Lampiran 1. Komposisi media Sea Water Completed (SWC) untuk 1 L. Yeast extract

Transkripsi

1 50 LAMPIRAN 50

2 51 Lampiran 1. Komposisi media Sea Water Completed (SWC) untuk 1 L Bahan Pepton Yeast extract Gliserol Agar Air laut Air destilata Jumlah 5 gr 1 gr 3 ml 15 gr 750 ml 250 ml

3 52 Lampiran 2. Prosedur analisis logam berat Pb terlarut dalam contoh air laut (Hutagalung et al., 1997) 1. Contoh air laut (telah disaring dengan kertas saring ukuran pori 0,45 μm), standar, dan blanko diambil sebanyak 250 ml 2. ph contoh disesuaikan menjadi ± 3 dengan menambahkan H 2 SO 4 pekat sebanyak 1 ml 3. Contoh ditambahkan larutan APDC (2%) sebanyak 5 ml, lalu dikocok 5 Menit 4. Panaskan selama 1 jam dan dinginkan 5. Masukkan ke dalam corong pisah polyetilen 6. Kemudian ditambahkan 10 ml MIBK 7. Contoh dikocok (5 menit) dan dibiarkan hingga terbentuk 2 fase (± 10 menit) 8. Fase anorganik (lapisan bawah) di buang dan diambil fase organiknya (lapisan atas) 9. Fase organik ditambahkan HNO3 sebanyak 1 ml dan dikocok 2 5 menit. Diamkan 15 menit 10. Biarkan hingga terbentuk dua fase 11. Ambil fase anorganik (lapisan bawah) dan siap diukur dengan AAS menggunakan nyala udara asetilen. Konsentrasi logam berat terlarut dapat langsung dilihat pada hasil print-out hasil pembacaan AAS.

4 53 Lampiran 3. Prosedur analisis Total Suspended Solid (TSS) dalam contoh air laut 1. Membran miliophore 0,45 µm dipreparasi dengan disaring dengan 60 ml akuades menggunakan vacuum pump 2. Membran dioven selama 1 jam dengan suhu 100 o C dan dinginkan di dalam desikator selama setengah jam 3. Berat kering membrane ditimbang sehingga mendapatkan berat awal (Wo dalam gram) 4. Air sampel 250 ml disaring dengan membran yang sudah dipreparasi sebelumnya 5. Setelah air sampel disaring, bilas menggunakan akuades dengan jumlah yang sama dengan air sampel yang disaring sebelumnya 6. Membran dioven selama satu jam dan didinginkan di dalam desikator 7. berat akhir membran ditimbang sehingga didapat berat akhir (Wt dalam gram) 8. Nilai TSS didapat dengan rumus sebagai berikut: TSS (mg/l) =

5 54 Lampiran 4. Prosedur analisis Nitrat (NO 3 N) dalam contoh air laut 1. Contoh air laut dan blanko diambil sebanyak 5 ml dan disaring dengan kertas saring 2. Contoh ditambahkan 0,5 ml Bruscine dan 5 ml H 2 SO 4 pekat 3. Kemudian contoh dihomogenkan dengan kortex 4. Contoh dipanaskan setengah jam kemudian dinginkan 5. Kemudian diukur arbsorbansinya dengan spektofotometer pada λ = 410 nm dan dicari nilai nitratnya dengan rumus sebagai berikut :

6 55 Lampiran 5. Prosedur analisis Nitrit (NO 2 N) dalam contoh air laut 1. Contoh air laut dan blanko diambil sebanyak 10 ml dan disaring dengan kertas saring 2. Contoh ditambahkan 8 tetes pewarna nitrit 3. Kemudian contoh dihomogenkan dengan kortex da didiamka selama 5 menit 4. Kemudian diukur arbsorbansinya dengan spektofotometer pada λ = 543 nm dan dicari nilai nitritnya dengan rumus sebagai berikut :

7 56 Lampiran 6. Prosedur analisis Amonia (NH 3 N) dalam contoh air laut 1. Contoh air laut dan blanko diambil sebanyak 25 ml dan disaring dengan kertas saring 2. Contoh ditambahkan 1 ml fenol dan 1 ml sodium nitrofusit 3. Kemudian contoh ditambahka 2,5 ml oksidation solution dan didiamkan selama 1 jam di ruangan gelap 4. Contoh diukur arbsorbansinya dengan spektofotometer pada λ = 640 nm dan dicari nilai nitritnya dengan rumus sebagai berikut :

