Lampiran 1 Metode total plate count

Transkripsi

1 LAMPIRAN

2 40 Lampiran 1 Metode total plate count 0,1 ml 0,1 ml 0,1 0,9 ml PBS 1:10 1:100 1:1000 1:10000 Biakan bakteri 0,05 ml Setiap pengenceran bakteri disebar dalam media (duplo) Media agar Inkubasi selama 18 jam dan dihitung jumlah koloni yang tumbuh ( koloni) Konsentrasi bakteri = jumlah koloni x (volume inokulan) -1 x pengenceran -1

3 41 Lampiran 2 Pembuatan media bakteri Seawater Complete (SWC) Media SWC merupakan media umum untuk menumbuhkan bakteri air laut. Komposisi bahan untuk membuat media SWC cair yaitu bacto peptone 5 g, yeast extract 1 g, glycerol 3 ml, air laut 750 ml dan akuades 250 ml. Media SWC agar dibuat dengan komposisi yang sama ditambah bacto agar sebanyak g. Media SWC dibuat dengan mencampurkan bahan-bahan tersebut, selanjutnya dipanaskan di atas hot plate sampai homogen (hampir mendidih) sambil diaduk menggunakan magnetic stirrer. Media SWC disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C dan tekanan 1 atm selama menit. Setelah hangat kuku, media SWC agar dituangkan ke dalam cawan petri (± 15 ml) secara aseptik dan dibiarkan sampai membeku. Thiosulfate Citrate Bilesalt Sucrose (TCBS) Agar Media TCBS merupakan media selektif untuk menumbuhkan bakteri Vibrio. Media TCBS agar dibuat dengan melarutkan bubuk media TCBS sebayak 98 g ke dalam ml akuades yang telah disterilkan. Larutan tersebut selanjutnya dipanaskan di atas hot plate sampai homogen (hampir mendidih) sambil diaduk menggunakan magnetic stirrer. Setelah hangat kuku, media TCBS dituangkan ke dalam cawan petri (± 15 ml) secara aseptik dan dibiarkan sampai membeku. Phosfat Buffer Saline (PBS) Media PBS dibuat dengan mencampurkan NaCl 0,8 g; KH2PO4 0,2 g; NaHPO4.2H2O 1,5 g; KCl 0,2 g dan akuades ml. Media dipanaskan di atas hot plate sampai larut sempurna sambil diaduk menggunakan magnetic stirrer. Media SWC disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C dan tekanan 1 atm selama menit.

4 42 Lampiran 3 Sistem resirkulasi pada wadah perlakuan 1 1 a b Keterangan gambar : a. Akuarium perlakuan b. Sistem resirkulasi air (satu perlakuan dengan tiga ulangan) 1. Shelter 2. Anco 3. Pipa saluran air hasil treatment 4. Ember filter (pasir + karang + busa) 5. Pompa air 6. Bioball 7. Wadah treatment air 8. Talang saluran air kotor 9. Outlet air 10. Akuarium 11. Inlet air

5 43 Lampiran 4 Ekstraksi IMNV dari tubuh udang yang terinfeksi Udang yang positif terinfeksi IMNV dibersihkan dan diambil bagian dagingnya. Daging udang dicacah sampai halus kemudian ditambahkan larutan PBS dengan perbandingan 1:10 w/v dan disentrifuse dengan kecepatan rpm pada suhu 4 o C selama 20 menit. Supernatan diambil dan disentrifuse kembali dengan kecepatan rpm pada suhu 4 o C selama 20 menit. Selanjutnya supernatan disaring dengan filter mess size 0,45 µm. Ekstrak virus hasil filtrasi kemudian disimpan pada suhu -70 o C sampai dengan digunakan. Lampiran 5 Tahapan dan waktu kegiatan penelitian pada uji in vivo Uji resistensi udang vaname terhadap IMNV Kegiatan Persiapan dan adaptasi udang Pemberian sinbiotik Injeksi IMNV Pengamatan sintasan Pengamatan gejala klinis Pengukuran parameter imunitas Hari ke Uji performa pertumbuhan. Kegiatan Persiapan dan adaptasi udang Pemberian sinbiotik Penimbangan bobot udang Pengukuran jumlah konsumsi pakan Analisis proksimat Analisis enzim Hari ke

