PENGEMBANGAN MARKA SIMPLE SEQUENCE REPEAT UNTUK Jatropha spp.

Transkripsi

1 Jurnal Littri 17(4), Desember 2011 Hlm ISSN JUNAL LITTI VOL. 17 NO. 4, DESEMBE 2011 : PENGEMBANGAN MAKA SIMPLE SEQUENCE EPEAT UNTUK Jatropha spp. DAMAWAN SAPTADI 1,.. SI HATATI 2, ASEP SETIAWAN 3, BAMBANG HELIYANTO 4, dan SUDASONO 3 1 Jurusan Budidaya Pertanian, aperta, Universitas Brawijaya, Jl. Veteran, Malang 2 Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Perkebunan, Jl. Tentara Pelajar 1, Bogor 3 Lab. Biologi Molekuler Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, aperta, IPB. Jl. Meranti, Kampus Darmaga, Bogor Balai Penelitian Tanaman Tembakau dan Serat, Jl. aya Karangploso km. 4, Malang darmawansaptadi@gmail.com (Diterima Tgl Disetujui Tgl ) ABSTAK Pemuliaan tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) untuk menghasilkan varietas berdaya hasil dan berkadar minyak tinggi perlu dilakukan. Penggunaan marka molekuler dapat membantu mempercepat tercapainya tujuan pemuliaan tanaman jarak pagar. Marka simple sequence repeat (SS) merupakan marka ko-dominan yang efektif untuk mendukung program pemuliaan tanaman, tetapi penerapannya pada jarak pagar masih terbatas. Penelitian yang dilakukan bertujuan untuk : (i) merancang primer spesifik SS menggunakan aksesi DNA jarak pagar yang tersedia di GenBank DNA database dan (ii) mengevaluasi efektivitas pasangan primer yang dirancang untuk menghasilkan marka SS yang polimorfik untuk jarak pagar dan J. multifida. Dua puluh delapan pasang primer spesifik SS telah berhasil dirancang menggunakan aksesi DNA asal jarak pagar yang ada di GenBank DNA database. DNA genomik jarak pagar dan J. multifida yang diisolasi dapat digunakan sebagai templat untuk amplifikasi PC. Dari 28 pasang primer yang dikembangkan, semuanya mampu menghasilkan marka SS dari genom jarak pagar dan hanya 19 pasang primer yang menghasilkan marka SS dari genom J. multifida. Dari 19 pasangan primer spesifik SS yang dievaluasi mampu dihasilkan 44 alel dengan ukuran produk amplifikasi berkisar antara bp. Sebanyak 35 alel (79,5%) yang diamati merupakan alel yang polimorfik. Marka SS yang didapatkan tidak polimorfik intra-aksesi jarak pagar atau intra-aksesi J. multifida tetapi polimorfik untuk inter-aksesi kedua spesies. Karena marka SS yang dihasilkan bersifat polimorfik untuk aksesi jarak pagar dengan aksesi J. multifida maka dapat digunakan sebagai marka untuk mendeteksi hasil persilangan 1 inter-spesies J. curcas x J. multifida. Kata kunci : Jatropha curcas L., jarak pagar, J. multifida, DNA berulang, rancangan primer ABSTACT Development of Simple Sequence epeat Markers for Jatropha spp. Breeding of physic nut (Jatropha curcas L.) to obtain new varieties that are high in yield and oil content needs to be conducted. Molecular marker could be used to assist breeding of physic nut (J. curcas). Simple sequence repeat (SS) marker is a co-dominant marker and theoretically it could be used to support physic nut breeding program. However, only limited information has been available regarding molecular analysis of physic nut. The objectives of this research were: (i) to design SS specific primer based on DNA sequences available in the GenBank DNA database and (ii) to evaluate effectiveness of the primer pairs to produce polymorphic SS markers for J. curcas and J. multifida. Twenty eight primer pairs were designed and developed using physic nut DNA available in the GenBank DNA database. Total genomic DNA isolated from J. curcas and J. multifida could be used as DNA templates for PC amplification. Of the 28 primer pairs developed in this research yielded SS marker using J. curcas genomic DNA, while only 19 out of 28 pairs yielded SS markers using J. multifida genomic DNA. As many as 44 alleles with the size of amplified products ranged from bp were identified. Thirty five alleles (79.5%) out of 44 identified ones were polymorphic. esults of analysis indicated that identified SS markers generated using the designed primers were not polymorphic intra accession of J. curcas nor intra-accession of J. multifida either. However, the generated SS markers were polymorphic for inter-accession of the two Jatropha species. Since the generated markers were only polymorphic for J. curcas and J. multifida, they could be used as markers for identifying interspecific 1 hybrids derived from crossing between J. curcas and J. multifida. Key words: Jatropha curcas L., physic nut, J. multifida, DNA repeat sequence, primer design PENDAHULUAN Jarak pagar ( Jatropha curcas L.) adalah tanaman tahunan multifungsi, berumah dua, dan merupakan anggota Euphorbiaceae. Pada awalnya jarak pagar digunakan sebagai