METODOLOGI UMUM. KAJIAN ECP BAKTERI S. agalactiae MELIPUTI

Transkripsi

1 15 METODOLOGI UMUM Alur pelaksanaan penelitian Pelaksanaan penelitian secara skematis disajikan pada Gambar 2, yang merupakan penelitian secara laboratorium untuk menggambarkan permasalahan secara menyeluruh dan jelas. IDENTIFIKASI BAKTERI Streptococcus agalactiae DENGAN MELIHAT KARAKTER KELIMA ISOLAT BAKTERI: Kinetik pertumbuhan, aktivitas hemolitik, uji morfologi, uji fisika dan uji biokimia serta pengujian hidrolisis terhadap gula-gula, sensitivitas terhadap antibiotik, ekspresi fenotip pada berbagai media tumbuh, pengujian derajat hidrofobisitas dan uji hemaglutinasi UJI PATOGENISITAS BAKTERI S. agalactiae Perubahan pola berenang, tingkah laku makan, perubahan patologi anatomi organ dalam dan luar, gambaran darah, patologi klinik darah, histopatologi dan kematian ikan KAJIAN ECP BAKTERI S. agalactiae MELIPUTI ISOLASI ECP Media kultur BHI dan BHIA Lama inkubasi 24, 48, 72 dan 96 jam UJI TOKSISITAS ECP Perubahan pola berenang, tingkah laku makan, perubahan patologi anatomi organ dalam dan luar, gambaran darah, patologi klinik darah, histopatologi dan kematian ikan FRAKSINASI PROTEIN ECP Melalui SDS-PAGE EFIKASI VAKSIN SEL UTUH, ECP DAN GABUNGAN KEDUANYA DARI S. agalactiae TIPE YANG SAMA ATAU TIPE BERBEDA Parameter utama : RPS Parameter pendukung : gambaran darah dan patologi klinik darah Gambar 2 Alur pelaksanaan penelitian Kandidat Vaksin Potensial Streptococcus agalactiae untuk Pencegahan Penyakit Streptococcosis pada Ikan Nila (Oreochromis niloticus)

2 16 Penelitiaan mengenai vaksinasi Streptococcus agalactiae ini dilakukan dalam lima tahap, setiap tahap merupakan rangkaian penelitian yang saling berkaitan dan tidak dapat terpisahkan dari tahapan yang lainnya. Tahap 1 merupakan tahap awal untuk mengidentifikasi isolat-isolat S. agalactiae yang menginfeksi ikan nila dengan melihat karakteristiknya yang meliputi kinetik pertumbuhan, aktivitas hemolitik, uji morfologi, uji fisika dan uji biokimia serta pengujian hidrolisis terhadap gula-gula, sensitivitas terhadap antibiotik, ekspresi fenotip pada berbagai media tumbuh, pengujian derajat hidrofobisitas dan uji hemaglutinasi. Sehingga dari penelitian tahap 1 ini dapat diperoleh informasi mengenai perbedaan dan persamaan karakteristik S. agalactiae yang menginfeksi ikan nila dan kemungkinan ada persamaan dan perbedaan dengan S. agalactiae pada sapi, kucing/ajing dan manusia. Tahap 2 dilakukan untuk mengetahui keterkaitan antara karakteristik S. agalactiae terhadap patogenisitasnya terhadap ikan nila. Parameter yang diamati untuk mengetahui tingkat virulensi dan patogenisitas tersebut antara lain perubahan pola berenang, tingkah laku makan, perubahan patologi anatomi organ dalam dan luar, gambaran darah, patologi klinik darah, histopatologi dan kematian ikan. Dari tahapan ini didapatkan isolat S. agalactiae yang selain virulen juga mampu meningkatan komponen imunitas ikan nila. Dari hasil penelitian ini dipilih dua isolat S. agalactiae yang memiliki perbedaan karakteristik dan memiliki patogenisitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan isolat lainnya, untuk diuji selanjutnya. Tahap 3 merupakan lanjutan tahapan sebelumnya, dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui toksisitas ECP S. agalactiae terhadap ikan nila. Produk ekstrasellular S. agalactiae diduga sebagai salah satu faktor virulensi terhadap inang. Sehingga dalam penelitian ini akan diketahui apakah ECP bersifat toksik terhadap ikan nila, dan karakteristik bakteri yang berbeda juga berpengaruh terhadap toksisitas ECP pada ikan nila. Pada tahapan ini dilakukan beberapa sub tahapan yaitu, pertama melakukan isolasi ECP, S. agalactiae ditumbuhkan pada media padat (BHIA) dan media cair (BHI) dengan lama inkubasi berbeda (24, 48, 72 dan 96 jam).

