UJI TOKSISITAS FRAKSI DARI SPONGS LAUT Xestospongia DENGAN METODE BRINE SHRIMP TEST (BST)

Transkripsi

1 UJI TOKSISITAS FRAKSI DARI SPONGS LAUT Xestospongia DENGAN METODE BRINE SHRIMP TEST (BST) Oleh: FRANSISCHA GALUH KARTIKASARI Dosen Pembimbing: Awik Puji Dyah Nurhayati S.Si, M.Si Drs. Agus Wahyudi M.S

2 LATAR BELAKANG keanekaragaman hayati laut Indonesia melimpah Spons Genus Xestospongia metabolit sekunder mempertahankan diri dari predator memiliki aktivitas farmakologis Alkaloid, polycyclic Quinones dan hydroquinones, derivate polyacetylenic, aminoalkohol, dan sterol (aragusterol) (Laurent et al,2006), oxaquinoleridinesl, β- Carbdine, terpenoid, laktones (Kondracki et al,1992) dapat dipisahkan melalui metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Fraksi-fraksi Uji pendahuluan antikanker Menggunakan Artemia salina Diuji ketoksikannya dengan metode Brine Shrimp Test (BST)

3 Permasalahan Menguji toksisitas dari fraksi yang didapat dari ekstrak Xestospongia dengan metode Brine Shrimp Test (BST) Batasan masalah Batasan masalah dalam penelitian ini antara lain: 1. menguji secara kualitatif senyawa Xestospongia 2. menguji toksisitas dari fraksi dari hasil KLT pada Xestospongia Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini antara lain: 1. untuk mengetahui jenis senyawa dari Xestospongia secara kualitatif 2. untuk mengetahui toksisitas dari fraksi Xestospongia dengan menggunakan metode Brine Shrimp Test (BST)

4 Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai pengembangan alternatif pengobatan antikanker dengan menggunakan produk dari spons laut.

5 METODOLOGI Waktu Dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan April-Juli 20. Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Kromatografi lapis Tipis Preparatif (KLTP) dilakukan di labolatorium Kimia Sintesis Fakultas Farmasi UNAIR, Uji kualitatif dilakukan dilabolatorium Farmakognosis Fakultas Farmasi UNAIR dan uji Brine Shrimp Test (BST) dilakukan di Labolatorium Zoologi Biologi ITS.

6 1. Isolasi Senyawa Bioaktif Cara Kerja Ekstrak kasar Xestospongia dari labolatorium zoologi biologi ITS yang telah kering diambil 1 gr dilarutkan etanol ±2 ml Larutan ekstrak dalam etanol, ditotolkan pada pelat KLT menggunakan pipa kapiler dengan jarak ± 1 cm dari dasar Setelah totolan kering,lempengan dimasukkan ke dalam bejana dan dielusi hingga jarak ± 1 cm dari tepi atas dengan fase gerak yang sesuai kemudian di deteksi dengan sinar UV 254 nm dan UV 365 nm

7 2. Uji Kualitatif senyawa yang terpisahkan. disemprot dengan anisaldehid, uap amoniak, besi (III) klorida, Lieberman-Buchard dan Dragendorff. Dihitung nilai Rf (Retardation Factor) dengan menggunakan rumus: Rf = Jarak yang ditempuh substansi Jarak yang ditempuh oleh pelarut

8 3. Isolasi Senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Ekstrak Xestospongia sp. yang dilarutkan dalam ethanol ditotolkan pada Plat KLTP berupa garis lurus menggunakan pipa kapiler dengan jarak ± 2 cm dari dasar dielusi dengan fase gerak yang didapat dari Kromatografi lapis Tipis (KLT) hingga jarak ± 2 cm dari tepi atas Senyawa yang berupa fraksi dikerok dengan menggunakan spatula berdasarkan nilai Rf yang didapat dari KLT Hasil berupa fraksi Hasil penyaringan dikeringkan dalam aerator dilarutkan dalam etanol dan disaring dengen kertas saring

9 2. Uji Toksisitas Fraksi yang didapat dari hasil Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) ditimbang dibuat dalam konsentrasi 00 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 0 ppm, ppm dan 0 ppm (kontrol) kontrol 00 ppm 500 ppm 250 ppm 0 ppm ppm 50 ml+50 ml 25 ml+75 ml ml+90 ml 1 ml+99 ml

10 Telur Artemia salina ditetaskan dalam wadah yang berisi 500 ml air laut dengan kepadatan 5 g/l diaerasi selama 48 jam Telur menetas dalam jangka waktu jam Setelah menetas, diberi pakan berupa ragi dengan konsentrasi 3 mg dalam 5 ml air laut sebanyak 1 tetes Larva umur 48 jam Digunakan dalam uji BST