8 57 Lampiran 7. Prosedur analisis perhitungan total bakteri 1. Pilih cawan yang bakterinya adalah yang mengandung koloni antara Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua (satuan) dan angka kedua (desimal), apabila angka ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5 harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua 3. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni antara koloni dan perbandingan hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil dari atau sama dengan dua, maka nilai tersebut dirata-ratakan dengan memperhitungkan pengencerannya

9 58 Lampiran 8. Prosedur analisis uji pewarnaan Gram 1. Bersihkan kaca objek dengan kapas yang telah diberi alcohol 2. Teteskan akuades steril pada bagian tengah kaca objek 3. Ambil biakkan bakteri pada agar miring dengan menggunakan jarum ose steril dan disuspensikan dengan akuades pada kaca objek 4. Preparat dibiarkan mengering dengan difiksasi di atas Bunsen 5. Tetesi preparat dengan larutan Kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dibilas dengan akuades dengan cara memegang kaca objek pada posisi miring dan dikeringkan dengan tisu secara perlahanlahan 6. Tetesi preparat dengan larutan lugol dan dibiarkan selama 2 menit lalu dibilas dengan akuades 7. Tetesi preparat dengan larutan pemucat warna yaitu alkohol 95%, kemudian dicuci dengan larutan akuades dan dikeringkan dengan menggunakan tisu. 8. Tetesi preparat dengan larutan safranin selama 30 detik lalu dicuci dengan akuades dan dikeringkan menggunakan tisu.

10 59 Lampiran 9. Prosedur analisis uji pewarnaan spora 1. Satu sampai dua ose air steril diletakkan pada kaca objek, kemudian dihomogenkan dan biarkan kering diudara 2. Olesan bakteri ditetesi pewarna malachite green dan dipanaskan di atas Bunsen selama 10 menit, namun jangan sampai mengering atau mendidih. 3. Setiap kali pewarna menjadi kering, tetesi dengan pewarna baru. Setelah itu dinginkan kaca objek 4. Warna dicuci dengan hati-hati selama detik, 5. Olesan diberi larutan safranin selama 30 detik, dibilas kembali dengan menggunakan air dan dikeringkan dengan kertas serap.

11 60 Lampiran 10. Prosedur analisis uji motilitas 1. Tumbuhkan isolat bakteri ke dalam media SWC broth dengan menggunakan jarum ose tusuk steril dan diinubasi selama satu hari pada suhu 37 o C 2. Isolat dambil dan diteteskan diatas kaca objek yang sudah dibersihkan dengan alkohol dan dikeringkan kemudian dilihat pergerakannya dibawah mikroskop.

12 61 Lampiran 11. Prosedur analisis uji hidrolisis pati 1. Biakkan digoreskan pada setengah bagian cawan yang berisi medium Nutrient Agar ditambah pati dan diinkubasikan pada suhu 30ºC selama dua hari 2. Teteskan larutan iodium pada koloni yang tumbuh 3. Uji aktivitas hidrolisis pati ini dikatakan positif jika tidak terbentuk warna biru sewaktu penambahan larutan iodium ke dalam media.

13 62 Lampiran 12. Prosedur analisis uji hidrolisis protein 1. Bakteri digoreskan pada setengah bagian cawan yang berisi medium Nutrient Agar yang ditambah Skim Milk Agar (SMA) dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam 2. Uji hidrolisis protein positif ditandai dengan adanya areal bening disekeliling koloni

14 63 Lampiran 13. Prosedur analisis uji hidrolisis lemak 1. Bakteri digoreskan pada cawan petri yang berisi medium NA yang telah ditambah lipid 1% dan indikator neutral red dan inkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam 2. Uji hidrolisis lemak positif ditandai dengan koloni yang dapat menghidrolisis lemak menjadi gliserol dan asam lemak yang terlihat berwarna merah di bawah koloni bakteri.

15 64 Lampiran 14. Prosedur analisis uji katalase 1. Secara aseptik diambil satu jarum ose isolat bakteri dari agar miring dan dipindahkan pada kaca objek 2. Teteskan satu sampai dua tetes larutan 3% H 2 O 2 3. Adanya enzim katalase ditandai dengan adanya gelembung-gelembung kecil oksigen yang terlihat seperti busa sabun

16 65 Lampiran 15. Prosedur analisis uji oksidase 1. Kultur bakteri dari agar miring diambil dan dengan steril dioles menggunakan kertas oksidase stripes 3. Jika isolat berubah menjadi ungu berarti isolat tersebut positif mempunyai oksidase sitokrom, jika tidak ada perubahan pada warna isolat maka isolat tersebut tidak memiliki oksidase sitokrom

17 66 Lampiran 16. Prosedur analisis uji indol 1. Isolat diinokulasi ke dalam tabung reaksi yang berisi Tryptone Broth dan diinkubasi pada suhu 35ºC selama dua hari 2. Tambahkan 0,5 ml pereaksi Kovac s 3. Uji ini dikatakan positif jika terbentuk warna merah yang menunjukkan adanya indol dalam medium.