tanaman obat. Beberapa tahun terakhir ini jarak pagar lebih dikenal sebagai tanaman penghasil minyak yang dapat digunakan untuk biodiesel. Jarak pagar berasal dari Mexico dan Amerika Tengah yang kemudian menyebar ke daerah tropis maupun subtropis. Tanaman jarak pagar pada awalnya ditanam sebagai pagar pengaman atau untuk keperluan tradisional lainnya (HELLE, 1996). Pada beberapa tahun terakhir ini nilai ekonomi jarak pagar sebagai penghasil biodiesel meningkat pesat (AILESS, 2007). Hal penting yang harus dilakukan untuk dapat menggunakan jarak pagar sebagai penghasil biodiesel adalah pengembangan kultivar yang memiliki hasil biji dan kadar minyak tinggi serta dapat beradaptasi dengan baik pada berbagai kondisi lingkungan (DIVAKAA et al., 2010). 140

2 DAMAWAN SAPTADI et al.: Pengembangan marka simple sequence repeat untuk Jatropha spp. Plasma nutfah jarak pagar telah dikoleksi dan dianalisis di Brazil, Indonesia, dan China ( OU et al., 2009; TATIKONDA et al., 2009). Jarak pagar memiliki genom heterosigot dan beberapa penelitian menunjukkan nilai interaksi genetik dan lingkungan yang cukup besar (MAKKA et al., 1997; KAUSHIK et al., 2007) sehingga program pemuliaan konvensional tidak akan efektif. Strategi pemuliaan berbasis genom sangat penting dilakukan. Sampai saat ini pemetaan genetik jarak pagar belum dilakukan dan informasi genetik berdasarkan marka molekuler masih sangat sedikit ketersediaannya. Marka SS masih dianggap sebagai marka yang paling efisien tetapi penggunaannya masih terbatas karena memakan banyak waktu dan tenaga dalam pengembangannya. Ada dua strategi umum yang digunakan untuk mengakses daerah yang mengandung SS dan membuat markanya yaitu : (1) penelusuran sekuen yang mengandung SS pada database yang telah tersedia atau (2) konstruksi dan skrining pustaka genom dengan pelacak yang berkaitan dengan SS. Cara pertama dinilai sangat hemat, sederhana dan relatif cepat ( AKOCZY-TOJANOWSKA, 2004). Strategi ini telah berhasil dikembangkan pada tanaman cabai (SANWEN et al., 2000) dan buncis (GUEA-SANZ, 2004). Marka SS menarik dikembangkan khususnya pada spesies yang menunjukkan variasi genetik rendah, pada populasi inbred dan populasi yang diperoleh dari daerah-daerah berdekatan sehingga sulit dipilah-pilah dengan pendekatan lain (ÖDE et al., 1995). Keuntungan SS secara alami adalah : (i) multipel alel SS dapat dideteksi pada lokus tunggal menggunakan penapisan berbasis PC, (ii) SS biasanya terdistribusi pada seluruh genom, (iii) sifatnya kodominan, (iv) jumlah DNA yang dibutuhkan hanya sedikit, dan (v) analisis dapat dilakukan secara semi otomatis (OBINSON et al., 2004). Jarak pagar di Indonesia berpotensi besar sebagai penghasil bahan bakar nabati sehingga perlu dilakukan penelitian untuk mengoptimalkan keberadaan plasma nutfah tersebut untuk kepentingan pemuliaan tanaman. Sampai saat ini belum ada penelitian yang memanfaatkan marka SS untuk evaluasi keragaman genetik jarak pagar Indonesia. Penelitian ini dilakukan untuk mengawali langkah-langkah pemuliaan tanaman pada jarak pagar dengan basis marka SS. Tujuan penelitian ini adalah adalah untuk: (i) merancang primer spesifik SS menggunakan aksesi DNA jarak pagar yang tersedia di GenBank DNA database dan (ii) mengevaluasi efektivitas pasangan primer yang dirancang untuk menghasilkan marka SS yang polimorfik untuk jarak pagar dan J. multifida L. Marka-marka SS yang ditemukan pada penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan bagi percepatan kegiatan pemuliaan tanaman jarak pagar untuk mendapatkan varietas unggul baru. BAHAN DAN METODE Analisis molekuler dan penelusuran serta analisis menggunakan perangkat lunak online dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Tanaman (PMB Lab.), Departemen Agronomi dan Hortikultura, akultas Pertanian, IPB. Penelitian dilakukan dari bulan Mei sampai dengan November Bahan tanaman untuk percobaan berasal dari Kebun Induk Jarak Pagar (KIJP) Pakuwon, Sukabumi yang terdiri atas lima aksesi jarak pagar dari berbagai daerah yang berbeda dan dua individu J. multifida dari Bogor dan Sukabumi. Aksesi J. multifida digunakan untuk mengevaluasi peluang penggunaan primer yang dievaluasi pada spesies Jatropha yang masih sekerabat dengan jarak pagar. Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA pertama kali dilakukan dengan metode CTAB standar yang dikembangkan oleh DOYLE dan DOYLE (1990) dan digunakan untuk ekstraksi jarak pagar oleh BASHA dan SUJATHA (2007). Modifikasi dilakukan dengan meningkatkan konsentrasi NaCl pada buffer ekstraksi dari 1,4 M menjadi 3,5 M dan menambahkan NaCl hingga konsentrasi 2 M pada saat presipitasi bersamaan dengan penambahan isopropanol sesuai dengan metode yang dikembangkan oleh PAMIDIMAI et al. (2009). Metode modifikasi selengkapnya diuraikan sebagai berikut. Sebanyak 0,1 g daun muda (daun berwarna keunguan, sedikit transparan dengan lebar sekitar 2-3 cm) dari tanaman sampel yang ditumbuhkan di lapangan, digerus dengan 500 µl buffer ekstraksi (CTAB 2%, 100 mm Tris HCl ph 8, 3,5 M NaCl) dan 1% polyvinylpolypyrolydone (PVP). Ekstrak daun kemudian dipindahkan ke dalam tabung mikro berukuran µl, ditambahkan 1,5% β-merkaptoetanol, dan diinkubasi pada suhu 65 o C selama 90 menit. Setelah inkubasi ditambahkan kloroform : isoamil alkohol (24:1) dengan volume sebanding dan digoyang-goyang perlahan selama 10 menit. Campuran disentrifugasi rpm selama 8 menit pada suhu ruang. ase cair bagian atas dipindahkan ke tabung yang baru dan ditambahkan 2M NaCl dengan volume sebanding. Ke dalam campuran tersebut ditambahkan isopropanol sebanyak 0,6 kali volume akhir dan diinkubasi pada suhu ruang selama 60 menit. Alkohol 80% sebanyak 2x dari volume akhir ditambahkan pada campuran tersebut dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Selanjutnya campuran disentrifugasi rpm selama 15 menit pada suhu ruang. Pelet dicuci dengan alkohol 70% kemudian dikeringkan dan dilarutkan pada 200 µl buffer TE. 141

3 JUNAL LITTI VOL. 17 NO. 4, DESEMBE 2011 : Tabel 1. Aksesi jarak pagar dan kerabatnya yang digunakan untuk evaluasi primer SS yang dikembangkan dalam penelitian. Table 1. Accessions of Jatropha sp. for evaluation of using developed SS primers Genotip Genotype Asal Collection site Umur berbunga (hari) Age of flowering (day) J. curcas IP-M-3 Jawa Timur >360 J. curcas SP 6-3 Sulawesi Selatan 274 J. curcas HS 49-2 NTT 91 J. curcas IP -1A-2 NTB 99 J. curcas PT 26-2 Lampung 84 J. multifida # 1 Bogor - J. multifida # 2 Sukabumi - Keterangan : (-) Tidak dilakukan pengamatan umur berbunga karena tidak ditanam dari awal Note : (-) No observation because the accessions were not planted from seedlings Total DNA genomik yang didapat dikuantifikasi menggunakan spektrofotometer UV (Shimadzu UV ) pada λ 260 nm dan kemurniannya ditentukan dengan menghitung nisbah absorban pada λ 260 terhadap 280 nm sesuai dengan prosedur yang dikembangkan oleh SAMBOOK et al. (1989). Konsentrasi dan kemurnian DNA juga dicek dengan perbandingan hasil elektroforesis sampel DNA dengan standar pada gel agarosa 1%. ancangan Primer SS Penelusuran aksesi DNA jarak pagar yang ada di GenBank database dilakukan secara online pada situs Setiap aksesi DNA jarak pagar yang diperoleh dari DNA database, dievaluasi ada tidaknya runutan nukleotida yang merupakan simple sequence repeat (SS). Selain itu, agar tidak duplikasi, semua aksesi dianalisis kesamaan runutan nukleotidanya dengan multiple alignment (HIGGINS et al., 1996) menggunakan perangkat lunak online ClustalW yang tersedia di situs Selanjutnya, dari aksesi DNA yang unik dan positif teridentifikasi membawa SS, dirancang primer spesifik yang mengapit runutan nukleotida SS-nya. ancangan primer SS dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Primer3 (OZEN and SKALETSKY, 2000) yang tersedia secara online pada situs Primer yang berhasil dirancang digunakan untuk mengamplifikasi sampel DNA jarak pagar dan J. multifida. Amplifikasi DNA dan Separasi Hasil Amplifikasi DNA yang telah diekstraksi diamplifikasi PC menggunakan beberapa primer yang berhasil dirancang. Volume reaksi amplifikasi PC yang digunakan adalah 25 µl, yang masing-masing terdiri atas 1x buffer reaksi, 0.1 µm dntps, 1 unit eal Taq DNA Polymerase (eal Biotech Corporation) dan 20 ng templat DNA. eaksi amplifikasi PC menggunakan GeneAmp PC System 2400 (Perkin Elmer) dengan denaturasi awal pada 95 o C selama 5 menit, diikuti dengan 35 siklus yang masingmasing terdiri atas tahapan denaturasi pada suhu 94 o C selama 30 detik. Kemudian diikuti dengan penempelan primer ( primer annealing) pada suhu yang sesuai untuk masing-masing pasangan primer selama 1 menit dan pemanjangan primer ( primer elongation) pada suhu 72 o C selama 1 menit. Pada akhir reaksi ditambahkan satu siklus final extension pada suhu 72 o C selama 5 menit. DNA hasil amplifikasi dievaluasi dengan dua sistim elekktroforesis, yaitu elektroforesis gel agarosa (1%) yang digunakan untuk konfirmasi keberadaan hasil amplifikasi dan PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) yang digunakan untuk skoring alel SS. Hasil elektroforesis gel agarosa divisualisasi dengan menggunakan pewarnaan etidium bromida dan difoto di bawah penyinaran UV menggunakan UV transluminescent. Elektroforesis dengan gel akrilamid digunakan untuk memperoleh resolusi yang lebih baik sehinga komposisi