BIOTEKNOLOGI PERTANIAN TEORI DASAR BIOTEKNOLOGI

Transkripsi

1 BIOTEKNOLOGI PERTANIAN TEORI DASAR BIOTEKNOLOGI

2 The Central Dogma of Molecular biology

3 Replikasi DNA: adalah proses penggandaan pita DNA dengan menggunakan DNA tetua sebagai cetakan; Proses ini berlangsung di dalam membran inti pada sel eukaryot.

4 Konservatif: dua pita spiral DNA tetap utuh dan tidak memisahkan diri, dan keseluruhan pita menjadi cetakan langsung untuk membentuk pita baru. Dispersif: dua pita spiral DNA terputus-putus, dan pita baru terbentuk saling bersambungan membentuk pita baru yang utuh.

5 Metode yg dianggap benar: Semi konservatif: dua pita spiral DNA memisahkan diri, dan masing-masing pita menjadi cetakan untuk membentuk pita baru. Menurut eksperimen Meselson dan Stahl (1958) (baca: Genetika, Suryo, hal 74-76) dengan menggunakan bakteri E. coli yang ditumbuhkan dalam media yang mengandung 15N dan 14N, metode inilah yang paling mungkin terjadi.

6 Proses replikasi DNA semi konservativ: Diawali dengan ikatan hidrogen dari untaian spiral ganda dipotong oleh enzim endonuklease, sehingga terdapat bagian pita spiral ganda DNA yang terpisah jadi dua pita. Masing-masing pita ini berfungsi sebagai cetakan untuk membuat pita turunannya. Enzim DNA polimerase diaktifkan dan berfungsi menjadi katalisator untuk menarik basa-basa di sekitar pita DNA. Enzim ini membuat pita DNA baru dengan cara memasang basa-basa sesuai dengan pita DNA cetakannya arah 3 ke 5 hingga terbentuk pita baru dengan arah 5 ke 3 (leading strand) Untuk pita DNA cetakan arah 5 ke 3 juga dibuat pita turunannnya dengan proses yang terputus-putus (lagging strand), kemudian bagian pendek pita turunan DNA yang terputus-putus itu digabungkan oleh enzim ligase.

7 Transkripsi: adalah proses sintesis RNA dengan menggunakan DNA sebagai cetakan. Melibatkan enzim RNA polimerase.

8 Perangkat transkripsi: 1. satu utas DNA ekson sebagai cetakan, sedangkan utas DNA pasangannya hanya menjadi utas pendamping. Urutan basa pada RNA akan merupakan antipararel (pasangan) dari urutan basa DNA cetakannya. 2. enzim RNA polimerase (enzim transkriptase). Pada E. coli (prokaryot) enzim ini terdiri dari beberapa subunit protein yaitu subunit holoenzim dan sub unit pendukung yang masing-masing tdd beberapa subunit dengan fungsi berbeda-beda (Tabel 1). Pada eukaryot dikenal empat polimerase yaitu tiga RNA polimerase inti (I, II, dan III) dan satu RNA polimerase organel yang bertanggung jawab terhadap tranksripsi DNA mitokondria dan kloroplas. 3. Nukleotida/ Basa nitrogen A, U, C, G

9 Sebelum membahas proses transkripsi sebaiknya dikenali: Promotor: Titik awal transkripsi, Kotak 35, Kotak 10, Terminator Promotor: merupakan sekuen basa/nukleotida dimana faktor sigma mengenalinya sebagai awal proses transkripsi. Pada E. coli promotor tdd 40 bp (base pair = pasang basa) dengan tiga titik penting yaitu: kotak 35, kotak 10, dan titik awal transkripsi.

10 Titik awal transkripsi: Merupakan basa pertama dari utas DNA yang ditranskripsikan ke dalam basa RNA. Mulai dari titik ini ke arah hilir (ke arah ujung 3 / ujung NH2 /ujung amino) diberi koordinat positif Sebaliknya kearah hulu (ke arah ujung 5 / ujung P /ujung fosfat) diberi koordinat negatif.

11 Kotak 35: Sekuen nukleotida dg titik tengah kotak berada pada basa yang berjarak 35 basa ke arah hulu dari titik awal transkripsi. Memiliki fungsi sebagai isyarat penempelan untuk RNA polimerase pada DNA. Memiliki rangkaian konsensus (mirip untuk seluruh organisme) 5 TGTTGAACA3.

