingga 100 sel dan ditentukan persentase tiap jenisnya.

11 46 Lampiran 11. Analisis statistik terhadap laju pertumbuhan harian (LPH) (A) dan rasio konversi pakan (B) udang vaname pada akhir perlakuan sinbiotik (A) LPH Between Groups Within Groups Total Duncan a Sig (B) FCR Between Groups Within Groups Total Duncan a Sig

12 47 Lampiran 12. Analisis statistik terhadap respon imun udang vaname: Total Haemocyte Count (THC) (A), Aktivitas Phenoloxidase (PO) (B), Aktivitas Respiratory Burst (RB) (C), dan Differential Haemocyte (DH) (D) pada sebelum dan sesudah uji tantang (A) Total Haemocyte Count (THC) THC sebelum uji tantang Between Groups Within Groups Total Duncan a Sig THC setelah uji tantang Between Groups Within Groups Total Duncan a Sig

13 48 (B) Aktivitas Phenoloxidase (PO) PO sebelum uji tantang Between Groups Within Groups Total Duncan a Sig PO setelah uji tantang Between Groups Within Groups Total perlakuan 1 2 Duncan a Sig

14 49 (C) Aktivitas Respiratory Burst (RB) RB sebelum uji tantang Between Groups Within Groups Total Duncan a Sig RB setelah uji tantang Between Groups Within Groups Total Duncan a Sig

15 50 (D) Differential Haemocyte (DH) Persentase jumlah sel hialin sebelum uji tantang Between Groups Within Groups Total Duncan a Sig Persentase jumlah sel hialin setelah uji tantang Between Groups Within Groups Total Duncan a Sig

16 51 Persentase jumlah sel granular sebelum uji tantang Between Groups Within Groups Total Duncan a Sig Persentase jumlah sel granular setelah uji tantang Between Groups Within Groups Total Duncan a Sig

17 52 Lampiran 13. Analisis statistik terhadap sintasan udang vaname pada sebelum dan sesudah uji tantang Sintasan sebelum uji tantang Between Groups Within Groups Total Sintasan setelah uji tantang Between Groups Within Groups Total Duncan a Sig