alel SS yang muncul dapat diidentifikasi. Analisis menggunakan PAGE (40% akrilamide/bis-akrilamid, 10% amonium persulfat, 5X buffer TBE, urea dan TEMED) dilakukan dengan Dedicated Height Sequencer (Cole -Parmer) menggunakan buffer TBE 1x pada tegangan konstan V selama 3 jam. Volume hasil PC yang dianalisis adalah 1.8 µl dengan 60 sampel per gel. Hasil PAGE divisualisasi dengan pewarnaan menggunakan pewarnaan perak ( silver staining). Marka DNA berukuran kelipatan 100 bp (100 bp ladder) digunakan untuk membantu menentukan ukuran potongan DNA hasil amplifikasi PC. Ekstraksi DNA HASIL DAN PEMBAHASAN Metode ekstraksi DNA yang digunakan pada penelitian ini dimulai dengan mengacu pada metode CTAB standar ( DOYLE dan DOYLE, 1990) yang telah digunakan untuk jarak pagar (BASHA dan SUJATHA, 2007), yang ternyata sulit dilaksanakan karena tidak berhasil menghilangkan kontaminasi klorofil. Molekul DNA yang berupa benang-benang putih tidak didapatkan dan muncul endapan berupa serbuk putih. Selain itu, hasil ekstraksi yang didapat menggunakan protokol yang digunakan BASHA dan SUJATHA (2007) sulit dilarutkan dalam buffer TE dan molekul DNA genomik yang didapatkan juga mempunyai kualitas rendah (Gambar 1A). Sampel DNA juga terlihat banyak tertinggal pada sumur gel agarosa, yang mengindikasikan tingginya kontaminan protein, polisakarida atau 142

4 DAMAWAN SAPTADI et al.: Pengembangan marka simple sequence repeat untuk Jatropha spp A B Gambar 1. High molecular weight DNA hasil ekstraksi dengan protokol (A) CTAB standar dan (B) Protokol modifikasi. Kolom (1-4) - aksesi J. curcas dan kolom (5-6) aksesi J. multifida igure 1. High molecular weight DNA extracted using (A) Standard CTAB protocol and (B) Modified protocol. Column (1-4): accessions of J. curcas, and column (5-6): : accessions of J. multifida metabolit sekunder pada sampel DNA ( DO dan ADAMS, 1991; SHAMA et al., 2002). Jarak pagar dan J. multifida termasuk dalam famili Euphorbiaceae yang banyak menghasilkan getah sehingga kualitas serta kuantitas DNA yang kurang bagus dari hasil ekstraksi ini diduga berkaitan dengan keberadaan kontaminan tersebut. Berdasarkan penelusuran pustaka (PAMIDIMAI et al., 2009) diperoleh metode modifikasi untuk ekstraksi DNA tanaman yang mengandung banyak protein dan polisakarida yaitu dengan meningkatkan konsentrasi NaCl pada buffer ekstraksi dan penambahan NaCl konsentrasi tinggi pada saat presipitasi. Modifikasi dalam prosedur isolasi DNA ini telah diterapkan, yaitu dengan meningkatkan konsentrasi NaCl pada buffer ekstraksi dari 1,4 M menjadi 3,5 M dan menambahkan NaCl hingga konsentrasi 2 M pada saat presipitasi bersamaan dengan penambahan isopropanol. Dengan modifikasi di berbagai tahapan isolasi DNA tersebut, terbukti dapat dihasilkan kualitas dan kuantitas DNA yang baik (Gambar 1B). Berbagai modifikasi tahapan isolasi DNA yang digunakan tersebut masih belum sepenuhnya dapat menghilangkan kontaminan yang terbawa selama proses ekstraksi DNA. Namun demikian, kualitas DNA yang didapat sudah memadai untuk keperluan amplifikasi PC. Kuantitas DNA yang diperoleh berkisar antara ng/µl. ancangan Primer SS ancangan primer SS dimulai dengan penelusuran di database untuk aksesi DNA jarak pagar, yang tersedia secara online di situs Kata kunci umum yaitu Jatropha curcas digunakan untuk penelusuran awal. Dengan kata kunci Jatropha curcas dihasilkan luaran hasil pencarian sebanyak 157 aksesi, yang merupakan aksesi cdna dan fragmen DNA genomik asal jarak pagar serta DNA lain-lain. Keluaran yang diperoleh ternyata masih bersifat umum dan tidak semua merupakan aksesi DNA asal jarak pagar. Pada tahapan berikutnya, kata kunci yang digunakan dipersempit, yaitu dengan kata kunci Jatropha curcas + microsatellite. Dari pencarian tersebut berhasil didapatkan 39 aksesi DNA. Dari jumlah luaran pencarian dengan kata kunci Jatropha curcas + microsatellite yang hanya menghasilkan 39 aksesi DNA, mengindikasikan sedikitnya penelitian tentang jarak pagar khususnya yang berkaitan dengan marka SS. Aksesi DNA yang diperoleh dari penelusuran selanjutnya dievaluasi dan yang tidak teridentifikasi mempunyai SS tidak digunakan lebih lanjut. Aksesi-aksesi yang memiliki sekuen SS digunakan untuk merancang pasangan primer SS. Beberapa aksesi DNA yang ada terlalu pendek atau posisi SSnya ada di ujung potongan DNA sehingga tidak dapat digunakan untuk merancang primer. Aksesi DNA yang didapat dievaluasi kemiripannya dengan aksesi yang lain yang dilakukan secara online dengan perangkat lunak ClustalW (HIGGINS et al., 1996). Beberapa aksesi yang tingkat kemiripan runutan DNA-nya tinggi hanya dipilih satu sebagai representasi kelompoknya agar tidak terjadi duplikasi lokus yang diamplifikasi. Pemilihan pasangan primer yang akan dievaluasi juga mempertimbangkan kesesuaian melting point antara pasangan primer forward dan reverse-nya, yaitu dipilih yang melting point-nya sama atau paling berdekatan (DIEENBACH et al., 1993). Setelah semua faktor yang diperlukan dijadikan pertimbangan, 28 pasang primer SS spesifik telah terpilih sebagai hasil akhir kegiatan (Tabel 2). 143