3 17 Tujuannya adalah untuk mengetahui kemampuan S. agalactiae memproduksi ECP pada berbagai media dan lama inkubasi yang berbeda. Selanjutnya dilakukan pengujian toksisitas ECP terhadap ikan nila. Pengujian ini dilakukan untuk membuktikan adanya kandungan toksin dalam ECP S. agalactiae yang menyebabkan perubahan gejala klinis dan kematian ikan nila. Selain itu, diketahui biakan bakteri pada media dan lama kultur yang menghasilkan ECP yang bersifat toksik terhadap ikan. Sub tahapan terakhir adalah melakukan fraksinasi protein ECP dengan SDS-PAGE, tujuannya adalah untuk mengetahui protein yang terkandung dalam ECP yang menyebabkan perubahan gejala klinis dan kematian pada ikan, yang nantinya akan dimanfaatkan sebagai vaksin. Dari tahapan ini akan diperoleh ECP yang memiliki protein dengan berat molekul tertentu yang bersifat imunogenik. Tahap terakhir adalah melakukan pengujian efikasi vaksin yang dibuat. Penelitian ini bertujuan mengetahui efikasi vaksin sel utuh, ECP dan gabungan keduanya baik yang berasal dari S. agalactiae tipe yang sama maupun tipe yang berbeda untuk penanggulangan penyakit Streptococcosis yang disebabkan oleh S. agalactiae. Diharapkan dari penelitian ini dapat dihasilkan kandidat vaksin yang memberikan proteksi terbaik bagi ikan nila dalam mengatasi infeksi S. agalactiae. Tempat dan waktu penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Sempur, Bogor Jawa Barat dan Laboratorium Kesehatan Ikan Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor. Untuk fraksinasi protein ECP dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, PAU Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dimulai pada bulan November 2009 sampai dengan bulan Agustus Ikan uji Ikan uji yang digunakan adalah ikan nila (Oreochromis niloticus) berukuran 15 g, jumlah ikan uji yang digunakan dalam setiap percobaan disesuaikan dengan kebutuhan perlakuan. Ikan berasal dari satu sumber dan diadaptasi dalam akuarium uji selama 14 hari sebelum digunakan. Ikan uji yang

4 digunakan adalah ikan yang selama masa karantina (14 hari) tidak ditemukan adanya gejala penyakit Streptococcosis dan pada saat diisolasi dari organ (mata, otak dan ginjal) ikan pada media Brain Heart Infusion Agar (BHIA, DIFCO) tidak ditemukan S. agalactiae. Bakteri Streptococcus agalactiae Sebanyak lima isolat S. agalactiae digunakan untuk pengujian karakteristik dan patogenisitas yang sebelumnya sudah diidentifikasi dengan PCR (Lusiastuti at al., 2009). Kelima isolat tersebut di jabarkan pada Tabel 3 berikut. Tabel 3 Isolat S. agalactiae yang digunakan dalam penelitian Isolat Kode Sumber 1 N 3 M Organ mata ikan nila dari daerah Cirata 2 N 4 M Organ mata ikan nila dari daerah Cirata 3 N 14 G Organ Ginjal ikan nila dari daerah Cirata 4 N 17 O Organ otak ikan nila dari daerah Cirata 5 NK1 Organ otak ikan nila dari daerah Klaten Sampel isolat bakteri diambil dari ikan yang menunjukkan gejala klinis seperti mata menonjol, mata mengkerut, berenang berputar dan tidak beraturan (whirling), operkulum menjadi jernih (clear operculum) dan warna tubuh gelap. Sebelum bakteri stok digunakan untuk penelitian, dilakukan postulat Koch sebanyak dua kali untuk menjaga virulensi dari masing-masing isolat. Urutan kerja adalah sebagai berikut: stok bakteri yang disimpan dalam BHIA miring dilakukan pasase ke dalam BHIA untuk melihat ada tidaknya kontaminan setelah itu ditumbuhkan di media BHI 10 ml selama jam. Masing-masing bakteri diinjeksikan pada 10 ekor ikan (setiap perlakuan) sebanyak 0.1 ml/ekor. Ikan dipelihara selama 5-7 hari, dan diamati gejala klinis dan kematian yang muncul. Ikan yang menunjukkan gejala klinis S. agalactiae diambil dan diisolasi organ otak, mata, ginjal dalam BHIA untuk mengetahui penyebab kematian atau perubahan gejala klinis, juga untuk memperoleh isolat S. agalactiae kembali. Bakteri hasil postulat Koch ini kemudian dilakukan pengujian karakteristik untuk meyakinkan bahwa bakteri yang digunakan merupakan S. agalactiae. Pengujian karakteristik meliputi uji morfologi, uji fisika dan uji biokimia serta pengujian hidrolisis terhadap gula-gula (SNI : 2009; Sheehan et al., 2009). Bakteri 18

