3 METODE PENELITIAN. Persiapan Prebiotik (Oligosakarida)

Transkripsi

1 10 melibatkan pelepasan enzim ke dalam phagosome dan produksi Reactive Oxygen Intermediate (ROI) yang kini disebut respiratory burst (Rodriquez and Le Moullac 2000). Klasifikasi tipe hemosit pada krustasea berdasarkan keberadaan cytoplasmic granules, yaitu sel hialin (HCS), sel hemosit semigranular (SGHs) dan sel hemosit granular (GHS) (Smith et al. 2003; Hauton 2012). Sel hialin merupakan tipe sel yang paling kecil dengan rasio nukleus sitoplasma tinggi dan tanpa atau hanya sedikit granula sitoplasma; sel granular merupakan tipe sel paling besar dengan nukleus yang lebih kecil dan terbungkus dengan granula; sel semi-granular merupakan tipe sel diantara hialin dan sel granular. HCS memiliki peran dalam fagositosis sementara SGHs memiliki peran dalam enkapsulasi, pengenalan awal, melanisation dan koagulasi di sebagian kelompok dan GHS berfungsi dalam proses melanisation, menghasilkan dan mengeluarkan peptida antimikroba dan terlibat dalam reaksi sitotoksik (Smith et al. 2003). 3 METODE PENELITIAN Persiapan Prebiotik (Oligosakarida) Pembuatan Tepung Kukus Ubi Jalar (Marlis 2008) Ubi jalar segar dibersihkan dan dikupas, lalu diiris dengan menggunakan pisau. Setelah itu, ubi jalar dikeringkan dalam oven pengering pada suhu 55 o C selama 5 jam atau hingga irisan ubi jalar dapat dipatahkan dengan tangan. Irisan ubi jalar kemudian digiling dengan willey mill dan diayak pada size 60 mesh. Tahapan dalam pembuatan tepung segar ubi jalar dapat dilihat pada Lampiran 1. Sebanyak 500 gram tepung segar ubi jalar ditambahkan air dengan perbandingan 1:1 (w/v) dan dikukus pada suhu 100 o C selama 30 menit. Hasil pengukusan tersebut dikeringkan dalam oven pada suhu 55 o C selama 18 jam (Gambar 3). (A) (B) Gambar 3. Ubi jalar varietas sukuh (Ipomoea batatas L): (A) buah ubi jalar varietas sukuh (B) tepung kukus ubi jalar varietas sukuh.

2 11 Ekstraksi Oligosakarida (Muchtadi 1989) Pada proses ekstraksi, sebanyak 100 gram tepung kukus ubi jalar disuspensikan ke dalam 1 L etanol 70% dan diaduk selama 15 jam menggunakan magnetic stirer pada suhu ruang. Penyaringan dilakukan dengan menggunakan kertas saring whatman no.1 dan residu dibilas dengan menggunakan etanol 70%. Filtrat yang diperoleh dipekatkan menggunakan evaporator vakum pada suhu 40 o C. Hasil pemekatan disentrifuse pada 5000 rpm selama 10 menit untuk mengendapkan kotoran, sehingga ekstrak mudah disterilisasi dengan kertas saring. Tahapan pembuatan ekstrak oligosakarida dapat dilihat pada Lampiran 2. Pengukuran Konsentrasi Oligosakarida (Apriyantono 1989) Pengukuran konsentrasi oligosakarida atau Total Padatan Terlarut (TPT) bertujuan untuk mengetahui kepekatan padatan terlarut prebiotik yang diperlukan pada pengujian in vivo. Cawan porselin dikeringkan selama 2 jam dalam oven 100 o C, kemudian didinginkan dalam desikator hingga diperoleh berat tetap. Cawan tersebut kemudian ditimbang (a gram). Sebanyak 1 ml oligosakarida yang diekstraksi dari ubi jalar ditempatkan dalam cawan porselen tersebut dan ditimbang (b gram). Kemudian dimasukkan ke dalam oven selama 24 jam dengan suhu 100 o C. Setelah kering, cawan didinginkan dalam desikator selama 10 menit atau hingga berat cawan stabil, kemudian cawan tersebut ditimbang (c gram). Total padatan terlarut dihitung dari hasil perbandingan berat ekstrak setelah dikeringkan dengan berat ekstrak sebelum