12 Kotak 10 /kotak Pribnow / tata box: Urutan nukleotida dg titik tengah kotak pada basa yang berjarak 10 basa ke arah hulu dari titik awal transkripsi. Tempat awal RNA polimerase menguraikan pilinan heliks ganda DNA. Kotak ini mempunyai rangkaian konsensus 5 TATAAT3. Tersusun dari rangkaian poliat yang merupakan pasangan basa dengan ikatan hidrogen paling lemah, sehingga paling mudah dipisahkan. Pada umumnya antara kotak 35 dengan kotak 10 dipisahkan oleh 16 sampai 18 pasang basa.

13 Terminator: Rangkaian nukleotida DNA yang memberikan isyarat bagi transkriptase untuk mengakhiri proses transkripsi. Biasanya terdapat sekuen ulang balik yang dipisahkan oleh sejumlah nukleotida DNA yang akan mengakibatkan terbentuknya struktur jepit rambut pada RNA-nya

14 Proses transkripsi: Terdiri dari tiga tahapan: (a) Inisiasi, (b) sintesis perpanjangan RNA, (c) akhir transkripsi. (a) Inisiasi transkripsi: Proses ini menentukan apakah suatu gen akan diekspresikan atau tidak, juga menentukan benar/tidaknya hasil transkripsi. Proses diawali dengan pengenalan promotor oleh faktor sigma, dilanjutkan dengan penempelan enzim inti pada promotor, dan pengudaran pilinan heliks ganda untuk memulai sintesis RNA.

15 (b) Sintesis Perpanjangan RNA: Faktor sigma tidak diperlukan lagi dan akan terlepas dari holoenzim dan protein nusa menggantikannya bergabung dengan inti transkriptase. Protein nusa berperan dalam perpanjangan RNA dan mengenali terminator. Dalam tahapan ini enzim RNA polimerase inti melakukan tiga jenis pekerjaan yaitu: membuka pilinan heliks DNA, sintesis RNA/penambahan ribonukleotida, dan memulihkan kembali pilinan heliks DNA.

16 Terminator dan proses akhir transkripsi: Terdapat dua jenis terminator untuk mengakhiri proses transkripsi: terminator yang memerlukan faktor rho terminator tanpa faktor rho.

17 Terminator yang memerlukan faktor rho Mengandung ruas ulang balik dari DNA saja dan tidak mengandung ruas poliat sebagai penutupnya. Jadi pada akhir transkripsi tidak akan ada pasangan poli AU pada situs hibrid DNA-RNA. Setelah menemui struktur jepit rambut transkriptase akan mengakhiri transkripsi, tetapi DNA, RNA, dan enzim belum dapat terpisah. Diperlukan jasa faktor rho yaitu protein yang merupakan subunit transkriptase yang berperan memisahkan DNA, RNA, dan enzim transkriptase.

18 Terminator tanpa faktor rho Disamping adanya ruas ulang balik dari DNA juga terdapat rangkaian poli AT pada DNA yang letaknya tepat sesudah sekuen ulang balik terakhir. Jadi sesudah proses transkripsi diberi sinyal berhenti dengan adanya struktur jepit rambut RNA yang terbentuk, kemudian terbentuk untaian poli AU dari RNA. Seperti yang telah diutarakan bahwa pasangan poli AU merupakan pasangan yang lemah sehingga hibrid DNA - RNA mudah lepas dan juga melepaskan enzim transkriptase.

19 Pascatranskripsi: Proses ini banyak terjadi pada eukaryot, meliputi pemotongan, penambahan, dan modifikasi beberapa basa pada mrna tepat sesudah transkripsi terjadi. Pada prokaryot umumnya mekanisme pasca transkripsi tidak terjadi sebab sebelum mrna lepas dari DNA cetakannya, ribosom langsung menempel pada ujungujung mrna untuk melakukan proses translasi Transkrispsi berlangsung ditempat yang sama dengan translasi.

20 Pada eukaryot proses transkripsi terpisah dengan proses translasi. Transkripsi terjadi dalam membran inti sedangkan translasi berlangsung di sitoplasma. Diantara proses transkripsi dan translasi inilah proses pascatranskripsi terjadi. Dalam transkripsi eukaryot mula-mula disintesis pra-mrna yang disebut dengan hnrna (heterogenous nuclear RNA), yang didalamnya terdapat intron dan ekson. Intron akan dibuang dalam proses pascatranslasi.

