HASIL DAN PEMBAHASAN. Gambar 3 Perubahan konsentrasi fase gerak metanol pada metode gradien KCKT ekstrak etanol 70% S. arvensis Solo.

Transkripsi

1 Sebanyak 1 ekor larva A. salina dimasukkan ke dalam vial yang berisi air laut. Setelah itu, masing-masing vial ditambahkan larutan ekstrak (metanol 7% dan etanol 7%) dari ekstrak S. arvensis dan C. roseus, sehingga konsentrasi akhirnya menjadi 1, 5, 1, dan 1 ppm. Kemudian, campuran didiamkan selama 24 jam. Jumlah larva yang mati dihitung dengan bantuan kaca pembesar. Persen mortalitas kuantitatif diolah untuk memperoleh konsentrasi letal 5% (LC 5 ) dengan selang kepercayaan 95%. Uji statistik dilakukan dengan uji Duncan. Pencarian Eluen Terbaik Analisis eluen terbaik dilakukan dengan menggunakan pelat KLT. Pelat KLT GF 254 digunakan sebagai fase diam. Berbagai eluen yang memiliki tingkat kepolaran berbeda-beda diujikan, yaitu kloroform, metanol, asam asetat, etil asetat, dan butanol. Noda pemisahan dideteksi di bawah lampu ultraviolet (UV) 254 dan 366 nm. Eluen campuran yang lazim digunakan untuk deteksi senyawaan flavonoid juga diujikan, antara lain klorofom-metanol (96:4), etil asetat-asam asetat-air (6:1:1), kloroform-metanol-air (65:45:12), dan butanol-asam asetat-air (4:1:5) (Markham 1988). Preparasi KLT Berbagai larutan ekstrak tempuyung dan tapak dara diaplikasikan pada pelat KLT dengan alat Linomat IV menggunakan pengaturan lebar pita 5 mm, ukuran pelat 1 cm 1 cm, dan laju alir 5 μl/det. Posisi mulai 1 mm dari dasar pelat dan 1 mm dari kedua sisi pelat. Pelat dielusi dengan eluen terbaik yang sebelumnya telah dijenuhkan dalam bejana kromatografi ukuran sedang 2 cm 2 cm. Identifikasi senyawa golongan flavonoid dilakukan dengan mengamati warna flouresens di bawah sinar UV pada 254 dan 366 nm, sebelum dan sesudah penambahan uap amonia terhadap bercak isolat yang diperoleh. Profil KCKT Tempuyung Analisis kualitatif untuk ekstrak tempuyung paling aktif dilakukan dengan KCKT merek Shimadzu LC-2A yang dihubungkan dengan kolom nukleosil C 18 (15 mm 4,6 mm i.d: ukuran partikel 5 μm). Fase gerak yang digunakan berupa campuran metanol dan asam asetat.1% (v/v) secara gradien. Metode gradien yang digunakan dapat dilihat pada Gambar 3. Kecepatan aliran 1 ml/menit. Panjang gelombang UV yang digunakan untuk mendeteksi senyawa yang terdapat dalam ekstrak S. arvensis adalah 36, 35, dan 662 nm. Sebelum analisis dilakukan, fase gerak dan larutan sampel disaring terlebih dahulu. Gambar 3 Perubahan konsentrasi fase gerak metanol pada metode gradien KCKT ekstrak etanol 7% S. arvensis Solo. HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi Pelarut merupakan salah satu faktor penting dalam menghasilkan mutu ekstrak yang baik (Vijesekera 1991). Pelarut yang dipilih adalah yang memiliki daya larut tinggi, tidak berbahaya, dan tidak beracun. Menurut Depkes RI (1996), pelarut yang dipilih harus menguntungkan, artinya dalam jumlah sedikit sudah dapat melarutkan zat aktif suatu bahan. Selain itu, waktu menguapkan pelarut harus singkat sehingga kemungkinan terjadinya kerusakan zat aktif yang tidak tahan panas dapat diperkecil. Kirk dan Othmer (1951) menyatakan bahwa pelarut yang digunakan juga harus selektif terhadap bahan aktif yang diinginkan. Berdasarkan kriteria pemilihan pelarut tersebut, pelarut metanol 7% dan