Uji Lapang, Kajian Transfer Gen dan Studi

Transkripsi

1 Uji Lapang, Kajian Transfer Gen dan Studi Pra-Komersialisasi ikentang Transgenik

2 Peraturan Perundang2an Terkait: UU No. 7 Th Pangan KepMentan Th UU No. 21 Th Ratifikasi Protokol Keamanan Hayati Cartagena PP No. 28 Th Keamanan, Mutu dan Gizi Pangan PP No. 21 Th Keamanan Hayati PRG KepBer 4 Menteri Th Keamanan Hayati dan Keamanan Pangan PPHRG Peraturan Perundang2an Terkait: Komisi Keamanan Hayati (KKH) Balai Kliring Keamanan Hayati (BKKH) Tim Teknis Keamanan Hayati (TTKH) Sumber: M. Herman)

3 Persyaratan Utama Tanaman Produk Bioteknologi (dalam negeri atau luar negeri), HARUS memenuhi persyaratan: Keamanan Lingkungan, Keamanan Pangan, Keamanan Pakan, dan Memperhatikan dan mempertimbangkan: Kaedah Agama dan Etika Sosial Budaya dan Estetika Sumber: M. Herman)

4 Informasi Keamanan Lingkungan: Weedines Karakter fenotipik Invaseveness Dampak terhadap non-targepredator Parasit Lebah Madu Ulat Sutera Penyakit Lain Mikroba Tanah Potensi gene Flow Dampak terhadap keanekaragaman hayati Sumber: M. Herman)

5 Informasi Keamanan Pangan: Kesepadanan Substansi Perubahan Nilai Gizi Alergenisitas Toksisitas Pertimbangan Lain-lain (marka gen antibiotik) Sumber: M. Herman)

6 (Tanaman Transgenik) Uji Keunggulan dan Kebenaran (3 lokasi pertanaman kentang) Badan Benih Nasional Tim Penilai dan Pelepas Varietas Dilepas Oleh Menteri Pertanian

7 Sumber: Bravo-Almonacid et al Transgenic Res (2012):

8 Kentang sebagai tanaman pangan penting ke 4 di dunia. Di Argentina sebagai makanan pokok yg penting (produksi tahunan ton). Spunta: varietas utama di Argentina utk konsumsi manusia. Tumbuh di daerah subtropics di Afrika dan Amerika Selatan. Infeksi virus (Potato virus Y-PVY) penyakit penting pada tanaman Solanaceae. Keganasan serangan PVY sangat merusak dan kehilangan hasil umbi hingga 80 %. Introduksi ketahanan thd virus ke tanaman rentan banyak kendala yi; kompleksitas genetic dan sumber gen terbatas. Penelitian rekayasa genetic tanaman tahan virus telah dimulai sejak dan transgenic yg tahan PVY telah diperoleh sejak 1989 (Hassairi, 1989). Hasil..ketahanan yg menjanjikan diperoleh..pada kondisi tertentu ketahanan patah.

9 Untuk peningkatan ketahanan melalui mekanisme post-transcriptional gene silencing (PTGS). PTGS mampu mendorong degradasi RNA virus (Waterhouse, 1998) Artificial mikrorna juga telah dikembangkan dalam proteksi virus pada tanaman (Qu et al. 2007). Tanaman transgenic sebelum dikomersiilkan harus diuji secara lengkap terkait dampaknya pada lingkungan maupun kesehatan. Hal-hal yang menjadi perhatian: - Potensial transfer gen (utama) - Dampak terhadap organisme non-target - Kesehatan manusia - Analisis fenotipik dan biokimia - Uji alergenitas dan toksisitas. Fokus penelitian pada galur turunan Spunta (SY230 dan SY233) yg sangat tahan thd PVY: - Skrining rumah kaca - Uji lapangan - Uji fenotipik dan biokimia - Transfer gen pada S. chacoense

10 Materi tanaman - Minituber bebas virus - Tanaman kentang transgenic dan non-transgenic untuk test virus dan produksi umbi - Umbi hasil panen bisa disimpan pada suhu 4 o C hingga 6 bulan - Umbi hasil panen langsung bisa digunakan untuk analisis biokimia. Transformasi tanaman - Transformasi menggunakan deep-method dari irisan minituber dengan Agrobacterium tumefaciens Konstruksi gen (ppbi-cppvy) Schematic representation of the pbi-cppvy expression cassette. The chimeric CPPVY sequence was driven by the CaMV 35S promoter (p35scamv). pnos: nopaline synthase promoter; tnos: nopaline synthase transcription termination sequence.

11

12

13 Southern blot dengan probe spesifik gen CPPVY dan nptii. DNA genome tanaman transgenik tahan PVY dan non-transgenik di potong dengan enzim restriksi EcoRV dan XbaI. Metode deteksi Radioaktif. Northern blot dengan RNA total dari daun, batang dan akar tanaman transgenik dan non-transgenik. Bloting seperti di atas. Western blot dilakukan terhadap protein daun. Elektroforesis dengan 12.5% SDS-PAGE Antibodi dengan antibodi anti-pvy dan antibodi anti-nptii. Deteksi dengan visualisasi BCIP/NBT.

14

15

16

17 Tahap uji lapang dilakukan beberapa kali untuk test analisis stabilitas ketahanan terhadap PVY. Inokulasi dilakukan secara alami dengan menanam plot-plot Spunta yang terinfeksi PVY sebagai sumber inokulum di antara tanaman uji Evaluasi dilakukan dengan teknik DAS-ELISA. Karakter agronomi diuji di empat lokasi uji lapang berbeda ( ).Dengan kondisi lingkungan sangat beda. -2 lokasi daerah produksi kentang yang bebas PVY -2 lokasi lain daerah produksi kentang tapi endemik PVY Design percobaan RCB, terdiri baris tunggal sepanjang 5 m dan jarak antar baris 85 cm. Blok dikelilingi lahan kosong (10 m keliling) dari pagar. LUT, Uji isolasi dan pemusnahan berdasar guideline Komisi Nasional Agrobiotechnology (CONABIA). Jumlah LUT sebanyak 9 secara independent

18 Karakterisasi umbi -Total hasil (g/plot), jumlah umbi/tanaman, rata-rata berat umbi per plot. - Specific Grafity (SG) berdasar berat 5 kg umbi per plot di udara dan di dalam air. SG = berat umbi di udara/(berat umbi di udara) (berat umbi di air) -Dry mater (oven 120 o C. - Potato chip color Kompoisisi biokimia - Komposisi biokimia (asam amino, dll) ditentukan dengan standar dari Association of Analaytical Communities (AOAC) atau American Oil Chemist Society (AOCS). Kandungan glykoalkaloid -Metode Hellenas and branzell (1997) berdasar HPLC untuk: α-chacinine dan α-solanine dalam umbi.

19

20

21

22 Layout uji lapangan seperti pada slide berikut beries mengandung biji S. chacoense (disampling dari jarak 0.2 dan 50 m dari plot transgenik SY233). 40 % dari jumlah biji ditanam secara in vitro untuk diekstraksi DNAnya. DNA campuran dari 100 kecambah diuji PCR untuk deteksi fragmen CPPVY. DNA dari campuran 1 tanaman SY233 dan 100 tanaman nontransgenik digunakan sebagai positif kontrol PCR.

23

24 PCR analysis of transgene flow between SY 233 and S. chacoense. Lanes 1, 2, 3, 4, 5 and 6 correspond to different pools of S. chacoense DNA Lanes 1+, 2+, 3+, 4+, 5+, 6+ are containing SY233 DNA

25