dikeringkan. Rumus yang digunakan untuk TPT yaitu sebagai berikut: TPT = c a b 100 % Keterangan: a = berat cawan sebelum diisi ekstrak oligosakarida b = berat cawan setelah diisi ekstrak oligosakarida c = berat cawan sebelum diisi ekstrak oligosakarida dan di oven 24 jam Konsentrasi oligosakarida (prebiotik) yang digunakan pada penelitian ini adalah konsentrasi TPT 5% (Marlis 2008). Hasil penghitungan TPT dapat dilihat pada Lampiran 3. Analisis Kandungan Oligosakarida Analisis oligosakarida dilakukan dengan menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Analisa ini bertujuan untuk mengetahui jenis dan konsentrasi oligosakarida yang terkandung dalam prebiotik hasil ekstraksi. Kolom yang digunakan adalah carbohydrate column (4,6 mm x 250 mm), ukuran partikel 4 µm dengan refraktif indeks detector dan berlaju alir (flow rate) 2,0 ml/menit. Fase gerak yang digunakan adalah asetonitril dan air dengan perbandingan asetonitril: aquabidest (80:20). Volume sampel yang diinjeksikan adalah 20 µl dengan temperatur kolom 40 o C. Standar gula yang digunakan adalah fruktooligosakarida (FOS), galaktooligosakarida (GOS), dan inulin.

3 12 Stok Bakteri dan Virus Bakteri Probiotik SKT-b R Bakteri probiotik SKT-b merupakan bakteri Vibrio alginolyticus yang diperoleh dari hasil penapisan pada media kultur Skeletonema sp. di lingkungan pembenihan udang windu, Labuan Banten (Widanarni et al. 2003). Bakteri SKT-b dibuat resisten terhadap antibiotik rifampisin sebagai penanda molekuler untuk membedakan bakteri yang diinokulasikan dengan bakteri yang sebelumnya telah ada pada media pemeliharaan maupun tubuh udang. Tahapan dalam Pembuatan bakteri menjadi resisten terhadap rifampisin (Rf R ) dapat dilihat pada Lampiran 4. Untuk selanjutnya bakteri SKT-b yang telah resisten rifampisin disebut dengan SKT-b R. Bakteri dikultur ulang dan dimurnikan. Lalu dikonfirmasi melalui uji morfologi, fisiologi dan biokimia serta ditentukan nilai Total Plating Count (TPC). Hasil Pengujian SKT-b R ditampilkan dalam Lampiran 5. Bakteri Vibrio harveyi Jenis bakteri patogen yang digunakan pada penelitian ini adalah V. harveyi MR Isolat V. harveyi merupakan koleksi Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Institut Pertanian Bogor. Bakteri dikultur ulang dan dimurnikan. Lalu dikonfirmasi melalui uji morfologi, fisiologi dan biokimia serta ditentukan nilai Total Plating Count (TPC). Hasil pengujian V. harveyi MR 5339 ditampilkan dalam Lampiran 5. Virus IMN (Infectious Myonecrosis) Udang vaname positif IMNV didapatkan dari Balai Pengembangan Budidaya Air Payau (BPBAP) Situbondo, Jawa Timur. Prosedur pembuatan ekstrak IMNV adalah daging udang positif IMNV dicacah (tanpa hepatopankreas, usus, dan karapas), kemudian dilarutkan dalam PBS (10x) dan sentrifuse pada suhu 4 o C dengan kecepatan 6500 rpm selama 20 menit. Setelah itu supernatan diambil dan dimasukkan dalam mikrotube baru. Selanjutnya mikrotube disentrifuse dengan kecepatan rpm (4 o C) selama 20 menit. Supernatan diambil dan difilter dengan syringe filter (0,45 µm) yang diekstrak untuk didapatkan stok virus IMNV. Hasil ekstrak virus IMNV disimpan pada suhu - 70 o C. Uji In Vivo Uji in vivo dilakukan dalam dua tahap yaitu aplikasi sinbiotik pada udang vaname melalui pakan dan pengujian resistensi udang vaname terhadap ko-infeksi IMNV dan V. harveyi. Pengujian dilakukan sebanyak lima perlakuan dan tiga kali ulangan (Tabel 3).