6 44 Lampiran 6 Perhitungan total hemosit dengan menggunakan hemasitometer 1mm mm Perhitungan sel hemosit pada 25 kotak besar 1 mm Contoh perhitungan: Jumlah sel hemosit terhitung = 100 sel (dalam 25 kotak besar) Volume hemasitometer = 1 x 1 x 0,1 mm 3 = 1 x 10-4 ml Pengenceran hemolimph = 5 kali Total hemosit = jumlah sel terhitung x (volume hemasitometer) -1 x pengenceran = 100 x (1 x 10-4 ) -1 x 5 = 5 x 10 6 sel ml -1 Lampiran 7 Prosedur analisis proksimat Analisis kadar air Cawan dipanaskan di dalam oven pada suhu 110 o C selama 1 jam kemudian dimasukkan ke dalam desikator selama 30 menit sebelum ditimbang (X1). Sampel ditimbang sebanyak 2-3 g (A) kemudian dimasukkan ke dalam cawan dan dipanaskan di dalam oven pada suhu 110 o C selama 4 jam. Cawan didinginkan dalam desikator selama 30 menit sebelum ditimbang kembali (X2). Kadar air dihitung dengan menggunakan rumus berikut: Kadar air = (X 1 + A) X 2 A 100%

7 45 Analisis kadar abu Cawan dipanaskan di dalam oven pada suhu 110 o C selama 1 jam kemudian dimasukkan ke dalam desikator selama 30 menit sebelum ditimbang (X1). Sampel ditimbang sebanyak 2-3 g (A) kemudian dimasukkan ke dalam cawan dan dipanaskan di dalam tanur pada suhu 600 o C sampai bahan menjadi abu. Setelah suhu cawan turun sampai suhu o C, cawan didinginkan dalam desikator selama 30 menit sebelum ditimbang kembali (X2). Kadar abu dihitung dengan menggunakan rumus berikut: Kadar abu = (X 2 X 1 ) A 100% Analisis kadar protein (metode Kjehdall) Pada tahap oksidasi, sampel sebanyak 0,5 g dimasukkan ke dalam labu Kjehdall, kemudian ditambahkan 3 g katalis K 2 SO 4 +CuSO 4.5H 2 O (9:1) dan 10 ml H2SO4 pekat. Labu dipanaskan pada suhu 400 o C (±1 jam) sampai larutan dalam labu berwarna hijau bening. Selanjutnya larutan didinginkan selama ±30 menit dan ditambahkan 25 air destilasi. Setelah itu larutan dimasukkan ke dalam labu takar dan diencerkan dengan akuades sampai volume larutan tersebut mencapai 100 ml (A). Pada tahap destilasi, H2SO4 0,05 N sebanyak 10 ml dituang ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 2 tetes indikator methylred (B). Selanjutnya, 10 ml NaOH 30% ditambahkan pada larutan A sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam labu Kjehdall. Kemudian dilakukan destruksi selama 10 menit mulai saat tetesan pertama pada larutan B. Pada tahap titrasi, hasil destruksi dititrasi dengan NaOH 0,05 N. Blanko dibuat dengan melakukan prosedur yang sama tanpa penambahan sampel. Kadar protein dihitung menggunakan rumus berikut: Kadar protein = 0,0007 (V b V s ) 6,25 20 A 100% Ket: Vb = Volume titran NaOH 0,05 N untuk blanko (ml) Vs = Volume titran NaOH 0,05 N untuk sampel (ml) A = Bobot sampel (g) * = Setiap ml titran NaOH (0,05 N) ekivalen dengan 0,0007 g N ** = Faktor nitrogen Analisis lipid (metode Folch) Sampel sebanyak 2 g (A) ditambahkan 40 ml larutan kloroform:metanol (2:1). Senjutnya, dihomogenkan selama 5 menit dengan sentrifuse pada rpm dan disaring menggunakan vacuum pump. Hasil penyaringan dipindahkan ke dalam labu pemisah yang sebelumnya telah diisi dengan larutan MgCl2.6H2O sebanyak