11 3. Uji Brine Shrimp Test (BST) Pada fraksi hasil Kromatografi lapis Tipis (KLT) kontrol 00 ppm 500 ppm 250 ppm 0 ppm ppm diambil 1 ml diambil 1 ml diambil 1 ml diambil 1 ml diambil 1 ml diambil 1 ml 5 ml air laut 5 ml air laut 5 ml air laut 5 ml air laut 5 ml air laut 5 ml air laut

12 masing-masing tabung reaksi dimasukkan ekor larva Artemia salina umur 48 jam diamati jumlah Artemia salina yang mati dengan kaca pembesar selama 24 jam dilakukan 3 kali ulangan dihitung % kematian

13 Bila pada kontrol tidak ada larva yang mati Bila pada kontrol ada larva yang mati Rumus yang digunakan: Jumlah Larva yang mati %Kematian = x 0% Jumlah hewan yang diuji (Meyer et al.,1982) Rumus yang digunakan: Jumlah larva yang mati jumlah larva yang mati pada kontrol %kematian = x 0% Jumlah Hewan uji (Meyer et al.,1982) ditentukan besarnya LC 50 yang dihitung dengan analisis probit menggunakan MINITAB hasil

14 Rancangan Penelitian dan Analisis Data Penelitian menggunakan rancangan eksploratif dengan memberi perlakuan konsentrasi ekstrak spons sebesar 00 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 0 ppm, ppm dan 0 ppm sebagai kontrol. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Data Hasil Tabel Analisa Kualitatif Jenis Senyawa Jenis Senyawa Warna terpenoid Merah atau ungu steroid biru fenolik biru ungu flavonoid warna jingga sampai merah alkaloid orange sampai merah bata

15 Analisa Data Persentase kematian A. salina kemudian dilakukan analisis probit untuk mengetahui nilai LC 50. Analisis probit menggunakan program MINITAB. Suatu ekstrak dianggap memiliki aktivitas toksik dan berpotensi untuk diteliti lebih lanjut jika harga LC 50 < 00 ppm (Meyer et al.,1982).

16 Hasil Dan pembahasan Hasil KLT diperoleh spot fraksi sebanyak 4, dengan pelarut kloroform dan aseton (5:1) (v/v) Kloroform memiliki tingkat kepolaran yang lebih rendah dari pada aseton sehingga gabungan keduanya menghasilkan kepolaran yang berbeda Kepolaran yang dihasilkan dari gabungan kedua pelarut rendah sehingga senyawa yang dapat larut pada pelarut tersebut juga memiliki tingkat kepolaran yang rendah Plat KLT yang telah dielusi dengan pelarut kloroform dan aceton (5:1) (v/v) berpendar ketika diamati dengan UV pada panjang gelombang 254 nm memiliki energi relatif lebih kuat daripada 365 nm

17 Hasil pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Fraksi 4 Fraksi 3 Fraksi 2 Fraksi 1 Spot noda (fraksi) berpendar pada panjang gelombang 254 nm Spot noda (fraksi) tidak berpendar pada panjang gelombang 365 nm

18 Hasil pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Jenis senyawa pada spot fraksi yang telah diperoleh adalah senyawa terpenoid yang ditandai dengan adanya warna ungu setelah dilakukan penyemprotan dengan reagen anisaldehid (Tabel 4.1). Tabel 4.1. Hasil kualitatif jenis senyawa Jenis Senyawa Warna Hasil Uji terpenoid Merah atau ungu + steroid biru - fenolik biru ungu - flavonoid warna jingga sampai merah - alkaloid orange sampai merah bata -

19 Hasil pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Hasil penyemprotan dengan Liberman Buchart Hasil penyemprotan dengan Dragendroff Hasil penyemprotan dengan anisaldehid Hasil penyemprotan dengan besi (III) klorida Hasil penyemprotan dengan uap amonia

20 Hasil pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Dari harga Rf yang di dapat dari KLT yaitu ½ Nilai Rf yang didapat dari KLT sama dengan Nilai Rf pada Kromatografi lapis Tipis preparatif (KLTP) yang digunakan untuk mengambil senyawa pada KLTP Rf menunjukkan perjalanan senyawa yang dipisahkan relative terhadap perjalanan pelarut