21 Proses pascatranskripsi meliputi 3 kegiatan: 1. Pemasangan tudung/topi pada ujung 5. Dilaksanakan tepat sesudah transkripsi, dilakukan oleh enzim guanili-transferase, dengan menambahkan gugus guanosin pada ujung 5 trifosfat, yang dilanjutkan dengan penambahan gugus metil pada N7 dari nukleotida guanin yang ditambahkan. 2. Penambahan ekor poliadenil (poli A). Pada ujung 3 -OH. Sekitar 200 nukleotida adenin yang ditambahkan. Fungsi sebenarnya belum diketahui dengan pasti. 3. Pemenggalan intron. Dilakukan hampir pada semua hnrna. Dengan proses ini mrna matang akan selalu lebih pendek dari pra-mrna atau hnrna.

22 TRANSLASI Translasi adalah: penterjemahan urutan tiga nukleotida/basa-basa (kodon) mrna menjadi runtutan asam amino polipeptida. Penterjemahan masing-masing kodon dilakukan terhadap tiga nukleotida/tiga basa mrna menjadi asam amino. Pasca Translasi merupakan tahap akhir dari proses ekspresi gen

23 Perangkat translasi: 1. mrna sebagai pola cetakan dalam sintesis protein. 2. trna sebagai pangangkut asam amino. 3. Ribosom: merupakan tempat berlangsungnya translasi. 1. mrna sebagai cetakan sintesis protein: Setiap jenis kombinasi tiga basa yang berdampingan pada mrna mengandung sandi genetik (kodon) tertentu yang dapat diterjemahkan menjadi asam amino. Hanya ruas mrna yang diapit oleh kodon awal dan kodon akhir yang disintesis proteinnya.

24 Kodon awal umumnya adalah rangkaian tiga basa AUG; sedangkan kodon akhir adalah UAA, UAG, dan UGA. Dibagian hulu dari kodon awal terdapat satu rangkaian nukleotida yang berfungsi sebagai tempat penempelan ribosom yang disebut dengan situs Shine Dalgarno. Dalam satu mrna prokaryot ditemukan lebih dari satu ruas penyandi protein (mrna poligenik) diantara sekuen promotor dan terminatornya sedangkan pada eukaryot hanya terdapat satu ruas penyandi protein diantara sekuen promotor dan terminatornya (mrna monogenik).

25 2. trna sbg pangangkut aa: trna berfungsi sebagai pengangkut asam amino ke dalam kompleks translasi serta membaca sandi (kodon-kodon) mrna. Proses ini terjadi dengan bantuan enzim sintetase aminoasil-trna. Untuk 20 jenis asam amino digunakan 31 jenis trna untuk mengangkut ke dalam kompleks translasi.

26 3. Ribosom: Tempat berlangsungnya translasi. Komponen penyusun ribosom adalah rrna dan protein ribosom yang mampu mengenali mrna, rrna, dan sejumlah enzim dan protein yang berperanan dalam proses translasi. Ribosom tdd 2 subunit, yaitu subunit kecil dan subunit besar. Subunit kecil mengandung sekitar 1/3 massa ribosom dan 2/3 lainnya massa subunit besar. Dalam ribosom terdapat satu situs untuk mrna, dua situs untuk trna dan satu situs untuk enzim transferase peptidil (berperan dalam merangkaikan satu jenis asam amino dengan asam amino yang lain). Sedangkan situs untuk trna yaitu situs A (pintu masuk) dan P (lokasi penerima), terdapat sebagian pada subunit kecil dan sebagian pada subunit besar.

27 Tahapan Translasi: Pada awalnya ribosom akan membaca kodon-kodon yang berdampingan mulai dari kodon awal (AUG pertama setelah Shine Dalgarno) sampai ditemukan satu jenis kodon akhir (UAA, UAG, atau UGA). Tahapan translasi tdd: (i) Pembentukan aminoasil-trna; (ii) Inisiasi atau pengenalan kodon awal; (iii) Perpanjangan rantai polipeptida; dan (iv) Penutupan sintesis polipeptida pada kodon akhir.

