III BAHAN DAN METODE PENELITIAN

Transkripsi

1 III BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Terpadu Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner (IPHK) Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (FKH IPB) dan di Balai Besar Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan (BBPMSOH) Gunungsindur Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2008 sampai Agustus Bahan dan Alat Hewan Percobaan Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah marmut (Cavia porcellus) dengan berat badan gr untuk produksi antibodi poliklonal AI H5N1 (Ab 1 ); kelinci New Zealand White dengan berat badan berat 2.5 kg untuk preparasi antibodi terhadap Ab 1 atau antibodi anti-idiotipe (Ab 2 ); ayam petelur strain White Leghorn Specific Pathogen Free (SPF) umur 4 minggu untuk produksi antibodi terhadap Ab 2 (Ab 3 ) atau uji imunogenesitas kandidat vaksin AI (antibodi anti-idiotipe). Marmut, kelinci dan ayam diberikan pakan berbentuk pelet sesuai dengan standar pakan hewan laboratorium BBPMSOH Bahan dan Media Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah vaksin Avian Influenza (AI) H5N1 inaktif strain Legok, PCR kit AI (Super Script TM III One-Step RT-PCR System with Platinum R Taq DNA Polymerase-Invitrogen), TRIZOL R LS Reagent (Invitrogen), Ethanol (Merck), Chloroform (Merck), Isoprophil Alcohol (Merck), Diethilpyrocarbonate (DEPC) (Invitrogen), Primer H5 (Invitrogen) dan N1 (Eurogentec), Tris Boric Edta (TBE) (Invitrogen), Agarose (Invitrogen), Ethium Bromide (Sigma), BlueJuice Gel Loading (Invitrogen), antigen AI H5N1 strain Legok 2003 (BBalitvet), sel darah merah ayam SPF, Larutan Alsever, Natrium azide (Merck), Phosphate Buffer Saline (PBS) (Gibco), Montage Antibody Purification Kit & Spin Column with Procep A

2 (Millipore-Montage), Polyethilenglycol 6000 (Merck), Bovine Serum Albumin (Sigma), Sodium Dodecyl Sulfate (Invitrogen), Acrylamide (Invitrogen), Tris HCl (Sigma), NNmethhylene bis acrilamide (Invitrogen), Amonium persulfat (Sigma), Tetra Methyl Etilen Diamin (TEMED)(Invitrogen), Methanol (Sigma), Marker protein (Invitrogen, Promega), Mercaptoethanol (Sigma), Tris Base (Sigma), Natrium Sitrat (Merck), Amonium Sulfat (Sigma), Enzim pepsin (Sigma), Diethylaminoethyl (DEAE), Cellulose, Asam acetat glacial (Sigma), Comassie blue (Sigma), Imunoglobulin G kontrol (Promega), Freund s Complete Adjuvant (FCA) dan Freund s Incomplite Adjuvant (FIA)(Sigma), alkohol 70%, aquabidest, formaldehyde, Minimum Eagle Media (Gibco), Fetal Bovine Serum (Gibco), Penicillin Streptomycin (Gibco), Triptose Phosphate Broth (TPB)(BD), L- Glutamin (Gibco), NaHCO 3 (Merck) dan Thioglycollate (TGC) (Difco). Bahan lain adalah TAB SPF, biakan jaringan MDCK, isolat AI H5N1 strain Legok (2003), isolat AI IPB (2005), isolat AI H5N1 IPB (2007), isolat AI H5N1 IPB (2008), isolat AI H5N1 IPB (2009), dan isolat A/Goose/Bojonggenteng/IPB2-RS/2006 (Susanti 2008) Peralatan Peralatan yang digunakan adalah kandang marmut, kelinci dan ayam dan perlengkapan makan dan minum. Peralatan lain adalah alat suntik (1 ml, 3 ml, 5 ml dan 10 ml), filter (0.45 µm dan 0.22 µm), tabung sentrifus, mikropipet (single dan multichannel), tips, tabung ependorf (microtube), beker glass, rak tabung, gelas objek, microwave, microplate 96 lubang dengan dasar V (Nunc), microplate 96 lubang steril dengan dasar datar (Nunc), botol biakan jaringan (Nunc), botol duran, magnetic sitrer, stirer, vortex mixer, pipet Mohr (1ml, 2 ml, 5 ml dan 10 ml), perlengkapan uji agar gel presipitasi (Agar Gel Precipitation/AGP), ph meter, mesin sentrifus, mesin thermocycle, gel elektrophoresis, transluminator, spektrofotometer, inkubator telur, inkubator biakan jaringan, timbangan, penangas air, peralatan untuk Sodium Deodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), conector, pelubang telur, thoma cythometerl, inverted microscope, dan laminar air flow (Biosafety Level II).