4 13 Tabel 3. Perlakuan dosis sinbiotik dan ko-infeksi IMNV dan V. harveyi pada udang vaname. No Perlakuan Keterangan 1 K- Pemberian pakan tanpa penambahan sinbiotik dan tanpa perlakuan ko-infeksi (kontrol negatif) 2 K+ Pemberian pakan tanpa penambahan sinbiotik serta perlakuan ko-infeksi (kontrol positif) 3 A Pemberian pakan dengan penambahan sinbiotik dosis A (probiotik sebesar 0,5% dan prebiotik sebesar 1%) serta perlakuan ko-infeksi 4 B Pemberian pakan dengan penambahan sinbiotik dosis B (probiotik sebesar 1% dan prebiotik sebesar 2%) serta perlakuan ko-infeksi 5 C Pemberian pakan dengan penambahan sinbiotik dosis C (probiotik sebesar 2% dan prebiotik sebesar 4%) serta perlakuan ko-infeksi. Aplikasi Sinbiotik pada Udang Vaname Pemberian sinbiotik berbagai dosis (probiotik 0% + prebiotik 0% (K-) dan (K+), probiotik 0,5% + prebiotik 1% (A), probiotik 1% + prebiotik 2% (B), probiotik 2% + prebiotik 4% (C)) dilakukan selama 30 hari pemeliharaan. Perlakuan diberikan melalui pakan untuk membandingkan efektivitas dosis sinbiotik dalam meningkatkan performa pertumbuhan dan sistem imun pada udang vaname. a. Persiapan wadah dan media pemeliharaan Wadah pemeliharaan berupa akuarium kaca berukuran 60x30x40 cm 3. Sebelum digunakan, wadah didesinfeksi dengan klorin 100 ppm selama 24 jam. Wadah dibilas dengan air tawar dan dijemur di bawah sinar matahari untuk menghilangkan residu klorin. Setelah itu akuarium ditutup dengan plastik hitam untuk mengurangi intensitas cahaya yang masuk. Masing-masing akuarium dilengkapi dengan shelter (pipa paralon 0,5 inchi), batu aerasi, dan jaring penutup. Bagian atas akuarium diberi lampu pijar (40 Watt) yang berfungsi untuk mempertahankan suhu pada malam hari. Air laut yang digunakan pada penelitian ini berasal dari pantai Ancol. Air laut disimpan dalam tandon dan didesinfeksi dengan klorin 30 ppm selama 24 jam. Setelah itu residu klorin dihilangkan dengan menambahkan Na-Thiosulfat 15 ppm dan diaerasi. Setiap akuarium diisi air laut dengan volume 30 liter. Kualitas air dalam akuarium selama perlakuan, dipertahankan stabil dan pergantian air dilakukan 10%/hari. Kotoran dan sisa pakan yang terakumulasi dalam akuarium dikeluarkan melalui penyiponan. Kualitas air media pemeliharaan selama penelitian adalah temperatur air o C, salinitas ppt, amonia-nitrogen 0,005-0,016 mg/l, oksigen 4,5 6,5 mg/l, ph 7,4-7,5. b. Organisme uji Organisme uji adalah udang Litopenaeus vannamei Specific Pathogen Free (SPF) terhadap White Spot Syndrome Virus (WSSV), Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis (IHHNV), Taura Syndrome Virus (TSV), dan

5 14 Infectious Myonecrosis Virus (IMNV). Udang vaname diperoleh dari hatchery komersial di Anyer, Banten. Perlakuan diberikan pada udang dengan berat ratarata 0,3 ± 0.02 g. Udang dipelihara dalam lingkungan terkontrol pada akuarium dengan kepadatan 15 ekor/akuarium selama 30 hari. Pakan yang diberikan berupa pakan komersil dengan frekuensi pemberian sebanyak empat kali sehari. c. Pembuatan pakan perlakuan Perlakuan sinbiotik diberikan ke udang melalui pakan berupa pelet udang komersial dan binder berupa putih telur sebanyak 2% dari bobot pelet. Bakteri SKT-b R dan ekstraksi oligosakarida ditambahkan ke pakan dengan dosis sesuai perlakuan (probiotik 0,5% + 1% prebiotik (A), probiotik 1% + prebiotik 