28 (i) Pembentukan aminoasil-trna Proses ini terjadi dengan bantuan enzim sintetase aminoasil-trna, yang berfungsi mengaitkan satu jenis asam amino pada satu jenis trna diujung 3 (jadi enzim sintetase aminoasil-trna berfungsi membuat kompleks aminoasil-trna) dan membawanya ke kompleks translasi. Kegiatan pembentukan aminoasil-trna tdd dua tahapan. (1) pengaktifan asam amino dengan hidrolisis satu ATP sebagai sumber energi membentuk aminoasil-amp, (2) Mereaksikan asam amino berenergi tinggi terhadap trna membentuk aminoasil-trna.

29 (ii) Inisiasi/pengenalan start kodon Terjadi dalam tiga tahapan yaitu: 1. Penempelan mrna pada subunit kecil ribosom dengan cara pengenalan situs Shine Dalgarno oleh rrna 16S; 2. Penempelan trna inisiator pada situs P subunit kecil ribosom; dan 3. Subunit besar ribosom dengan kompleks subunit ribosom-trna-mrna, membentuk ribosom sempurna yang siap membaca kodonkodon mrna

30 (iii) Perpanjangan rantai polipeptida; Pada proses ini terlibat sejumlah protein yang disebut dengan faktor perpanjangan (elongation factor), enzim transferase peptidil, serta Guanosin Triphosphat (GTP). (iv) Penutupan sintesis polipeptida pada kodon akhir (akhir proses translasi): Pada saat ribosom menemui salah satu dari kodon akhir UAA, UAG atau UGA, proses perpanjangan rantai polipeptida/asam amino akan berakhir, dan kompleks ribosom trnamrna-polipeptida dipisahkan.

31 Pascatranslasi: Rangkaian asam-amino/polipeptida sebelum mencapai bentuk akhir protein mengalami proses pascatranslasi dengan dua tujuan yaitu: (1) berhubungan dengan proses pelipatan dan kestabilan struktur akhir protein dan (2) berhubungan dengan proses transport dan pengaktifan enzim dan protein lainnya. Dalam proses pascatranslasi terjadi dua jenis modifikasi yaitu (1) modifikasi rantai utama polipeptida (2) modifikasi percabangannya

32 MODIFIKASI ASAM AMINO Terdapat 20 asam amino yang dikenal dalam sandi genetik, yang berasal dari penerjemahan kodon. Tetapi dari analisis nyata protein terdapat sekitar 100 jenis asam amino selain yang 20 asam amino, yang tidak dikenal oleh ribosom dalam translasi. Dipercayai ini merupakan modifikasi kovalen dari keduapuluh asam amino setelah proses translasi. Perubahan sederhana banyak ditemukan pada berbagai asam amino terutama pada ujung C dan N seperti asetilasi dan amidasi asam amino.

33 MODIFIKASI ASAM AMINO Modifikasi asam amino juga banyak berhubungan dengan regulasi fungsi protein seperti: metilasi, fosforilasi, nukleotidasi, dan ADP-ribosilasi. Modifikasi juga terjadi pada pembentukan ikatan silang disulfida antar protein untuk membentuk protein yang lebih stabil. Modifikasi dengan pemotongan rantai utama: beberapa protein hasil translasi terkadang perlu dipotong dan disambung kembali dengan protein lain untuk tujuan transportasi protein ke tempat lain.

34 Sandi Genetik Merupakan hubungan antara asam amino/peptida-peptida yang terdapat dalam rangkaian polipeptida dengan runtutan kodon yang terdapat pada mrna. Karena rangkaian dibentuk berdasarkan model DNA pada ruas gen, maka sandi genetik juga dapat diartikan sebagai aturan hubungan antara gen dan protein. Perhatikan tabel berikut:

35 Basa Basa Kedua Basa Pertama U C A G Ketiga UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys U UUC fenilala UCC serin UAC tirosin UGC sistien C U nin UUA Leu leusin UCA UAA Kodon akhir UGA Kodon akhir A UUG UCG UAG UGG Trp G triptofan CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg U CUC CCC prolin CAC histidin CGC arginin C C CUA CCA CAA Gln CGA A CUG CCG CAG glutamin CGG G AUU Ile CCU Thr AAU Asn AGU Ser U AUC isoleusi ACC threonin AAC aspartat AGC serin C A AUA n ACA AAA Lys AGA Arg A AUG Met Kodon awal ACG AAG lisin AGG arginin G GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly U GUC valin GCC alanin GAC aspartat GGC glisin C G GUA GCA GAA Glu GGA A GUG GCG GAG glutamat GGG G

36

37 TERIMA KASIH ATAS PERHATIANNYA Semoga barokah Dan bermanfaat