5 19 hasil postulat Koch dan uji karakteristik inilah yang digunakan sebagai bakteri pada pengujian selanjutnya. Parameter yang diukur Parameter yang diukur dalam setiap tahapan berbeda, sesuai dengan tujuan yang akan dicapai. Parameter yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: 1. Perubahan pola berenang yang diamati berupa: perubahan gerakan pada kolom air (berenang di permukaan, melayang atau di dasar akuarium), perpindahan badan (lemah atau agresif), bentuk cara berenang (berulang, berputar dan tidak beraturan) dan gerakan operculum. Pengamatan dilakukan selama 5 menit. 2. Tingkah laku makan diamati dengan mengamati respon ikan terhadap pakan yang diberikan. Data yang dikumpulkan termasuk jumlah pakan yang dimakan, jumlah pakan yang tidak dimakan, waktu menangani setiap pakan (waktu dari pakan pertama dimakan hingga dia mencari atau memakan pakan lainnya kembali). 3. Perubahan anatomi organ luar dan organ dalam. Perubahan yang diamati pada anatomi luar berupa kondisi mata, warna tubuh, pendarahan atau kelainan lainnya, sedangkan perubahan anatomi dalam berupa perubahan warna, bentuk dan konsistensi organ otak dan ginjal ikan. 4. Pengamatan Mean Time to Death (MTD) dilakukan untuk mengetahui rerata waktu kematian ikan uji yang terinfeksi S. agalactiae dihitung menurut Kamiso (2001) dalam Murdjani (2002) dengan rumus : Keterangan; MTD : Mean Time to Death (rerata waktu kematian) a : waktu kematian (jam) b : jumlah ikan mati setiap waktu pengamatan 5. Pengamatan gambaran darah diawali dengan pengambilan darah ikan dengan jarum suntik dari vena caudalis. Pengukuran parameter gambaran darah antara lain diferensial leukosit, total leukosit serta total eritrosit dilakukan

6 20 mengikuti prosedur Blaxhall dan Daisley (1973). Secara terperinci prosedur pengamatan gambaran darah dijelaskan dalam Lampiran Pengukuran indeks fagositik dilakukan dengan metode Anderson dan Siwicki (1995). Secara terperinci prosedur pengukuran dijelaskan dalam Lampiran Pengukuran titer antibodi dengan uji mikrotiter aglutinasi. Secara terperinci prosedur pengukuran dijelaskan dalam Lampiran Pengukuran patologi klinik darah : kadar hemoglobin diukur menurut metode Sahli dengan Sahlinometer (Wedemeyer dan Yasutake, 1977), kadar hematokrit diukur menurut metode Anderson dan Siwicki (1995); kadar glukosa darah juga diamati dalam setiap perlakuan, mengikuti metoda Wedemeyer dan Yasutake (1977). Secara terperinci prosedur pengukuran patologi klinik darah dijelaskan dalam Lampiran Pengamatan histopatologi ikan dilakukan untuk mengetahui kerusakan jaringan ikan yang terinfeksi S. agalactiae yaitu jaringan pada organ mata, otak dan ginjal ikan. 10. Tingkat kelangsungan hidup relatif (Relative Percent Survival/RPS) selama penelitian dihitung dengan menggunakan rumus Ellis (1988): Analisa data Percobaan ini dilakukan dengan menggunakan RAL (rancangan acak lengkap). Analisa untuk data pengamatan gambaran darah, patologi klinik darah, indeks fagositik dan titer antibodi di analisis dengan program Statistica 8; sedangkan perubahan pola berenang, tingkah laku makan dan perubahan anatomi organ luar dan organ dalam secara makroskopis, pengamatan histopatologi dan RPS dianalisa secara deskriptif.