2% (B), probiotik 2% + prebiotik 4% (C)). Pakan untuk udang kontrol juga ditambahkan putih telur 2% tanpa bakteri SKT-b R dan oligosakarida. Pelet dikeringanginkan selama 15 menit, dibungkus dalam plastik tertutup dan disimpan pada suhu 4 o C. Pembuatan pakan perlakuan dilakukan setiap hari dan diberikan ke udang pada empat kali pemberian pakan, yaitu pada pukul 08.00, 12.00, 16.00, dan WIB. Hasil proksimat pakan uji dapat dilihat pada Lampiran 6. Pengujian Resistensi Udang Vaname terhadap Ko-Infeksi (Uji Tantang) Uji tantang dilakukan untuk mengevaluasi kinerja sinbiotik dalam meningkatkan resistensi udang vaname terhadap ko-infeksi IMNV dan V. harveyi. Udang yang telah diberi pakan perlakuan selama 30 hari, dipuasakan selama 24 jam. Pada hari ke 32 udang diinfeksi dengan IMNV (kecuali kontrol negatif) melalui injeksi bagian punggung antara segmen tiga dan empat. Dosis virus yang diberikan sebanyak 100 µl/udang. Setelah itu dilakukan kultur bakteri V. harveyi yang digunakan untuk infeksi selanjutnya pada udang melalui injeksi setelah 72 jam penyuntikan virus. Kepadatan bakteri V. harveyi yang digunakan adalah 10 3 CFU/mL. Pengamatan dilakukan selama tujuh hari setelah infeksi pertama. Pakan yang diberikan pada perlakuan uji tantang adalah pelet udang komersial tanpa penambahan sinbiotik. Parameter Pengamatan Penghitungan Kelimpahan Bakteri Usus Penghitungan kelimpahan bakteri dilakukan dengan metode hitungan cawan sebar (Madigan et al. 2003). Usus udang (berat 0,1 g) yang dikumpulkan dari 3-5 ekor udang pada masing-masing akuarium dihomogenisasi dalam 0,9 ml phosphate buffer saline (PBS) steril. Pengamatan yang dilakukan meliputi Total Viable Bacterial Count (TBC), Total Presumtive Vibrio Count (TVC) dan Total SKT-b R Count. Media yang digunakan pada percobaan ini adalah Sea Water Complete (SWC) agar, media selektif Thiosulphate Citrate Bile-Salt Sucrose (TCBS) agar, dan TCBS agar+rif 50 µg/ml. Prosedur pembuatan media dan penghitungan bakteri dengan metode hitungan cawan sebar dapat dilihat pada Lampiran 7 dan 8.

6 15 Performa Pertumbuhan a. Laju pertumbuhan harian (LPH) Nilai LPH selama pemeliharaan dengan perlakuan sinbiotik dosis berbeda dihitung berdasarkan Huisman (1987) dengan menggunakan rumus berikut: LPH (%) = t Wt Wo 1 100% Keterangan : We = Bobot rata-rata udang pada akhir perlakuan Ws = Bobot rata-rata udang pada awal perlakuan d = Periode pemeliharaan b. Rasio konversi pakan (FCR) Rasio konversi pakan selama pemeliharaan dengan perlakuan sinbiotik dosis berbeda dihitung berdasarkan Zonneveld et al. (1991) dengan menggunakan rumus berikut: FCR = F Bt + Bm Bo Keterangan: FCR = Konversi pakan F = Jumlah pakan (gram) Bt = Biomassa udang pada saat akhir pelakuan (g) Bm = Biomassa udang yang mati saat perlakuan (g) Bo = Biomassa udang pada saat awal perlakuan (g) Parameter Sistem Imun Parameter imun diukur pada akhir perlakuan sinbiotik (sebelum uji tantang) dan setelah masa pengujian resistensi udang vaname terhadap ko-infeksi IMNV dan V. harveyi selama 7 hari (setelah uji tantang). Parameter yang diukur adalah Total Haemocyte Count (THC), Aktivitas Phenoloxidase (PO), Respiratory Burst (RB), dan Differential Haemocyte (DH). a. Total Haemocyte Count (THC) Sebanyak 0,2 ml hemolim udang diambil dengan menggunakan syringe 1 ml yang