3 3.3 Metode Reidentifikasi Vaksin AI H5N1 Vaksin AI H5N1 inaktif strain Legok diekstraksi dengan menggunakan pelarut lemak (kloroform atau eter, disentrifugasi kemudian endapannya diambil untuk uji Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) (Ditjennak 2007). Isolasi RNA dilakukan dengan menggunakan metoda TRIZOL R LS Reagent (Invitrogen) sebagai berikut : sebanyak 250 μl vaksin dan 750 μl Trizol dimasukkan kedalam tabung eppendorf 1.8 ml, kemudian dihomogenkan memakai vortex mixer. Larutan diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar (25 30 o C), kemudian ditambahkan 500 μl chloroform. Tabung tersebut dihomogenkan selama 15 detik dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit, kemudian disentrifus dengan kecepatan g pada suhu 2 8 o C selama 15 menit. Sebanyak 500 μl fase cair pada supernatan (putih bening) diambil dan dimasukkan kedalam tabung baru. Fase cair tersebut ditambahkan 500 μl isoprophil alcohol dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Larutan selanjutnya disentrifus dengan kecepatan g pada suhu 2 8 o C selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang. Hasilnya adalah endapan RNA. Ke dalam endapan tersebut ditambahkan 1000 μl ethanol 75% dan disentrifus dengan kecepatan g selama 5 menit. Endapan RNA dikeringkan selama 7 menit di dalam laminar air flow, selanjutnya dilarutkan dengan 10 μl air suling bebas Rnase atau DEPC. Tahap akhir adalah larutan RNA diinkubasikan dalam penangas air 60 o C selama 10 menit. Larutan RNA di simpan pada suhu 20 o C sampai dilakukan RT-PCR. Reverse transcription adalah pembuatan cdna yang bersifat komplementer dengan RNA virus, menggunakan enzim reverse transcriptase. Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) dilakukan dengan metoda Super Script TM III One- Step RT-PCR System with Platinum R Taq DNA Polymerase (Invitrogen). Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen H5 adalah menurut Lee dan Suarez (2004) dan primer N1 (Tabel 4). Reaksi PCR (PCR mix) dibuat sebanyak 50 µl dengan komposisi sebagai berikut : 25 μl 2x reaction PCR mix, 2 μl Platinum Taq, 5 μl RNA template, 1 μl Primer forward (10 µm), 1 μl Primer reverse (10 µm) dan 16 μl ddh 2 O (ultrapure H 2 O). Campuran tersebut dihomogenkan dengan vortex mixer, kemudian dimasukkan ke dalam mesin thermocycle yang telah diprogram. Program RT-PCR adalah menurut Lee et al.