18 67 Lampiran 17. Prosedur analisis uji H 2 S 1. Isolat diinokulasi pada agar miring TSIA dengan cara membuat goresan pada agar miring dan menusukkannya pada bagian bawah agar 2. Lihat perubahan pada media Bagian bawah agar Bagian atas agar Keterangan Agar pecah/terangkat keatas - Produksi gas Agar berwarna hitam - Produksi H2S

19 68 Lampiran 18. Prosedur analisis uji fermentasi gula 1. Isolat ditumbuhkan pada media Oksidative Fermentative yang mengandung 1% glukosa, laktosa, sukrosa. Kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama dua hari 2. Reaksi uji fermentasi gula dinyatakan positif apabila terjadi perubahan warna menjadi kuning pada media yang mengandung gula

20 69 Lampiran 19. Komposisi media yang digunakan (1 L) No Nama media Komposisi Jumlah 1 Nutrient Agar 2 Nutrient Agar (hidrolisis lemak) 3 Nutrient Agar (hidrolisis protein) 4 Tryptone broth 5 Triple Sugar Iron Agar (TSIA) 6 Oksidative Fermentative semi padat Nutrient Agar Akuades Nutrient Agar Mentega (1 %) Akuades Nutrient Agar Skim Milk Akuades Tripton Akuades TSIA Akuades Glukosa Sukrosa Laktosa Mannosa NaCl Agar Tripton K 2 HPO 4 Bromthymol Blue Dye Akuades 23 g 1000 ml 23 g 10 g 1000 ml 23 g 100 ml 1000 ml 10 gr 1000 ml 65 gr 1000 ml 10 gr 10 gr 10 gr 10 gr 5 gr 2 gr 2 gr 0,3 gr 0,08 gr 1000 ml

21 70 Lampiran 20. Data hasil perhitungan TPC dengan standar error JUMLAH KOLONI/GRAM K- Pengenceran Bagian atas Bagian tengah Bagian bawah 10-3 ul1 46 x10 3 TBUD TBUD 10-3 ul2 4 x x10 3 TBUD 10-3 ul3 32 x10 3 TBUD 12 x10 3 Rata-rata 27 x x x ul1 1 x x10 4 TBUD 10-4 ul2 TBUD TBUD TBUD 10-4 ul3 5 x x x10 4 Rata-rata 3 x x x ul1 TBUD 4 x x ul2 TBUD TBUD TBUD 10-5 ul3 3 x10 5 TBUD 0 Rata-rata 3 x x x10 5 Rata-rata jumlah koloni keseluruhan Standar error JUMLAH KOLONI/GRAM K+ Pengenceran Bagian atas Bagian tengah Bagian bawah 10-3 ul1 10x x x ul2 18 x x x ul3 14 x10 3 TBUD 28 x10 3 Rata-rata x x x ul1 TBUD 16 x10 4 TBUD 10-4 ul2 5 x10 4 TBUD TBUD 10-4 ul3 TBUD TBUD TBUD Rata-rata x x10 4 TBUD 10-5 ul1 TBUD 11 x x ul2 TBUD 0 14 x ul3 260 x10 5 TBUD 88 x10 5 Rata-rata x x x10 5 Rata-rata jumlah koloni keseluruhan Standar error JUMLAH KOLONI/GRAM P Pengenceran Bagian atas Bagian tengah Bagian bawah 10-3 ul1 TBUD 16 x x ul2 41 x x x ul3 28 x x x10 3 Rata-rata 34 x x x ul1 10 x x x ul2 11 x10 4 TBUD 6 x ul3 22 x x x10 4 Rata-rata 14 x x x ul1 2 x x10 5 TBUD 10-5 ul2 2 x10 5 TBUD TBUD 10-5 ul x10 5 Rata-rata 2 x x x10 5 Rata-rata jumlah koloni keseluruhan Standar error

22 71 Lampiran 21. Foto dari morfologi sel Batang Gram Positif Kokus Gram Negatif Perbesaran 10 x 100 Perbesaran 10 x 100 Batang Gram Negatif Perbesaran 10 x 100