5 JUNAL LITTI VOL. 17 NO. 4, DESEMBE 2011 : Tabel 2. Daftar 28 pasang primer spesifik untuk mengamplifikasi SS yang dirancang menggunakan aksesi DNA jarak pagar dari GenBank DNA Database Table 2. List of 28 pairs of SS specific primer designed based on available physic nut DNA accessions in the GenBank DNA database and used for PC amplification. No No No aksesi Acc. No 1 EU EU EU EU EU EU EU E E EU EU EU EU EU EU EU EU EU EU EU EU EU EU EU A EU EU EU Sekuen primer Primer sequence GGGCTGGGATTTTGTCTCTT GGCATGACCCTTGTGACTCT GAAAAGGTAAAGCATGGCTGA TGTTCAGAAATGGATAGGGAAGA GGTGCTACTGTCGGATGGTT TGAATCCTGGAATGGGGATA GAAAAGGTAAAGCATGGCTGA TGTTCAGAAATGGATAGGGAAGA CATGAAGTTTGCTGGCAATG AAAGGTCATCTGGTAAAGCCATA ATCTTGATGGGTGATGAGACG TCCACAACCACAACCTTTGA AAAAATTGAGGATATTACAGCATGAA GGCAACATGCCTAAAAATCAA GGCATTTCCTTGCATTTTCA CTGAGCAAACGGGGAAGTAA GGCATTTCCTTGCATTTTCA GAAGGGCAGAGGCTTCACTA CTCATGAACAACAAGAATTT CAGATTCTAATGAAGGTACG TTTTTCTTGAAAGTTTTTGT TAGTTCGTCTTGAAGCTTAG AACTGTAACGTTGTGAGTTC CTGATTTCTGGTCTCAATAG TAAAATGCCAACTTTTACT ACATATCGAAGATAGGGAAT CAAATAGATTCCTCAATCC GGGACCCAAAGAAACAAT GTCGGATGACTAGATTGATA AGAGATATTGGGCTAAAACT ATTCATGTACCAGTCAAGTC TGCTAAAACTCTGGTTCTCT AACTAGAAAGGTTGTTTTTC TTATGTCTCTTTTCCATGTC GTATATGTGGTCAAGCATTT AAAACAGCATAATACGACTC CTAAAGCCACTTTATCAATC TAACCGAATAGTTCTTACCA CAAGCATAGATGTAGAAAAAC TTATGTCTCTTTTCCATGTC CTTTATAAGGTCAACTCCAA CAAGTAAGAAGTGAAGAAAAA CTAAAATGATTCGAGTTTTC TGACTTTTTCTGAGTTCTGT TGCTAAAACTATGGTTCTCT ATTCATGTACCAGTCAAGTC ATTGAAGAAGTGGAGTGTG TCATCTAAAATGCTCTGGT CATCTTATGAAACTGTCGTT TACTTACAAAGAAAGCGAGA TAGAAGTTTTGTGATTAGGT GACTGCGTACCAATTCAT CAAAATAAGTCGAAACAAAC TATAGGCTCTTGCATAAATC AGAAGAAAGAGGCGACAGGA AAATTCTTGTTGTTCATGAGGATG Keterangan : = primer forward, = primer reverse, Ta = annealing temperature Note Produk PC (bp) Amplified product (bp) Ta ( o C) Pola ulangan epeat pattern (GT)12(AG) (TG)6..(TG) (TG)4..(TG) (GT)3..(TG)2.(GT) GT(4)..(GA) (TG)3..(TA) (TG)4..(TG)2..(GT)3..(GT) (TAA)10..(A) (TAA)10..(A) (TA)3(TG)18..(TA) (CA) (CA) (TA)3(C)6..(C)7(A)3(CA) (TC) (GT) (C)6..(C)5(AC) (AC) (CA) (CA)12..(CA)2..(CA) (TA)5(CA)2..(CA) (CTT)4..(CTT)3..(CTT) (CA) (G)3(GT)5(G)5..(G) (GT) (TAA) (GT) (A)6..(A)8..(CA) (GAA)7 144

6 DAMAWAN SAPTADI et al.: Pengembangan marka simple sequence repeat untuk Jatropha spp. Semua aksesi yang digunakan untuk merancang primer SS berasal dari DNA genom jarak pagar, yang terdiri atas 25 aksesi mikrosatelit dengan panjang antara bp. Dua aksesi merupakan bagian dari promoter gen ribosom inactivating protein (489 bp [E612741] dan 620 bp [E612739] dan satu aksesi merupakan gen prekursor kursin dengan panjang bp (A469003). Berdasarkan runutan nukleotida aksesi DNA yang digunakan, pola ulangan mikrosatelit yang ditemukan adalah dinukleotida tunggal TG (6 aksesi), CA (5 aksesi), G T (3 aksesi), dan TC (1 aksesi), trinukleotida tunggal CTT, GAA atau TAA (masing-masing satu aksesi) atau pola ulangan kombinasi antara dua dinukleotida (GT-AG, TA-TG, TA- CA), dinukleotida dan mononukleotida (TA-CA-C-A, AC- C, GT-G, CA-A) serta trinukleotida dan mono-nukleotida (TAA-A). Panjang primer hasil rancangan berkisar antara bp. Suhu penempelan primer ( primer annealing) bervariasi antara 44, 45, 54, atau 55 o C. Pengujian pasangan primer spesifik SS yang didapat untuk melakukan amplifikasi PC menggunakan templat DNA jarak pagar, mengindikasikan bahwa semua pasangan primer mampu menghasilkan produk amplifikasi. Ini paling tidak mengindikasikan dua hal, yaitu bahwa kualitas dan kuantitas DNA yang diekstraksi cukup memadai untuk digunakan sebagai templat dan pasangan primer hasil rancangan yang dilakukan mampu menghasilkan produk amplifikasi PC. epresentasi produk PC yang didapat dengan menggunakan pasangan primer yang dievaluasi dalam penelitian ini disajikan pada Gambar 2. Hasil pemisahan ukuran produk amplifikasi dengan PAGE menunjukkan bahwa 28 pasangan primer yang dievaluasi menghasilkan produk amplifikasi dengan templat DNA genomik jarak pagar dan hanya 19 pasangan primer yang menghasilkan produk amplifikasi dengan templat DNA genomik J. multifida. Jumlah pita DNA hasil amplifikasi PC yang muncul sebagian besar terdiri atas satu atau dua pita (Gambar 3). Hasil running PAGE menunjukkan bahwa dari 19 pasang primer yang