4 2001: cdna synthesis 60 o C selama 30 menit, predenaturasi 95 o C selama 2 menit, selanjutnya 35 siklus terdiri dari denaturasi 95 o C selama 40 detik, penempelan 50 o 55 o C selama 40 detik, ekstensi 72 o C selama 1 menit dan post ekstensi 72 o C selama 4 menit. Pita DNA spesifik hasil PCR diidentifikasi dengan elektroforesis pada gel agarose 2 %. Tabel 4 Primer Untuk mengamplifikasi Virus AI H5N1 Primer Sekuen basa Produk (pb) 1 H5N1-H5-forward: 5 AAA CAG AGA GGA AAT AAG TTG AAAA ATT 3 55 H5N1-H5-reverse: 5 AAA GAT AGA CCA GCT ACC ATG ATT GC 3 2 H5N1-N1-forward GD: 5'- TTG CTT GGT C(A/G)G CAA GTG C 120 H5N1-N1-reverse Yong: 5'- TGA T(A/G)G TGT CTG TTA TTA TGC C pb: pasangan basa Elektroforesis produk amplifikasi PCR (DNA) dilakukan menggunakan ultrapure agarose (Invitrogen) 2%. Sebanyak 2 gram agarose dilarutkan dalam 100 ml TBE buffer, kemudian dipanaskan dalam microwave sampai larutan menjadi jernih. Ethium bromide ditambahkan ke dalam gel hangat selanjutnya gel dituangkan ke dalam dish mupid (sebanyak 50 ml kedalam dish yang besar) dan dibiarkan pada suhu kamar selama 15 menit. Sambil menunggu, sebanyak 250 ml TBE buffer dituangkan ke dalam mupid electrophoresis. Gel yang beku diletakkan di dalam mupid elektroforesis dengan aliran listrik negatif mengalir ke positif. Sebanyak 2 μl loading dye (BlueJuice Gel Loading-Invitrogen) dan 8 μl produk amplifikasi PCR dicampur dan dimasukkan ke dalam lubang gel. Voltase yang digunakan sebesar 50 Volt selama 45 menit. Pita atau fragmen DNA yang teramplifikasi dilihat dibawah sinar ultaviolet Produksi Antibodi Poliklonal Avian Influenza H5N1 (Ab 1 ) Produksi antibodi poliklonal AI H5N1 dilakukan pada 10 ekor marmut dengan berat badan gram. Darah preimunisasi diambil untuk mengetahui titer antibodi terhadap virus AI H5N1. Imunisasi dilakukan dengan menyuntik satu dosis vaksin AI

5 H5N1 inaktif strain Legok (0,5 ml) secara subkutan. Penyuntikan diulang sebanyak 3 kali dengan interval 3 minggu. Keberadaan antibodi dideteksi dengan uji hambatan hemaglutinasi (Hemaglutination Inhibition/HI) (WHO 2002, OIE 2005) dan uji agar gel presipitasi (Agar Gel Precipitationt/AGP). Serum dikoleksi setelah titer antibodi tinggi dalam darah yaitu seminggu setelah imunisasi ke Reidentifikasi Serum Anti AI H5N1 (Ab 1 ) Reidentifikasi serum marmut dilakukan dengan uji HI dan uji AGP (OIE 2005). Serum marmut diinaktifasi terlebih dahulu dalam penangas air 56 o C selama 30 menit dan diabsorbsi dengan sel darah merah ayam pada suhu ruang selama 30 menit, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 1000 g selama 5 menit dan diambil supernatannya untuk selanjutnya di uji HI. Uji hambatan hemaglutinasi adalah sebagai berikut: pada semua lubang microplate 96 lubang dimasukkan pengencer PBS dan pada lubang pertama dimasukkan 25 µl serum. Pengenceran secara seri kelipatan dua sampai dengan lubang 11, selanjutnya ditambahkan sebanyak 25 µl antigen AI H5N1 4 HAU/25 µl. Campuran tersebut diinkubasikan pada suhu kamar selama 30 menit, kemudian ditambahkan sel darah merah ayam SPF 1% sebanyak 25 µl pada semua lubang dan selanjutnya diinkubasikan pada suhu kamar selama 40 menit. Titer antibodi ditentukan dari pengenceran tertinggi serum yang mampu menghambat aglutinasi sel darah merah. Uji agar gel presipitasi adalah sebagai berikut: agar gel dibuat dengan melarutkan 0.4 g agarose dan 1.2 g Poly Ethylene Glycol (PEG) 6000, 0.1% Na azide dalam 25 ml PBS ph 7.4 dan 25 ml akuades ph 7.4. Larutan ini dipanaskan dalam microwave sampai larut dan warna larutan menjadi bening. Larutan sebanyak 3.75 ml dituangkan pada gelas obyek dan ditunggu sampai mengeras, kemudian dibuat sumur-sumur dengan puncher. Antigen sebanyak 20 µl dimasukkan ke dalam sumur tengah dan antibodi sebanyak 20 µl dimasukkan ke dalam sumur disekelilingnya Pemurnian Imunoglobulin G Anti AI H5N1 (Ab 1 ) Pemurnian Imunoglobulin G (IgG) AI H5N1 dari serum marmut (Ab 1 ) dilakukan dengan menggunakan Montage Antibody purification kit & spin column with Prosep A