telah berisi 0,1 ml antikoagulan. Campuran hemolim-antikoagulan kemudian divorteks hingga merata. Lalu diteteskan pada haemocytometer dan THC dihitung di bawah mikroskop dengan pembesaran 40x. b. Aktivitas Phenoloxidase (PO) (Liu and Chen 2004) Aktivitas PO haemocyte diukur berdasarkan formasi dopachrome yang dihasilkan oleh L-DOPA. Sebanyak 1 ml campuran hemolim-antikoagulan disentrifuse pada 1500 rpm selama 10 menit pada temperatur 4 o C. Supernatan dibuang dan pelet disuspensi kembali secara perlahan-lahan dengan

7 16 menambahkan 1 ml larutan cacodylate-citrate buffer (0,01 M sodium cacodylate, 0,45 M sodium chloride, 0,10 M trisodium citrate, ph 7) dan disentrifuse kembali (1500 rpm selama 10 menit pada temperatur 4 o C). Supernatan yang terbentuk dibuang dan ditambahkan 200 µl cacodylate-citrate buffer (0,01 M sodium cacodylate, 0,45 M sodium chloride, 0,10 M trisodium citrate, ph 7). Suspensi sel sebanyak 100 µl kemudian diinkubasi dengan 50 µl tripsin (1 mg/ml cacodylate buffer) sebagai aktivator selama 10 menit pada temperatur o C. Selanjutnya ditambahkan 50 µl L-DOPA (3 mg/ml cacodylate buffer), didiamkan selama 5 menit dan ditambahkan 800 µl cacodylate buffer. Densitas optikal (OD) diukur dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 490 nm. Larutan standar mengandung 100 µl suspensi hemosit, 50 µl cacodylate buffer (pengganti tripsin) dan 50 µl L-DOPA. Densitas optikal (OD) dari aktivitas PO dinyatakan sebagai formasi dopachrome dalam 50 µl hemolim. c. Respiratory Burst (RB) (Song and Hsieh 1994) Respiratory burst dari hemosit diukur berdasarkan reduksi NBT (nitroblue tetrazolium) sebagai ukuran superoxide anion (O 2 - ). Sebanyak 300 µl campuran hemolim-antikoagulan diinkubasi selama 30 menit dalam suhu ruang. Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit dan supernatan dibuang. Ditambahkan 100 µl NBT (larutan HBSS dengan 0,3 % NBT) dan didiamkan selama 2 jam pada suhu ruang. Kemudian disentrifuse 3000 rpm selama 10 menit, supernatan dibuang dan ditambahkan 100 µl metanol absolut untuk selanjutnya disentrifuse 3000 rpm selama 10 menit (supernatan dibuang). Pelet yang terbentuk kemudian dibilas sebanyak 2 kali dengan metanol 70 %. Selanjutnya 120 µl KOH (2M) dan 140 µl DMSO ditambahkan untuk melarutkan pelet. Pelet yang telah larut kemudian dimasukkan ke dalam microplate untuk diukur densitas optikal (OD) menggunakan microplate reader dengan panjang gelombang 630 nm. Respiratory burst dinyatakan sebagai reduksi NBT per 10 µl hemolim. d. Differential Haemocyte (DH) Differential Haemocyte (DH) dihitung berdasarkan metode yang dilakukan Martin and Graves (1995). Jumlah hemosit dihitung hingga 100 sel dan ditentukan persentase setiap jenisnya (hialin dan granular). Persentase setiap jenis sel hemosit dihitung dengan menggunakan rumus: Persentase jenis sel hemosit = jumlah tiap jenis sel hemosit Total hemosit 100% Sintasan (Survival) Sintasan atau tingkat kelangsungan hidup udang dalam penelitian ini dihitung pada akhir perlakuan sinbiotik dan setelah masa uji tantang. Sintasan udang dihitung dengan menggunakan rumus berikut : Survival = (Nt / No) x 100 % Keterangan : Nt : Jumlah udang yang hidup pada akhir pengamatan (ekor) No : Jumlah udang pada awal pengamatan (ekor) Pengamatan Gejala Klinis dan Konfirmasi IMNV+V. harveyi