digunakan dapat menghasilkan 44 alel dimana 35 di antaranya (0,8%) merupakan alel polimorfik dengan ukuran produk amplifikasi berkisar antara bp. Polimorfisme hanya terjadi antar alel-alel pada J. curcas dengan dengan alel-alel J. multifida. Sebaliknya, antar lima aksesi jarak pagar yang dievaluasi menunjukkan pola pita yang sama. Kesamaan pola pita DNA hasil amplifikasi juga diamati untuk kedua aksesi J. multifida yang diuji. Polimorfisme antara alel-alel yang muncul di antara aksesi J. curcas dengan yang muncul di antara aksesi J. multifida dapat berupa perbedaan ukuran pita DNA hasil amplifikasi atau berupa adanya hasil amplifikasi untuk aksesi jarak pagar dan tidak ada hasil amplifikasi ( null allele) untuk aksesi J. multifida (Tabel 3; Gambar 3). Terdapat 17 pasang primer menunjukkan polimorfisme antara aksesi jarak pagar dengan aksesi J. multifida. Dari 17 pasang primer tersebut, 7 pasang primer menghasilkan produk amplifikasi dengan perbedaan ukuran pita DNA, sedangkan 10 pasang primer yang lain mampu menghasilkan produk amplifikasi dari genom jarak pagar tetapi tidak menghasilkan produk amplifikasi dari genom J. multifida (Tabel 3; Gambar 3). Kemunculan dua pita pada aksesi tanaman jarak pagar (Gambar 3) dapat diartikan bahwa pada genom ta - namannya terdapat satu lokus (misal nya lokus EU586347) dan dalam lokus EU yang dianalisis terdapat dua alel. Dengan demikian, konstitusi genetik aksesi yang 8 9 Gambar 2. Elektroferogram hasil evaluasi produk amplifikasi PC dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Pewarnaan gel agarosa dilakukan dengan ethidium bromide dan foto gel diambil di bawah pencahayaan sinar UV. Hasil amplifikasi PC dengan menggunakan templat genom jarak pagar dan pasangan primer (1) E612741, (2) EU586345, (3) E612739, (4) EU586340, (5) EU586343, (6) EU586344, (7) EU586346, (8) EU586347, dan (9) EU igure 2. Electropherogram of amplified PC products fractionated on agarose gel and stained with ethidium bromide for visualization. Photograph was taken under UV light. Amplified PC products were obtained using physic nut genome as template and pair of primers (1) E612741, (2) EU586345, (3) E612739, (4) EU586340, (5) EU586343, (6) EU586344, (7) EU586346, (8) EU586347, and (9) EU

7 JUNAL LITTI VOL. 17 NO. 4, DESEMBE 2011 : M EU EU EU M EU EU Gambar 3. epresentasi elektroferogram pemisahan hasil amplifikasi PC dengan menggunakan poliakrilamid gel elektroforesis (PAGE) untuk lima aksesi tanaman jarak pagar dan dua aksesi J. multifida dengan menggunakan lima primer spesifik SS. M: Marka DNA (100 bp ladder), Aksesi tanaman: (1) J. multifida # 2, (2) J. multifida # 1, (3) J. curcas PT 26-2, (4) IP -1A-2, (5) HS 49-2, (6) SP 6-3, dan (7) IP-M-3. igure 3. epresentative of amplified PC products of five Jatropha curcas and two J. multifida accessions using five SS specific primers, and fractionated using poly acrylamide gel electrophoresis (PAGE). M: DNA marker (100 bp ladder), (1) J. multifida accession # 2, (2) J. multifida # 1, (3) J. curcas PT 26-2, (4) J. curcas IP -1A-2, (5) J. curcas HS 49-2, (6) J. curcas SP 6-3, and (7) J. curcas IP-M-3. dianalisis bersifat heterosigot (misalnya dengan pasangan alel 12), mengingat bahwa SS adalah marka ko-dominan (OBINSON et al., 2004) yang mampu membedakan individu heterosigot (12) dari yang homosigot (11 atau 22). Sebagai alternatif, kemunculan dua pita pada aksesi tanaman jarak pagar yang diuji juga dapat mengindikasikan kemungkinan adanya lebih dari satu lokus di dalam genom tanaman (duplikasi) dan masing -masing lokusnya mempunyai konstitusi alel dalam kondisi homosigot (misalnya lokus EU dengan alel 11 dan lokus EU dengan alel 22). Pembuktian terhadap dua kemungkinan ini dapat dilakukan dengan mengevaluasi segregasi pita DNA hasil amplifikasi PC dengan menggunakan primer terpilih pada populasi tanaman jarak pagar 1. Jika dua pita yang dihasilkan merupakan alternatif alel dalam satu lokus yang sama (misal lokus EU dengan pasangan alel 12), maka pada populasi tanaman jarak pagar 1 diharapkan terjadi segregasi tanaman 1 dengan konstitusi alel pada lokus EU sebagai 11 (homosigot, proporsi 25%), sebagai 12 (heterosigot, proporsi 50%) dan sebagai 22 (homosigot, proporsi 25%). Sebaliknya, jika dua pita tersebut merupakan representasi dari dua lokus (lokus EU dan lokus EU ) dan konstitusi alel untuk kedua lokus tersebut homosigot (lokus EU dengan alel 11 dan lokus EU dengan alel 22) maka semua individu 1 yang dievaluasi akan mempunyai produk amplifikasi dengan dua pita yang sama sebagaimana tetua yang digunakan untuk menghasilkan tanaman 1. Dari hasil analisis, yang dilakukan terhadap 16 individu 1 hasil persilangan