6 media (Millipore). Prosep A dilepaskan dari tutup atas dan bawahnya kemudian dimasukkan kedalam spin colomn. Spin column dicuci dengan 10 ml binding buffer, kemudian disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 15 menit. Serum marmut di saring dengan menggunakan steriflip GP filter 0,22 µm, selanjutnya sampel serum dilarutkan dengan binding buffer dengan perbandingan 1:1 v/v, lalu dimasukkan kedalam spin column dan disentrifus pada kecepatan 150 g selama 20 menit. Spin colomn dicuci kembali dengan 10 ml binding buffer dan disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 5 menit, pencucian dilakukan sebanyak dua kali. Imunoglobulin G di elusi dengan 10 ml buffer dan elusi dilakukan langsung kedalam tabung sentrifus yang berisi 1,3 ml buffer netral, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 5 menit. Larutan yang ada dibawah ditampung dan merupakan IgG. Imunoglobulin G di desalting dengan menggunakan Amicon Ultra 15 dan disentrifus dengan kecepatan 4500 g selama 30 menit. Larutan yang ada diatas ditampung dan merupakan IgG poliklonal. Reidentifikasi IgG AI H5N1 dilakukan dengan uji AGP dan untuk mengetahui berat molekul IgG dilakukan SDS-PAGE (Hames & Rickwood 1987) dengan menggunakan sistem diskontinyu. Sistem ini terdiri atas gel pemisah dengan konsentrasi 12 % dan gel pengumpul dengan konsentrasi 4 %. Gel diwarnai dengan commassie blue dan estimasi berat molekul protein berdasarkan perbandingan dengan marker umum berat molekul, selanjutnya konsentrasi IgG dihitung dengan menggunakan spektrofotometer ultra violet Pemotongan Imunoglobulin G AI H5N1 dan Pemurnian Fragmen F(ab) 2 Pemotongan Imunoglobulin G (IgG) dari serum marmut ditujukan untuk memperoleh fragmen F(ab) 2 dari imunoglobulin. Fragmen F(ab) 2, selanjutnya disebut Ab 1, akan digunakan untuk merangsang terbentuknya antibodi spesifik terhadap epitop Ab 1 pada kelinci. Antibodi yang akan terbentuk oleh Ab 1 ini merupakan antibodi antiidiotipe (Ab 2 ). Pemotongan dilakukan dengan menggunakan enzim pepsin, sehingga akan diperoleh 1 fragmen F(ab) 2 divalen yang mengandung 2 Fab dan 1 fragmen Fc. Imunoglobulin G dibuat menjadi 5 mg/ml dalam Na sitrat 100 mm ph 3.5. Pemotongan IgG dilakukan dengan menggunakan 5 µg pepsin untuk 1 mg IgG, kemudian diinkubasi dalam penangas air pada suhu 37 0 C selama 24 jam, setelah 24 jam reaksi pemotongan dihentikan dengan Tris buffer 3 M ph 8,8 sebanyak 10%, lalu disentrifus