23 Lampiran 22. Tabel identifikasi Bergey s Mannual Bakteri Genus Alteromonas, Bacillus, Deleya, dan Vibrio 72

24 73 Lampiran 23. Data nilai arbsorbansi tss, nitrat, nitrit, dan amonia Parameter Blanko Stasiun 1 - Wo = TSS (gr) - Wt = Nitrat Nitrit Amonia

25 74 Lampiran 24. Dokumentasi penelitian Pipet Mikro Media SWC Steril GPS Cawan Petri Bahan bahan Media HNO Biakan Bakteri Tunggal Refraktometer

26 Morfologi sel Pewarnaan Gram Pewarnaan spora Uji motilitas Uji morfologi Phallusia sp. Isolasi bakteri asosiasi Perhitungan total bakteri (TPC) Morfologi koloni Bentuk sel SAMPLING P. Onrust Uji fisiologi Uji hidrolisis pati Uji hidrolisis lemak Uji hidrolisis Protein Uji oksidase Uji indol Uji H2S dan fermentasi gula Uji katalase Pengukuran kualitas perairan secara insitu Pengukuran kualitas perairan di laboratorium Gambar 3. Diagram Alir Penelitian 22

27 Tabel 5. Uji Morfologi dan Fisiologi Koloni Bakteri Asosiasi Phallusia sp. Media K+ K- P MORFOLOGI KOLONI MORFOLOGI SEL UJI FISIOLOGI Kode Bentuk Uji Gram Uji Hidrolisis Fermentasi Gula Elevasi Warna Uji Spora Katalase Oksidase H2S Indol bakteri atas Bentuk Gram motilitas Pati Protein Lemak Glukosa Laktosa Sukrosa Mannose Ba1 Lonjong besar Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Ba2 Bulat Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Ba3 Agak lonjong Timbul susu Kokus - Motil Gas Ba4 Bulat Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Bb1 Bulat kecil Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Bc1 Bulat sedang Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Bc2 Lonjong Timbul susu Basil panjang - Motil Gas Ka1 Tidak beraturan Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Ka2 Lonjong besar Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Sel Ka3 Bulat Timbul susu Basil pendek + vegetatif Motil Gas Ka4 Lonjong sempurna Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Ka5 Bulat kecil Timbul susu Kokus - Motil Gas Kc2 Besar tak beratur Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Non Pba1 Bulat sedang Timbul susu Basil pendek - motil Gas Pba2 Lonjong lancip Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Pba3 Lonjong lancip Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Pbb1 Bulat kecil Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Pbb2 Bulat sedang Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Pbc1 Lonjong besar Datar susu Basil panjang - Motil Gas Pbc2 Tak beraturan Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Pbc3 Agak lonjong Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Pbc4 Lonjong Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Pbc5 Agak bulat Timbul susu Basil pendek - Motil Gas Pbc6 Lonjong Timbul susu Basil pendek - Motil Gas

28 Tabel 6. Karakteristik Morfologi dan Fisiologi Genus Alteromonas, Bacillus, Deleya, Vibrio Berdasarkan Bergey's Mannual Media K+ K- P MORFOLOGI SEL UJI FISIOLOGI Pendugaan Nama Bakteri Kode Uji Gram Uji Hidrolisis Fermentasi Gula Uji Spora Katalase Oksidase H 2S Genus Bentuk Gram Pati Lemak Glukosa Laktosa Mannose bakteri Motilitas Sukrosa Ba 1 Basil - Motil Gas Vibrio Ba 2 Basil - Motil Gas Alteromonas Ba 3 Kokus Motil Gas Unidentified Ba 4 Basil - Motil Deleya Bb 1 Basil - Motil Gas Vibrio Bc 1 Basil - Motil Gas Alteromonas Bc 2 Basil - Motil Gas Vibrio Ka 1 Basil - Motil Gas Vibrio Ka 2 Basil - Motil Gas Vibrio Ka 3 Basil + Endospora Motil D + D Gas + Bacillus Ka 4 Basil - Motil Gas Vibrio Ka 5 Kokus Motil Gas Unidentified Kc 2 Basil - Motil Gas Vibrio Pba 1 Basil - Motil - Gas Alteromonas Pba 2 Basil - Motil - Gas Alteromonas Pba 3 Basil - Motil Gas Vibrio Pbb 1 Basil - Motil Gas Vibrio Pbb 2 Basil - Motil Gas Vibrio Pbc 1 Basil - Motil Gas Vibrio Pbc 2 Basil - Motil Gas Vibrio Pbc 3 Basil - Motil Gas Vibrio Pbc 4 Basil - Motil - Gas Alteromonas Pbc 5 Basil Motil Gas Unidentified Pbc 6 Basil - Motil - Gas Alteromonas 38