dua tetua yang telah dilakukan, mengindikasikan bahwa dua pita yang sama yang muncul pada tetua juga dijumpai pada aksesi jarak pagar 1 hasil persilangan antar tetuanya. Di antara 16 individu 1 yang diuji, tidak diamati adanya segregasi antara kedua pita DNA hasil amplifikasi. Dengan demikian, kemungkinan yang ada mengindikasikan bahwa dua pita yang didapatkan dari hasil amplifikasi PC menggunakan pasangan primer spesifik PC tersebut merupakan dua lokus yang berbeda (duplikat lokus) dengan alel yang homosigot. epresentasi hasil amplifikasi PC menggunakan tujuh pasang primer dan templat empat individu 1 dapat dilihat pada Gambar 4. Berdasarkan hasil evaluasi, pasangan primer spesifik SS yang dirancang dalam penelitian ini tidak polimorfik untuk sejumlah aksesi tanaman jarak pagar yang dievaluasi. Deteksi tingkat polimorfisme yang rendah menggunakan 146

8 DAMAWAN SAPTADI et al.: Pengembangan marka simple sequence repeat untuk Jatropha spp. A B C D Gambar 4. epresentasi elektroferogram pemisahan hasil amplifikasi PC dengan menggunakan poliakrilamid gel elektroforesis (PAGE) untuk empat individu tanaman jarak pagar 1 (A-D), dengan menggunakan pasangan primer (1) EU586345, (2) EU586343, (3) E612741, (4) EU586347, (5) E612739, (6) EU586346, dan (7) EU igure 4. epresentative of amplified PC products of four 1 intra specific hybrids of Jatropha curcas (A-D) using seven SS specific primers, respectively. Amplification of SS markers were carried out using (1) EU586345, (2) EU586343, (3) E612741, (4) EU586347, (5) E612739, (6) EU586346, and (7) EU primer pairs Tabel 3. Konstitusi genetik berdasarkan hasil skoring alel marker SS yang diamplifikasi dari templat lima aksesi J. curcas dan dua aksesi J. multifida dengan menggunakan 19 pasangan primer SS yang dirancang dalam penelitian. Table 3. Genotype of five Jatropha curcas and two J. multifida accessions based on SS marker scorings. Amplification of SS marker was carried out using 19 primer pairs designed in this research. Kode Pasangan Primer Pairs of primer code Aksesi J. curcas J. curcas accessions Aksesi J. multifida J. multifida accessions IP-M-3 SP 6-3 HS 49-2 IP-1A-2 PT 26-2 # 1 # 2 EU EU EU EU EU EU E EU EU EU EU EU EU EU EU EU EU EU EU Keterangan : ( -) null alele, pasangan primer SS yang digunakan tidak menghasilkan produk amplifikasi dengan tempat DNA J. multifida. Individu dengan konstitusi genetik yang direpresentasikan oleh dua angka yang sama (contoh: 11, 22, atau 33) berarti homosigot untuk m asingmasing alel sedangkan jika dua angka yang berbeda (contoh: 12, 13, 14, 23, dan 24) diduga berarti heterosigot Note : (-) null alele, the tested SS primers produce no PC amplification product using J. multifida DNA template. Individual genotype represented by the same number (e.g. 11, 22, or 33) was homozygote for the locus and that represented by different number (e.g. 12, 13, 14, 23, and 24) was each heterozygote. 147

9 JUNAL LITTI VOL. 17 NO. 4, DESEMBE 2011 : pasangan primer yang dikembangkan dapat menjadi indikator bahwa rendahnya tingkat keragaman genetik tanaman yang diuji atau tingginya tingkat konservasi bagian genom yang digunakan untuk merancang primer. Polimorfisme yang rendah bisa terjadi sebagai akibat melakukan sampling bagian genom dengan tingkat konservasi runutan DNA yang tinggi. Akibat tingginya tingkat konservasi bagian genom yang diamplifikasi dengan primer spesifik SS, meskipun aksesi yang dievaluasi mempunyai keragaman genetik yang tinggi maka akan tetap menghasilkan produk amplifikasi yang monomorfis untuk semua aksesi jarak pagar yang dievaluasi. Salah satu keuntungan penggunaan marka SS adalah sifatnya yang diamplifikasi menggunakan templat tanaman sekerabat ( OSSETTO et al., 1999). Pasangan primer yang dirancang dalam penelitian ternyata mampu menghasilkan produk amplifikasi yang polimorfis untuk jarak pagar dengan J. multifida. Dengan demikian, pasangan primer tersebut paling tidak akan dapat digunakan untuk identifikasi hasil persilangan 1 inter-spesies antara J. curcas x J. multifida (DHILLON et al., 2009). Evaluasi lebih lanjut pemanfaatan primer spesifik SS yang telah dikembangkan untuk menganalisis lebih banyak aksesi J. curcas, aksesi J. multifida, dan aksesi Jatropha spp. lainnya masih perlu dilakukan untuk mengetahui efektivitas pemanfaatan primer spesifik SS yang telah dikembangkan. KESIMPULAN DNA jarak pagar dapat terekstraksi dengan baik menggunakan protokol CTAB yang dimodifikasi yaitu dengan penambahan konsentrasi NaCl pada buffer ekstraksi dan pada saat presipitasi. Dua puluh delapan pasang primer spesifik SS telah berhasil dirancang menggunakan aksesi DNA genomik asal jarak