7 dengan kecepatan g selama 30 menit. Larutan ini kemudian di desalting dengan Amicon Ultra 15 dengan kecepatan 4500 g selama 20 menit. Larutan ini kemudian di dialisis dalam PBS ph 8.0 selama 24 jam untuk menghilangkan garam yang terdapat pada larutan protein. Proses dialisis ini akan menyebabkan molekul-molekul garam keluar melalui pori-pori tabung secara bertahap hingga konsentrasi garam di dalam dan di luar tabung dialisis menjadi sama. Hasil dialisis inilah yang akan digunakan sebagai Ab 1 untuk mengimunisasi kelinci. Reidentifikasi dilakukan dengan metode SDS-PAGE. Fragmen F(ab) 2 memiliki berat molekul 110 kda, selanjutnya konsentrasi ditentukan dengan menggunakan spektrofotometer ultra violet Produksi Antibodi Anti-Idiotipe (Ab 2 ) Pada Kelinci Antibodi anti-idiotipe (Ab 2 ) disiapkan dengan cara menyuntik kelinci dengan Ab 1 (F(ab) 2 ). Produksi Ig G menggunakan 3 ekor kelinci New Zealand White berat 2.5 kg. Dua ekor kelinci diimunisasi dengan 500 µg Ab 1 H5N1 dalam Freund s Complete Adjuvant (FCA) secara subcutan dan satu ekor kelinci sebagai kontrol. Imunisasi ulangan dilakukan satu minggu berikutnya dengan menyuntikkan 500 µg Ab 1 dalam Freund s Incomplete Adjuvant (FIA) secara subcutan. Satu minggu kemudian serum dikoleksi dan identifikasi keberadaan Ab 2 H5N1 strain Legok dengan uji AGP. Berat molekul ditentukan dengan metode SDS-PAGE dan konsentrasinya dihitung dengan spektofotometer ultra violet Pemurnian Imunoglobulin G Kelinci Anti-Idiotipe (Ab 2 ) Pemurnian Imunoglobulin G (IgG) AI H5N1 dari serum kelinci (Ab 2 ) dilakukan dengan menggunakan Montage Antibody purification kit & spin column with Prosep A media (Millipore). Prosep A dilepaskan dari tutup atas dan bawahnya kemudian dimasukkan kedalam spin column. Spin column dicuci dengan 10 ml binding buffer, kemudian disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 15 menit. Serum marmut di saring dengan menggunakan steriflip GP filter 0,22 µm, selanjutnya sampel serum dilarutkan

8 dengan binding buffer dengan perbandingan 1:1 v/v, lalu dimasukkan kedalam spin column dan disentrifus pada kecepatan 150 g selama 20 menit. Spin column dicuci kembali dengan 10 ml binding buffer dan disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 5 menit, pencucian dilakukan sebanyak dua kali. Imunoglobulin G di elusi dengan 10 ml buffer dan elusi dilakukan langsung kedalam tabung sentrifus yang berisi 1.3 ml buffer netral, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 5 menit. Larutan yang ada dibawah ditampung dan merupakan IgG. Imunoglobulin G di desalting dengan menggunakan Amicon Ultra 15 dan disentrifus dengan kecepatan 4500 g selama 30 menit. Larutan yang ada diatas ditampung dan merupakan IgG. Reidentifikasi IgG kelinci dilakukan dengan uji AGP dan untuk mengetahui berat molekul IgG dilakukan SDS-PAGE (Hames & Rickwood 1987) dengan menggunakan sistem diskontinyu. Sistem ini terdiri atas gel pemisah dengan konsentrasi 12 % dan gel pengumpul dengan konsentrasi 4 %. Gel diwarnai dengan commassie blue dan estimasi berat molekul protein berdasarkan perbandingan dengan marker umum berat molekul, selanjutnya konsentrasi IgG dihitung dengan menggunakan spektrofotometer ultra violet Imunogenesitas Kandidat Vaksin (Antibodi Anti-idiotipe) Imunisasi Antibodi Anti-idiotipe (Ab 2 ) pada ayam dilakukan untuk mendeteksi terbentuknya antibodi terhadap Ab 2. Antibodi yang diperoleh dari serum ayam merupakan antibodi anti anti-idiotipe (Ab 3 ). Antibodi ini diharapkan mempunyai karakteristik serologi sama dengan antibodi dari serum marmut (Ab 1 ), sehingga mampu bereaksi homolog dengan Ab 2 maupun dengan antigen virus AI. Imunisasi dilakukan sebagai berikut: sebanyak 20 ekor ayam 5 ekor menjadi 4 kelompok, yaitu kelompok I sebagai kontrol; kelompok II sebagai kelompok Ig G kelinci kontrol, kelompok III sebagai kelompok kandidat vaksin (antibodi antiidiotipe) dan kelompok IV sebagai kelompok vaksin AI H5N1. Kelompok kontrol adalah kelompok ayam yang tidak diberi perlakuan. Kelompok Ig G kelinci kontrol adalah kelompok ayam yang diimunisasi dengan 500 µg Ig G kelinci kontrol dalam FCA secara intramuscular. Kelompok antibodi anti-idiotipe adalah kelompok ayam yang diimunisasi dengan 500 µg Ab 2 dalam FCA secara intramuscular. Kelompok vaksin AI H5N1 adalah kelompok ayam yang diimunisasi dengan 1 dosis vaksin komersil AI H5N1