8 46 0,2 kali volume larutan kloroform-metanol yang digunakan. Selanjutnya, larutan kembali disaring dan dibilas dengan menggunakan 10 ml larutan kloroformmetanol. Setelah disaring larutan di dalam labu pemisah ditutup dan diaduk hingga merata selama 1 menit dan didiamkan selama 1 malam hingga terpisah menjadi 2 lapisan. Lapisan bagian bawah diambil dan ditampung dengan labu lain yang telah diketahui bobotnya (C). Selanjutnya larutan dalam labu tersebut diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator hingga larutan dalam labu menguap semua, kemudian labu tersebut ditimbang kembali (B). Kadar lemak dihitung dengan menggunakan rumus berikut: Analisis serat kasar Kadar lipid = (C B) A 100% Kertas saring dipanaskan dalam oven selama 1 jam pada suhu 110 o C, setelah itu didinginkan dalam deksikator sebelum ditimbang (X1). Sampel A sebanyak 0,5 g ditambahkan 50 ml H 2 SO 4 0,3 N dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml untuk dipanaskan selama 30 menit. Selanjutnya, 25 ml NaOH 1,5 N ditambahkan dan dipanaskan kembali selama 30 menit. Larutan dan bahan yang telah dipanaskan kemudian disaring dalam corong Buchner yang dihubungkan dengan vacuum pump untuk mempercepat proses penyaringan. Larutan dan bahan yang tertinggal dalam corong dibilas secara berturut-turut menggunakan 50 ml air panas; 50 ml H2SO4 0,3 N; 50 ml air panas dan 25 ml aseton. Kertas saring dan isinya dimasukkan ke dalam cawan porselin lalu dikeringkan selama 1 jam dan kemudian didinginkan dalam deksikator sebelum ditimbang (X2). Selanjutnya kertas saring dan isinya tersebut dipanaskan dalam tanur pada suhu 600 o C hingga berwarna putih, kemudian didinginkan dalam deksikator dan ditimbang (X3). Kadar serat kasar dihitung dengan menggunakan rumus berikut: Kadar serat kasar = (X 2 X 1 X 3 ) A 100%

9 47 Lampiran 8 Prosedur analisis enzim Aktivitas enzim amylase (Bergmeyer dan Grassi 1983) Perlakuan Blanko Standar Sampel (ml) (ml) (ml) Buffer borat (0,01 M; ph 8,0) 1,0 1,0 1,0 Substrat kasein (20 mmol;, ph 8,0) 1,0 1,0 1,0 Enzim dalam CaCl2 (2 mm) - - 0,2 Tirosin standar - 0,2 - Aaquades 0,2 - - Inkubasi pada 37 o C tepat, 10 menit TCA (0,1 M) 2,0 2,0 2,0 CaCl2 (2 mm) - - 0,2 Enzim dalam CaCl2 (2 mm) 0,2 0,2 - Inkubasi pada 37 o C tepat, 10 menit Sentrifusi rpm selama 10 menit Filtrat 1,5 1,5 1,5 Na2CO3 (0,4 M) 5,0 5,0 5,0 Pereaksi folin (1:2) 1,0 1,0 1,0 Diamkan selama 20 menit pada 7 o C Ukur absorbansi pada 578 nm Aktivitas enzim amylase (Bernfeld 1955) Blanko Standar Sampel Perlakuan (ml) (ml) (ml) Enzim 0,1-0,1 Larutan pati 0,1 0,1 0,1 Inkubasi 20 o C, 3 menit Pereaksi DNS 2,0 2,0 2,0 Ditempatkan dalam air mendidih selama 5 menit Ukur absorbansi pada 550 nm

10 48 Lampiran 9 Hasil analisis proksimat udang vaname dan pakan perlakuan Komposisi biokimia tubuh udang vaname (n=5) sebelum (awal) dan setelah pemberian empat jenis pakan perlakuan selama 30 hari Parameter analisis Komposisi tubuh udang perlakuan* Awal Kontrol Pro+Pre 1% Pro+Pre 2% Pro+Pre 3% Kadar abu 14,38 13,27 13,55 12,18 11,67 Protein 56,32 61,78 58,19 62,34 64,13 Lemak 6,97 5,62 5,31 5,89 6,92 Serat kasar 6,61 4,94 3,93 3,41 4,22 BETN 15,71 14,39 19,02 16,19 13,06 *dalam persen bobot kering Komposisi pakan udang perlakuan Parameter analisis Komposisi pakan perlakuan* Kontrol Pro+Pre 1% Pro+Pre 2% Pro+Pre 3% Kadar abu 10,73 10,82 10,76 10,74 Protein 39,42 39,03 37,89 38,78 Lemak 15,35 14,97 14,41 14,34 Serat kasar 3,23 3,31 2,61 2,43 BETN 31,34 30,74 31,49 30,82 *dalam persen bobot kering Lampiran 10 Hasil analisis oligosakarida pada ekstrak ubi jalar dan pakan udang dengan HPLC Ekstrak ubi jalar (50%)* Name Migration Time Area Height PPM Percentage Maltoheptaosa ,93 Raffinosa ,07 Sukrosa ,43 *Pengenceran 100 kali