etanol 7% dipilih untuk mengekstraksi tempuyung (S. arvensis) dan tapak dara (C. roseus) untuk mendapatkan mutu ekstrak yang baik. Pemilihan pelarut metanol 7% dan etanol 7% selain berdasarkan kriteria pelarut yang baik, juga mengacu pada metode Suwandi (28). Metode ini menitikberatkan kepada sifat polar metanol 7% dan etanol 7% dalam mengekstraksi senyawa flavonoid yang umumnya bersifat polar. Dengan demikian, diharapkan banyak senyawa flavonoid dapat terekstraksi. Selain itu, kedua pelarut baik untuk ekstraksi pendahuluan, karena memiliki gugus hidroksil polar dan gugus alkil nonpolar. Dengan adanya perbedaan tingkat kepolaran ini, diharapkan semua senyawa 5

2 bioaktif dalam S. arvensis dan C. roseus akan terekstraksi dengan baik ke dalam pelarut metanol 7% dan etanol 7%. Analisis rendemen ekstrak digunakan untuk mengetahui persentase ekstrak yang dihasilkan dari setiap gram daun segar yang diambil dari simplisia S. arvensis dan C. roseus. Kisaran rendemen ekstrak metanol 7% S. arvensis yang diperoleh berkisar 3 6%, sedangkan rendemen ekstrak etanol 7% berkisar 3 7%. Lebih tingginya rendemen ekstrak metanol 7% dapat disebabkan oleh sifat kepolaran metanol 7% yang lebih tinggi daripada etanol 7%, sehingga dapat lebih banyak mengekstrasi aglikon flavonoid yang bersifat polar (Harwood dan Moody 1989). Data terperinci S. arvensis dan C. roseus ditunjukkan pada Tabel 1. Tabel 1 Rendemen ekstrak S. arvensis dan C. roseus Rerata rendemen Ekstrak Sampel (%b/b) ± SD Tempuyung Bogor I Bogor II Bogor III Solo Wonogiri Tapak dara Bogor I Keterangan: Kadar air (%) 9.53 ±.1 b 1.64 ±.1 d 9.27 ±.23 b 8.25 ±.8 a 9.59 ±.1 b 9.59 ±.1 bc MeOH 7% 5.78 ±.2 cd 6.48 ±.2 d 6.11 ±.1 bc 5.48 ±.7 b 3.44 ±.38 a 1.25 ±.7 e EtOH 7% 7.8 ±.24 e 6.27 ±.2 d 5.56 ±.1 c 4.36 ±.6 b 3.22 ±.24 a ±.11 f Angka yang diikuti oleh huruf kecil yang berbeda pada lajur yang sama menunjukkan hasil yang berbeda nyata dengan uji Duncan pada taraf kepercayaan 95%. Tabel 1 menunjukkan bahwa tiap-tiap daerah asal sampel tanaman, baik S. arvensis maupun C. roseus, memberikan rendemen yang berbeda nyata. Perbedaan terlihat dari perbedaan huruf yang tertera pada tabel. Sebagai contoh, rendemen ekstrak metanol 7% dari S. arvensis Wonogiri (3.44 ±.38 a ) berbeda nyata dengan rendemen S. arvensis Solo (5.48 ±.7 b ). Perbedaan dapat disebabkan oleh adanya perbedaan struktur geografis, seperti suhu, tinggi permukaan tanah, dan curah hujan (Ubaidillah 21). Perbedaan dapat pula disebabkan oleh perbedaan senyawa bioaktif yang terkandung di dalamnya. Berdasarkan hal itu, dapat dikatakan bahwa asal tanaman juga berpengaruh nyata terhadap rendemen yang dihasilkan. Uji Fitokimia Berdasarkan uji fitokimia, diketahui bahwa S. arvensis (Solo) positif mengandung flavonoid, sedangkan C. roseus (PSB) positif mengandung alkaloid (Tabel 2). C. roseus juga positif mengandung flavonoid, tetapi dengan intensitas warna yang lebih lemah. Hal ini diduga karena kandungan senyawa flavonoid dalam S. arvensis lebih banyak. Perbedaan juga dapat disebabkan oleh perbedaan jenis flavonoid yang terkandung di dalam tanaman. Tabel 2 Uji fitokimia serbuk tanaman S. arvensis (Solo) dan C. roseus (PSB) Uji Fitokimia Hasil Uji Tempuyung Tapak Dara Alkaloid - ++ Saponin + + Flavonoid ++ + Triterpenoid + - Steroid + - Tanin + + Keterangan: Tanda (+) menunjukkan tingkat intensitas warna Tanda (-) menunjukkan tidak ada senyawa uji Penapisan fitokimia adalah pemeriksaan kimia secara kualitatif terhadap senyawa organik bioaktif yang terdapat dalam simplisia tumbuhan seperti alkaloid, flavonoid, terpenoid, tanin, dan steroid (Markham 1988). Dalam penelitian ini, pemeriksaan fitokimia dapat membantu langkah-langkah fitofarmakologi, yaitu membantu mengetahui ada tidaknya senyawa flavonoid di dalam S. arvensis yang dapat dikaitkan dengan aktivitas biologisnya sebagai antikanker melalui toksisitasnya terhadap A. salina. Uji Golongan Flavonoid Flavonoid merupakan golongan fenolik yang dapat menyerap di daerah sinar UV pendek. Sinar UV akan membantu penampakan bercak pada pelat gel silika. Oleh karena itu, penampakan bercak senyawa flavonoid ekstrak S. arvensis pada KLT 6

3 dilakukan pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Flavonoid diduga merupakan senyawa bioaktif utama pada ekstrak S. arvensis yang berperan sebagai antikanker. Senyawa flavonoid pada umumnya adalah senyawa fenolik, yang umumnya akan berubah warna apabila ditambah basa. Oleh karena itu, penambahan basa berupa uap amoniak berfungsi memperjelas penampakan bercak yang ditandai dengan adanya perubahan warna. Perubahan warna tersebut merupakan ciri khas suatu flavonoid tertentu. Perubahan warna antara golongan flavonoid satu dan lainnya akan berbeda. Uji golongan flavonoid terhadap ekstrak etanol 7% S. arvensis Solo memperlihatkan golongan flavon dengan nilai R f.15;.25; dan.5. Selain itu, terdapat juga golongan kalkon dengan nilai R f.15 dan.25. Data terperinci golongan flavonoid dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Tanpa uap NH 3 gelap Penafsiran golongan flavonoid ekstrak S. arvensis Solo etanol 7% (Markham 1988) Warna pita (+) Uap NH 3 gelap Dugaan Flavon Flavonol isoflavon Kalkon Hitam Hitam Flavon, kalkon flavonol Langit Langit Flavon Flavonol Nilai Rf ekstrak MeOH EtOH 7% 7% Hasil uji golongan flavonoid memperkuat hasil uji sebelumnya (Akbar 21), yang dilakukan dengan penambahan berbagai pereaksi. Berdasarkan kedua hasil uji tersebut, dapat dikatakan bahwa senyawa bioaktif utama pada S. arvensis, khususnya ekstrak etanol 7% S. arvensis Solo adalah flavonoid, yakni golongan flavon dan flavonol sebagai golongan flavonoid mayor, dan kalkon sebagai golongan flavonoid minor. Uji Toksisitas Larva Udang Uji letalitas larva udang (BSLT) dapat digunakan untuk menduga aktivits suatu bahan uji dalam membunuh sel kanker, hama penyakit, atau menduga efek farmakologinya. Pada penelitian ini, uji BSLT bertujuan mengetahui efek farmakologi ekstrak S. arvensis dan C. roseus berdasarkan toksisitasnya terhadap hewan uji A. salina. Toksisitas ekstrak tersebut dilihat dari kemampuannya dalam membunuh 5% hewan uji (LC 5 ) dengan tingkat kepercayaan 95% (Rahman 1991). Dalam uji toksisitas ekstrak S. arvensis dan C. roseus, digunakan kontrol negatif yang berfungsi menguji pengaruh pelarut metanol 7% dan etanol 7%. Kontrol diharapkan tidak membunuh A. salina. Walaupun demikian, dalam percobaan terdapat beberapa A. salina yang mati. Kematian A. salina pada kontrol negatif diduga diakibatkan penurunan aktivitas A.. salina. Hal ini ditandai dengan pergerakan A. salina yang terus-menerus berada di dasar tabung