9 inaktif strain Legok secara intramuscular. Serum darah dikoleksi sebelum imunisasi (preimunisasi) dan tiap minggu post imunisasi selama 1 bulan. Pengukuran titer antibodi dari imunisasi antibodi anti-idiotipe (Ab 2 ) menggunakan uji HI dan uji serum netralisasi (SN) (Ditjennak 2007; WHO 2002) Uji Serologi Antibodi Anti Anti-idiotipe (Ab 3 ) dengan Uji HI Persiapan untuk melakukan uji serologi antibodi anti anti-idiotipe (Ab 3 ) dengan uji HI adalah dengan memproduksi antigen AI (Lampiran 15) dari beberapa isolat, yaitu isolat AI H5N1 IPB (2007), isolat AI H5N1 IPB (2008), dan isolat AI H5N1 IPB (2009), sedangkan antigen AI H5N1 strain Legok (2003) diperoleh dari Balitvet. Uji serologi antibodi anti anti-idiotipe (Ab 3 ) dengan uji HI sebagai berikut: sebanyak 25 µl PBS dimasukkan ke dalam setiap lubang pada microplate 96 lubang, kemudian ditambahkan 25 µl serum pada lubang yang pertama. Serum diencerkan dengan kelipatan 2 sampai lubang ke 11, kemudian ditambahkan dengan 25 µl antigen (4 HAU) pada semua lubang. Microplate diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit, selanjutnya ditambahkan 25 µl sel darah merah ayam SPF 1% pada semua lubang. Larutan tersebut diinkubasikan selama 40 menit pada suhu kamar. Titer antibodi ditentukan dari pengenceran tertinggi serum yang mampu menghambat aglutinasi sel darah merah Uji Serologi Antibodi Anti Anti-idiotipe (Ab 3 ) dengan Uji SN Persiapan untuk melakukan uji serologi anti anti-idiotipe (Ab 3 ) dengan uji SN adalah dengan mempropagasi dan mengukur kandungan virus dari isolat AI H5N1 strain Legok (2003), isolat AI H5N1 IPB (2005) dan isolat A/Goose/Bojonggenteng/IPB2- RS/2006 pada TAB dan sel MDCK (Lampiran 14) Uji serum netralisasi dilakukan dengan menggunakan biakan sel MDCK. Sebanyak 25 µl medium dimasukkan ke dalam setiap lubang microplate (96 well), kemudian 25 µl serum pada lubang yang pertama. Serum diencerkan dengan kelipatan 2 sampai lubang ke 11, kemudian ditambahkan dengan 25 µl virus AI (100 TCID 50 ) pada semua lubang. Microplate diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 0 C dengan 5% CO 2 selama satu jam, selanjutnya ditambahkan dengan 100 µl sel MDCK (10 6 sel/ml) pada

10 semua lubang. Biakan sel diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 0 C dengan 5% CO 2. Pengamatan dilakukan setiap hari selama 7 hari. Titer antibodi ditentukan dari pengenceran tertinggi serum yang mampu menetralisasi efek sitopatik Analisis Data Karakteristik uji dari antibodi anti-idiotipe dianalisis secara deskriptif yaitu berdasarkan gambaran hasil yang diperoleh dan secara statistik dengan menggunakan metode Mann Whitney dengan soft ware SPSS-16 dengan tingkat kepercayaan (Pvalue) Mann Whitney adalah metode statistik yang digunakan untuk membedakan dua parameter dengan data non parametrik. Salah satu indikasi untuk mengetahui suatu data parametrik atau tidak adalah dengan melihat sebaran data (distribusi normal berarti parametrik) (Field 2005).