11 49 Pakan komersil* Name Migration Area Height PPM Percentage Time Maltoheptaosa ,07 Sukrosa , *Pengenceran 2 kali

12 50 Lampiran 11 Hasil perhitungan pertumbuhan bakteri SKT-b Jam ke Konsentrasi bakteri SKT-b Cfu ml -1 Log cfu ml ,80 x ,68 2 3,70 x ,57 4 6,92 x ,84 6 8,90 x ,95 8 1,77 x , ,90 x , ,03 x , ,12 x , ,90 x , ,80 x , ,77 x , ,13 x ,50 Lampiran 12 Hasil pengamatan tingkat infeksi IMNV pada udang vaname Perlakuan Kontrol (-) Kontrol (+) Pro+Pre 1% Pro+Pre 2% Pro+Pre 3% Ulangan Tingkat infeksi (ekor) Ringan Sedang Berat Sangat berat Mati

13 Lampiran 13 Hasil pengukuran kualitas air pemeliharaan udang selama perlakuan 51 Parameter Suhu ( o C) Salinitas ( o /oo) Oksigen terlarut (mg/l) Amonia (mg/l) ph Perlakuan Waktu pengukuran Kontrol Kontrol Pro+Pre Pro+Pre Pro+Pre (-) (+) 1% 2% 3% Awal 29,0 28,5 29,0 28,5 28,5 Pertengahan 29,0 29,0 29,0 28,0 29,0 Akhir 28,5 28,0 29,0 28,0 29,0 Awal 31,0 32,0 32,0 31,0 32,0 Pertengahan 32,0 35,0 35,0 34,0 35,0 Akhir 35,0 35,0 35,0 32,0 35,0 Awal 6,6 7,5 7,9 7,2 7,5 Pertengahan 6,5 6,4 6,1 6,4 6,1 Akhir 3,9 3,5 3,9 4,0 3,5 Awal < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 Pertengahan < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 Akhir < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 Awal 8,0 7,9 7,8 7,9 7,8 Pertengahan 7,5 7,5 7,4 7,5 7,4 Akhir 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0

14 52 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Ciamis pada tanggal 24 Februari 1984 sebagai anak ke dua dari lima bersaudara oleh pasangan Suwarno Prajadinata dan Euis Irayani. Penulis menikah dengan Firnas Nadirman dan telah dikarunia dua orang anak, Reina Almira Firnas dan Najib Aqil Firnas. Penulis menyelesaikan pendidikan sekolah menengah atas di SMA Negeri 2 Ciamis tahun Pada Tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) dan memilih Program Studi Teknologi dan Manajemen Akuakultur, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Pendidikan sarjana penulis selasaikan tahun Pada tahun 2010, penulis mendapatkan kesempatan untuk menempuh pendidikan magister ke Sekolah Pascasarjana IPB, program studi Ilmu Akuakultur. Bantuan dana untuk pendidikan magister diperoleh dari Program Diploma IPB. Setelah lulus pendidikan sarjana, di tahun yang sama, penulis diterima sebagai staf Research and Development di Tambak Pinang Gading. Mulai tahun 2007 sampai sekarang, penulis bekerja sebagai staf pengajar di Program Diploma IPB, pada Program Keahlian Teknologi Produksi dan Manajemen Perikanan Budidaya. Bidang ilmu yang diampu meliputi mikrobiologi, penyakit dan kesehatan ikan serta lingkungan akuatik. Penulis juga terlibat dalam kegiatan konseling (sebagai konselor) untuk mahasiswa Program Diploma.