21 Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST) Hasil uji toksisitas fraksi spons laut Xestospongia menujukkan % kematian terhadap larva Artemia salina yang ditunjukkan dalam Tabel 4.2 Tabel 4.2. Hasil Uji Brine Shrimp Test (BST) untuk fraksi yang didapat dari Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Konsentrasi Pengulangan Jumlah larva Artemia yang diuji Jumlah Larva Artemia yang Mati jumlah rata-rata % kematian

22 Percent Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST) Probability Plot for Jumlah Larva Artemia yang Mati Normal - 95% CI Probit Data - ML Estimates Table of Statistics Mean StDev Median IQ R Konsentrasi Grafik 4.1 Probability plot untuk jumlah larva Artemia yang mati

23 Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST) Larva Artemia yang mati pada kontrol larva pada kondisi yang lemah tidak dapat beradaptasi saat dipindahkan dari media air laut dari tempat penetasan ke dalam media air laut di botol ampul. Larva Artemia yang mati pada kontrol mengalami penurunan aktivitas. Semakin lama, Artemia dalam kontrol semakin lemah dan terus berada di dasar tabung. Larva Artemia dengan perlakuan fraksi (ppm) gerak (gerakannya tidak teratur) mengalami disorientasi Semakin tinggi nilai konsentrasi fraksi ekstrak semakin tinggi (Tabel 4.1) mortalitas Artemia juga Harbourne (1994) semakin tinggi konsentrasi ekstrak, maka sifat toksiknya akan semakin tinggi.

24 Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST) Dari hasil perhitungan Analisa Probit dengan menggunakan MINITAB, didapat nilai LC 50 pada ekstrak fraksi Xestospongia ini adalah ppm. Meyer (1982) suatu ekstrak bersifat toksik bila nilai LC ppm sehingga ekstrak dari fraksi Xestospongia dapat dikatakan toksik. Terpenoid bersifat toksik struktur lipofilik menyebabkan kematian sel. pada sebagian besar komponen terpenoid memiliki menyebabkan kerusakan membran sel sehingga

25 Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST) Sifat nonpolar terpenoid mudah menembus membran sel atau membran organel dalam sel pada sisi hidrofobik membentuk struktur misel terbentuknya ikatan antara senyawa nonpolar (terpenoid) dengan bagian nonpolar dari membran sel menyebabkan permeabilitas membran sel terganggu. Terpenoid memiliki efek sinergis bagi toksin lain dengan bertindak sebagai solven untuk memfasilitasi toksin bergerak melalui membran (Dudareva dan Gershenzon, 2007 dalam Imaria,2008).

26 Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST) Terpenoid merusak DNA merusak ikatan dalam DNA menjadi DNA Single-strand dan dapat menghambat proses mitosis sel (Sladić dan Gašić, 2006) Senyawa bioaktif sebagai zat toksik dapat masuk melalui membran sel larva Artemia (secara difusi), membran sel : untuk mengatur perpindahan zat ke dalam dan keluar sel pada organela sel Senyawa toksik masuk menyebabkan terjadinya perusakan atau modifikasi permeabilitas membrane dan mengacaukan system perpindahan zat dengan cara turut campur dalam pembawa dan produksi ATP mengganggu proses biokimiawi dan fisiologi (Connell dan Miller,1995)

27 Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST) Masuknya zat toksik melalui saluran pencernaan Artemia bersifat penyaring tidak selektif (non selective filter feeder) sehingga apa saja yang dapat masuk mulut artemia seakan-akan menjadi makanannya (Isnansetyo dan Kurniastuty,1995 dalam Widyastuti,2005) Senyawa yang masuk dapat berinteraksi dengan target (misalnya enzim,lemak, membran sel, asam nukleat) mempengaruhi mekanisme tubuh yang akhirnya dapat menyebabkan kematian (Connell dan Miller,1995)

28 Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode Brine Shrimp Test (BST) Masuknya senyawa toksik melalui pernafasan saat pertukaran gas melewati permukaan permeable pada bagian tengah tempat keluarnya di thoraciz appendages Metabolisme sekunder yang bersifat polar relatif lebih toksik daripada yang bersifat non polar (Nurhayati et al.,2006) Senyawa metabolit sekunder yang bersifat polar flavonoid alkaloid dan Senyawa yang bersifat non polar dalam Nurhayati et al.,2006) terpenoid dan steroid (Sastroamidjojo

29 Kesimpulan dan Saran Kesimpulan Hasil dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa hasil kualitatif pada Rf ½ merupakan terpenoid. Fraksi tersebut mempunyai nilai LC 50 sebesar ppm Saran Perlu diadakan penelitian terhadap sel kanker untuk mengetahui potensi senyawa tersebut sebagai anti kanker

30