pagar yang ditemukan pada basis data GenBank DNA. DNA genomik asal jarak pagar dan J. multifida dapat digunakan dengan efektif sebagai templat untuk amplifikasi PC. Primer yang dirancang dalam penelitian tidak menghasilkan pita hasil amplifikasi yang polimorfik antar aksesi jarak pagar yang diuji atau antar aksesi J. multifida. Marker SS yang dihasilkan bersifat polimorfik untuk aksesi jarak pagar dengan aksesi J. multifida sehingga dapat digunakan sebagai marka untuk mendeteksi hasil persilangan 1 inter-spesies J. curcas x J. multifida. UCAPAN TEIMA KASIH Terima kasih kami sampaikan kepada Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian, Kementerian Pertanian epublik Indonesia yang telah mendanai sebagian penelitian ini melalui Proyek Kerjasama Kemitraan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi (KKP 3 T) dengan judul: Karakterisasi Morfologis dan Molekuler serta Penerapan Pemuliaan Tanaman untuk Pengembangan Kultivar Unggul Baru Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdaya Hasil Tinggi, No. kontrak 758/LB.620/I.1/3/2008 yang dikoor-dinasikan oleh Dr. Ir. Asep Setiawan, M.Sc. DATA PUSTAKA BASHA, S.D. dan M. SUJATHA Inter and intrapopulation variability of Jatropha curcas (L.) characterized by APD and ISS markers and development of population-specific SCA markers. Euphytica. 156: DHILLON,.S., M.S. HOODA, M. JATTAN, V. CHAWLA, M. BHAWAJ, and S.C. GOYAL Development and molecular characterization of interspecifis hybrids of Jatropha curcas x J. integerrima. Indian Journal of Biotechnology. 8: DIVAKAA, B.N., H.D. UPADHYAYA, S.P. WANI, and C.L. LAXMIPATHI GOWDA Biology and genetic improvement of Jatropha curcas L.: A review. Applied Energy. 87: DO, N. and.p. ADAMS A simple technique of removing plants polysaccharides contaminants from DNA. Biotechniques. 10: DOYLE, J.J. and J.L. DOYLE Isolation of plant DNA from fresh tissue. ocus. 12:13 15 AILESS, D Biofuel: The little shrub that could maybe. Nature. 449: GUEA-SANZ, J.M New SS markers of Phaseolus vulgaris from sequence databases. Plant Breeding. 123: HELLE, J Physic nut Jatropha curcas L. Promoting the conservation and use of under utilized and neglected crops. International Plant Genetic esources Institute. ome HIGGINS, D.G., J.D. THOMPSON, and T.J. GIBSON Using CLUSTAL for multiple sequence alignments. Methods Enzymol. 266: KAUSHIK, N., K. KUMA, S. KUMA, and S. OY Genetic variability and divergence studies in seed traits and oil content of Jatropha ( Jatropha curcas L.) accession. Biomass and Bioenergy. 31: MAKKA, H.P.S., K. BECKE,. SPOE, and M. WINK Studies on nutritive potential and toxic constituents of different provenances of Jatropha curcas. J. Agric. ood Chem. 45: OU, W.J., W.Q. WANG, and K.M. LI Molecular genetic diversity analysis of 120 accessions Jatropha curcas L. germplasm. Chinese Journal of Tropical Crops. 30: PAMIDIMAI, D.V.N.S., MEENAKSHI,. SAKA, G. BOICHA, and M.P. EDDY A simplified method for 148

10 DAMAWAN SAPTADI et al.: Pengembangan marka simple sequence repeat untuk Jatropha spp. extraction of high quality genomic DNA from Jatropha curcas for genetic diversity and molecular marker studies. Indian Journal of Biotechnology. 8: AKOCZY-TOJANOWSKA, M Characteristics and a comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants. Cellular & Molecular Biology Letters 9: OBINSON, A.J., C.G. LOVE, J. BATLEY, G. BAKE, and D. EDWADS Simple sequence repeat marker loci discovery using SS primer. Bioinformatics Application Note. 20(9): ÖDE, M.S., J. PLASCHKE, U. KÖNIG, A. BÖNE, M. SOELLS, S.D. TANKSLEY, and M.W. GANAL Abundance, variability, and chromosomal location of microsatellites in wheat. Mol. Gen. Genet. 246: OSSETTO, M., M. SHEPHED, G.M. CODEIO,.C.L. HAISS, L.S. LEE, and.j. HENY Cross species amplification of microsatellite loci: a valuable tool for genetic studies in plants. Paper presented to the Plant and Animal Genome VII Conference, San Diego, California, USA, January OZEN, S. and H.J. SKALETSKY Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz, S. and S. Misener (eds). Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp SAMBOOK, J., E.. ITSCH, and T. MANIATIS Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA SANWEN, H., Z. BAOXI, D. MILBOUNE, L. CADLE, Y. GUIMEI, and G. JIAZHEN Development of pepper SS markers from sequence databases. Euphytica. 117: SHAMA, A.D., P.K. GILL, and P. SINGH DNA isolation from dry and fresh samples of polysaccharides-rich plants. Plant Mol Biol ep. 20: 415 a-f. TATIKONDA, L., W.P. SUHAS, and K. SEETHA ALPbased molecular characterization of an elite germplasm collection of Jatropha curcas L. a biofuel plant. Plant Science. 176: