ABSTRAK. Oleh Elvira Hermawati NIM: (Program Studi Doktor Kimia)

Transkripsi

1 ABSTRAK ISOLASI, KARAKTERISASI DAN UJI BIOAKTIVITAS METABOLIT SEKUNDER DARI TALAROMYCES WORTMANII, XYLARIA SP., DAN PHOMOPSIS SP., JAMUR ENDOFITIK TUMBUHAN MORUS INDONESIA Oleh Elvira Hermawati NIM: (Program Studi Doktor Kimia) Tumbuhan genus Morus (Moraceae) merupakan kelompok tumbuhan yang memiliki nilai ekonomi yang tinggi dalam industri sutra dan telah dikenal sejak lama sebagai obat tradisional. Kajian fitokimia memperlihatkan bahwa kelompok tumbuhan ini potensial sebagai sumber metabolit sekunder yang memiliki bioaktivitas yang penting. Walaupun demikian, tumbuhan bukanlah satu-satunya sumber penghasil metabolit sekunder, sebagai alternatif adalah kultur jaringan dan juga mikroorganisme endofitik. Penelitian fungi endofitik tumbuhan Morus telah dilaporkan sebelumnya dari Morus alba. Penelitian tersebut telah berhasil mengisolasi dan mengidentifikasi beberapa isolat fungi endofitik dari berbagai jaringan M. alba (akar, daun, dan ranting) dan juga telah diujikan terhadap fungi patogen. Namun, belum ada laporan berkaitan dengan kajian metabolit sekunder dari fungi endofit tersebut. Berdasarkan latar belakang tersebut, maka tujuan penelitian ini adalah untuk melakukan isolasi dan karakterisasi metabolit sekunder dari fungi endofitik dua spesies Morus Indonesia (Morus cathayana dan M. macroura), serta melakukan uji bioaktivitasnya terhadap sel murin leukemia P-388 dan sel kanker paru-paru A-549. Isolasi fungi endofitik dilakukan dengan metoda kultur axenik hingga diperoleh isolat tunggal dan dilanjutkan dengan identifikasi berdasarkan molekuler sekuen ITS rdna. Isolat fungi selanjutnya dibiakan dalam media cair selama 14 hari (28 o C). Media cair hasil biakan dipartisi dengan EtOAc pada suhu kamar, sedangkan bagian miselia diekstraksi dengan MeOH. Pemurnian metabolit sekunder dilakukan dengan metoda kromatografi, yang meliputi kromatografi vakum cair, kromatografi kolom gravitasi dan kromatografi radial. Struktur senyawa hasil isolasi ditetapkan berdasarkan data spektroskopi meliputi 1D-NMR ( 1 H, 13 C, TOCSY1D) dan 2D-NMR (HSQC, HMBC, COSY dan NOESY), spektrum massa resolusi tinggi, dan kristalografi sinar-x. Sifat sitotoksik dilakukan terhadap dua sel kanker yaitu sel murin leukemia P-388 dan sel kanker paru-paru A-549 dengan metoda MTT, dengan aktivitas dinyatakan dalam konsentrasi daya hambat pertumbuhan 50% atau IC50. Pada penelitian ini untuk pertamakalinya telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi tiga isolat fungi endofitik, yaitu Talaromyces wortmanii dan Phomopsis sp. dari i

2 ranting dan akar M. cathayana, dan Xylaria sp. dari ranting M. macroura. Selanjutnya, delapan senyawa telah berhasil diperoleh dari ekstrak EtOAc Phomopsis sp., termasuk di dalamnya yaitu tiga senyawa baru turunan naftokuinon (epoksikuinofomopsin (1), epoksikuinofomopsin A (2), dan epoksikuinofomopsin B (3)), satu senyawa baru turunan seskuiterpen presilfiperfolan (presilfiperfolan-1,12-diol (4)), satu turunan benzokuinon (2- hidroksi-5-metoksi-3-metilsikloheksa-2,5-dien-1,4-dion (5)), satu turunan ftalida (5,7-dimetoksi-3,6-dimetilftalida (6)), dan dua turunan dihidroisokumarin ((+)- melein (7) dan (-)-8-metoksimelein (8)). Sementara itu, delapan senyawa telah berhasil diisolasi dari ekstrak EtOAc Xylaria sp. yang terdiri dari lima turunan sitokalasan (sitokalasin Q (9), 19,20-epoksisitokalasin Q (10), 18-deoksi-19,20- epoksisitokalasin Q (11), 19,20-epoksisitokalasin C (12), dan 19,20- epoksisitokalasin D (13)), serta tiga turunan seskuiterpen eremofilan (faseolinon (14), fomenon (15), dan faseolinon tetrol (16)). Selain itu satu turunan biantrakuinon dan satu turunan azafilonoid (skirin (17) dan wortmin (18)) telah diperoleh dari ekstrak MeOH T. wortmanii. Penentuan sifat sitotoksik ekstrak dan senyawa hasil isolasi terhadap sel P-388 menunjukkan bahwa ekstrak EtOAc dari kultur Xylaria sp., Phomopsis sp. dan T. wortmanii memperlihatkan nilai IC50 berturut-turut 0,14; 8,67 (aktif) dan 62,36 (tidak aktif) g/ml, sedangkan untuk ekstrak MeOH Xylaria sp. menunjukkan IC50 0,34 g/ml (aktif). Semua senyawa yang diujikan terhadap sel P-388 bersifat aktif, kecuali senyawa 8, 17 dan 18. Sejalan dengan aktivitas ekstraknya, maka dua naftokuinon (2 dan 3), satu turunan presilfiperfolan (4), satu turunan benzokuinon dan satu turunan ftalida (5 dan 6) dari Phomopsis sp., lima senyawa turunan sitokalasan (9-13) dan tiga turunan eremofilan (14-16) dari Xylaria sp. bersifat sangat aktif. Bahkan, senyawa 10, 12 dan 13 memiliki IC50 0,10 g/ml (IC50 < 0,19 M. Sebaliknya, turunan biantrakuinon dan turunan azafilonoid (17 dan 18) dari ekstrak MeOH T. wortmanii. Analisis hubungan struktur dan aktivitas menunjukkan bahwa adanya gugus hidroksi pada C-18 dan epoksi pada C-19 dan C-20 pada senyawa turunan sitokalasan (9-13) memiliki peran yang penting dalam peningkatan sifat sitotoksik. Sementara itu, pada turunan seskuiterpen (14-16), dengan adanya alkena terminal pada C-11 dan C-13 pada senyawa 15 dapat menurunkan aktivitas. Hasil uji sitotoksik terhadap sel kanker paru-paru A-549 juga menunjukkan bahwa semua senyawa yang diuji bersifat aktif. Dua senyawa baru (2 dan 3) memiliki IC50 secara berturut-turut 12,1 dan 6,8 M. Dengan adanya gugus hidroksi di C-1 pada senyawa 3 kemungkinan dapat meningkatkan aktivitasnya dibandingkan dengan senyawa 2. Selain itu, lima senyawa turunan sitokalasan bersifat sangat aktif dengan nilai IC50 0,32 3,15 M. Di antara semua turunan sitokalasan, senyawa 10 dan 12 adalah senyawa yang paling aktif. Aktivitas dari turunan sitokalasan ini dapat disebabkan oleh adanya ikatan rangkap pada C-5 dan C-6, gugus hidroksi pada C-18 dan gugus epoksi pada C-19 dan C-20. Senyawa 15 lebih aktif dari senyawa 14, karena senyawa 15 memiliki alkene terminal pada C- 11 dan C-13. ii

3 Berdasarkan penelitian ini, tidaka ada metabolit sekunder yang diproduksi oleh ketiga fungi endofitik yang sama dengan yang dihasilkan oleh tumbuhan inangnya (M. cathayana dan M. macroura). Metabolit sekunder yang dilaporkan dari Morus umumnya turunan stilben, flavonoid, 2-arilbenzofuran, santon, kumarin dan adduct Diels Alder. Sementara itu, ternyata dari fungi endofitiknya metabolit sekunder yang dihasilkan didominasi oleh turunan terpenoid, kuinon, dan sitokalasan. Oleh karena itu, penemuan senyawa-senyawa ini dapat memperkaya fitokimia dari fungi endofitik dari tumbuhan Morus Indonesia. Kata kunci: Morus, Fungi endofitik, Talaromyces wortmanii, Phomopsis sp, Xylaria sp. iii

4 iv

5 ABSTRACT ISOLATION, CHARACTERIZATION AND BIOACTIVITY ASSAY OF SECONDARY METABOLITES FROM TALAROMYCES WORTMANII, XYLARIA SP., AND PHOMOPSIS SP., ENDOPHYTIC FUNGI OF INDONESIAN MORUS By Elvira Hermawati NIM: (Doctoral Program in Chemistry) Morus (Moraceae) is one of the most economically valuable plants in the silk industry and has been used as traditional medicines since long time ago. Phytochemical studies on Morus plants had showed that this genus is a potential source of bioactive secondary metabolites. Nevertheless plants are not the only source of secondary metabolites. Tissue cultures and endophytic microorganisms can also be used as alternatives. The first research on the endophytic fungi of the Morus plant has been reported previously from Morus alba. This study has succesfully isolated and identified several isolates of endophytic fungi from various tissues of M. alba tissues, i.e. roots, leaves, and twig, and then examined them against pathogenic fungi. However, the secondary metabolites on those endophytic fungi have not yet been reported. Based on those backgrounds, therefore the objectives of this research were to isolate, to characterize secondary metabolites from endophytic fungi of two species of Indonesian Morus, i.e. Morus cathayana and M. macroura, and to examine the bioactivity of the extracts and isolated compounds against murine leukemia P-388 cells and lung cancer A-549 cells. The single isolate of endophytic fungi was obtained by axenic culture method and identified based on the sequence of molecular RDNA ITS. The endophytic fungi were cultured in a liquid medium for 14 days at 28 C. The liquid cultured medium was partitioned with EtOAc at room temperature, while the mycelial part was extracted with MeOH. The separation and purification of secondary metabolites have been conducted by using various chromatography techniques, such as liquid vacuum chromatography, gravitional column chromatography, and radial chromatography. The structures of isolated compounds were determined based on spectroscopic data including NMR-1D ( 1 H, 13 C, TOCSY1D), NMR-2D (HSQC, HMBC, COSY and NOESY), high resolution mass spectrometry, and X-ray crystallography. The cytotoxic properties were performed against two cancer cells, namely murine leukemia P-388 cells and lung cancer A-549 cells following the MTT method and the activity is expressed in 50% growth inhibitory concentration or IC50. v

6 This research for the first time has successfully isolated and identified three isolates of endophytic fungi, i.e. Talaromyces wortmanii and Phomopsis sp. from twigs and roots of M. cathayana, and Xylaria sp. from twig of M. macroura. Moreover, eight compounds have been yielded from EtOAc extract of Phomopsis sp. including three novel naphthoquinone derivatives (epoxyquinophomopsin (1), epoxyquinophomopsin A (2), and epoxyquinophomopsin B (3)), a new sesquiterpene, i.e. presilphiperfolan derivative (presilphiperfolan-1,12-diol (4)), one benzoquinone derivative (2-hydroxy-5-methoxy-3-methylcyclohexa-2,5-dien- 1,4-dion (5)), one phthalide derivative (5,7-dimethoxy-3,6-dimethylphthalide (6)), and two dihydroisocoumarin derivatives (mellein (7) and 8-methoxymellein (8)). Likewise, eight compounds have also been isolated from EtOAc extract of Xylaria sp. consisting of five cytochalasan derivatives (cytochalasin Q (9), 19,20- epoxycytochalasin Q (10), 18-deoxy epoxycytochalasin Q (11), 19,20- epoxycytochalasin C (12), and epoxycytochalasin D (13)), as well as three eremophilane derivatives (phaseolinone (14), phomenon (15), and phaseolinone tetrol (16)). In addition, one bianthraquinone derivative (skirin (17)) and one azaphilonoid derivative (wortmin (18)) have also been obtained from MeOH extract of T. wortmanii. Furthermore, the cytotoxic properties of extracts and isolated compounds against P-388 cells showed that the EtOAc extracts of media of Xylaria sp., Phomopsis sp. and T. wortmanii showed IC50 values of 0.14, 8.67 (active) and μg/ml (not active), respectively. Whereas, the MeOH extracts of mycelia of Xylaria sp., Phomopsis sp. and T. wortmanii showed IC (active), >100, >100 g/ml (not active), respectively. All of the compounds examined against P-388 cell were active, except compound 8, 17 and 18. In line with the activity of extracts, two naphtoquinone (2 and 3), one presilphiperfolan derivative (4), one benzoquinone derivative and one phtalide derivative (5 and 6) from Phomopsis sp., five cytochalasan derivatives (9-13) and three eremophilane derivatives (14-16) from Xylaria sp. were very active. Even, compound 10, 12 and 13 had IC50 < 0.10 g/ml (IC50 < 0.19 M). On the other hand, a bianthraquinone derivative and an azaphilonoid derivative (17-18) from MeOH extract T. wortmanii were not active and this result was in accordance with the IC50 of their extract. The analysis of structure activity relationship showed that the presence of a hydroxy group at C- 18 and an epoxy group at C-19 and C-20 in cyctochalasan derivatives (9-13) could play an important role in enhancing cytotoxic properties. While, in sesquiterpenes derivatives (14-16), the presence of terminal alkene at C-11 C- 13 in compound 15 can decrease the activity. Moreover, the cytotoxicity assay against lung cancer A-549 cells also showed that all the examined compounds were active. The two new compounds (2 and 3) had IC50 values at 12.1 and 6.8 M, respectively. The presence of a hydroxy group at C-1 in the compound 3 probably increased the activity of the compound compared to 2. In addition, five cytochalasan compounds were very active with IC50 values of M. Among cytochalasan derivatives, compounds 10 and 12 were the most active. The activity of cytochalasan derivatives could be caused by the presence of a doublebond at C-5 and C-6, a hydroxy group at C-18, and an epoxy vi

7 at C-19 and C-20. Compound 15 was more active than compound 14, because compound 15 has a terminal alkene at C-11 C-13. According to this research, no secondary metabolites produced by the three endophytic fungi were same with compounds from the host plant (M. cathayana and M. macroura). The secondary metabolites isolated from Morus are usually stilbenes, 2-arylbenzofurans, xanthones, coumarins, and adduct Diels Alders, while its endophytic fungi in fact dominantly produced terpenoids, quinones, and cytochalasan derivatives. Therefore, the discovery of these compounds can enrich the phytochemistry of endophytic fungi from Indonesian Morus plant. Keywords: Morus, Endophytic fungi, Talaromyces wortmanii, Phomopsis sp, Xylaria sp. vii