percobaan. Dengan demikian, kematian A. salina pada kontrol negatif merupakan kematian yang alami. Kematian A. salina pada kontrol negatif berbeda dari kematian A. salina yang diberi perlakuan. Penambahan ekstrak S. arvensis dan C. roseus mengakibatkan A. salina mengalami disorientasi gerak (pergerakannya tidak teratur). A. salina tetap berputar-putar pada satu titik, dan pada akhirnya mengalami kematian. Kematian tersebut diduga diakibatkan oleh senyawa bioaktif yang terkandung dalam S. arvensis (flavonoid) dan C. roseus (alkaloid). Meyer (1982) dan Anderson (1991) melaporkan bahwa suatu ekstrak menunjukkan aktivitas ketoksikan dalam uji BSLT jika dapat mematikan 5% hewan uji pada konsentrasi 1 ppm. Ekstrak dikatakan sangat toksik bila memiliki nilai LC 5 di bawah 3 ppm dan dianggap tidak toksik apabila nilai LC 5 di atas 1 ppm. Karena itu, dapat dikatakan ekstrak metanol 7% S. arvensis dari Bogor I ( ppm), Bogor II (11.51 ppm), Bogor III ( ppm), dan Wonogiri (12.89 ppm) tidak toksik. Nilai LC 5 selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 menunjukkan bahwa ekstrak S. arvensis Solo memiliki toksisitas lebih tinggi di antara ekstrak S. arvensis lainnya, baik ekstrak metanol 7% maupun etanol 7%. Ekstrak etanol 7% ( ppm) lebih toksik daripada ekstrak metanol 7% ( ppm). Semakin rendah nilai LC 5 suatu ekstrak, semakin rendah konsentrasi ekstrak yang diperlukan untuk dapat menyebabkan kematian A. salina sebagai hewan uji. Dengan 7

4 kata lain, ekstrak tersebut semakin toksik (Meyer et al. 1982). Tabel 4 Nilai rerata LC 5 ekstrak metanol 7% dan etanol 7% pada S. arvensis dan C. roseus Ekstrak Metanol 7% Tempuyung Bogor I ± 8.8 f Bogor II ± 9.77 c Bogor III ± e Solo ± 2.63 b Wonogiri ±.14 cd Tapak dara Bogor I ± 4.36 a Keterangan: LC 5 (ppm) Etanol 7% 41.7 ± 3.89 d ± 5.5 f ± 3.31 e ± 4.94 b ± 9.97 c ± 3.53 a Angka yang diikuti oleh huruf kecil yang berbeda pada lajur yang sama menunjukkan hasil yang berbeda nyata dengan uji Duncan pada taraf kepercayaan 95% Toksisitas ekstrak etanol 7% S. arvensis Solo diduga berasal dari adanya senyawa flavonoid golongan flavon, flavonon, dan kalkon sebagaimana diperlihatkan oleh hasil uji golongan flavonoid. Golongan-golongan tersebut diduga kuat merupakan senyawa bioaktif utama yang berperan sebagai antikanker. Flavon, flavonol, kalkon, dan isoflavon dalam ekstrak S. arvensis merupakan aglikon flavonoid yang kurang polar, disebabkan oleh adanya gugus metoksil (Harborne 1987). Gugus metoksil lebih larut dalam pelarut yang kurang polar. Dengan demikian, aglikon flavonoid dalam ekstrak S. arvensis akan lebih larut dalam pelarut etanol 7%. Hal ini dapat menyebabkan toksisitas ekstrak etanol 7% lebih tinggi daripada metanol 7%. Tanaman C. roseus pada umumnya dikenal dalam pengobatan tradisional dalam menurunkan kadar glukosa dalam darah. Namun, pada pemeriksaan selanjutnya, C. roseus terbukti menunjukkan aktivitas sebagai antikanker (Lingga 25). Zat aktif dalam C. roseus yang berfungsi sebagai antikanker adalah golongan alkaloid seperti vinblastin, vinkristin, dan katarantin (Foye 1995). Berdasarkan hal tersebut, C. roseus dijadikan sebagai tanaman pembanding toksisitas S. arvensis dalam hal potensinya sebagai antikanker. Toksisitas ekstrak etanol 7% S. arvensis ( ppm) lebih rendah daripada C. roseus (31.34 ppm). Hasil uji beda nyata Duncan memperlihatkan bahwa nilai LC 5 kedua ekstrak tersebut berbeda secara signifikan. Walaupun berbeda, berdasarkan Meyer et al. (1982) dan Anderson (1991), S arvensis berpotensi sebagai antikanker. Nilai LC 5 ekstrak etanol 7% S. arvensis Solo ( ppm) lebih tinggi dibandingkan dengan beberapa ekstrak tanaman obat lain, seperti ekstrak daun kamanggi ( ppm, Mukhtar et al. 27), dan daun saga (66.74 ppm, Juniarti et al. 21). Nilai LC 5 tersebut juga lebih tinggi daripada ekstrak Turbinari decurrens ( ppm, Fajarningsih et al 28). Ekstrak T. decurrens telah terbukti memiliki sitotoksisitas terhadap sel tumor HeLa. Oleh sebab itu, ekstrak etanol 7% S. arvensis Solo sangat prospektif dikembangkan sebagai senyawa antitumor. Profil Ekstrak Tempuyung dengan KCKT Analisis profil ekstrak S. arvensis dilakukan dengan menggunakan KCKT. Analisis dilakukan terhadap ekstrak etanol 7% S. arvensis Solo, karena ekstrak tersebut memiliki tingkat toksisitas tertinggi. Dengan tingkat toksisitas tertinggi tersebut, diharapkan profil yang diperoleh lebih representatif. Fase gerak dipilih berdasarkan hasil uji golongan flavonoid yang menunjukkan komponen ekstrak etanol 7% S. arvensis Solo sedikit terbawa pada fase gerak. Hal itu menandakan bahwa ekstrak tersebut bersifat polar. Dengan demikian, analisis ekstrak etanol 7% S. arvensis Solo pada KCKT menggunakan fase terbalik: fase diam lebih nonpolar daripada fase gerak, maka digunakan pelarut dengan kepolaran yang tinggi. Pelarut yang digunakan pada penelitian ini antara lain asetonitril, metanol, dan campuran metanolasam asetat.1% (v/v) dalam air. Analisis profil pada awalnya menggunakan fase gerak asetonitril dan metanol secara isokratik. Kedua pelarut tersebut tidak menghasilkan profil yang baik, tidak terdapat puncak pada kromatogramnya (Lampiran 3). Hal ini dapat diakibatkan fase gerak kurang bersifat polar, sehingga kurang dapat membawa komponen senyawa. Selanjutnya, analisis dilakukan dengan fase gerak campuran metanol-asam asetat.1% (v/v). Analisis profil KCKT berdasarkan pada jumlah puncak yang terlihat dalam kromatogram. Jumlah puncak yang 8

5 dapat dideteksi dihitung berdasarkan kriteria nilai resolusi dan nisbah sinyal terhadap derau (S/N). Puncak diakui dan dihitung jika memiliki nilai resolusi 3 (Wahyuni 21). Analisis kromatogram pada panjang gelombang 35 (a), 36 (b), dan 662 nm (c) pada Gambar 4 menghasilkan 1 4 puncak. Jumlah puncak yang terbentuk terlalu sedikit, maka profil yang terbentuk tidak baik. Selain itu, puncak-puncak yang terbentuk diduga bukan berasal dari ekstrak etanol 7% S. arvensis, melainkan dari fase gerak. Berdasarkan hal itu, metode isokratik belum dapat digunakan dalam penentuan profil. Ekstrak etanol 7% S. arvensis Solo selain dianalisis dengan metode isokratik, juga dianalisis dengan metode gradien dengan fase gerak yang sama. Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak selama analisis kromatografi berlangsung (Putra 24). Peningkatan kekuatan fase gerak dapat mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat dalam kolom, sehingga puncak-puncak kromatogram yang dihasilkan semakin banyak. Profil ekstrak etanol 7% S. arvensis yang diperoleh dengan metode elusi gradien pada 35, 36, dan 662 nm dapat dikatakan lebih baik (Gambar 5). Jumlah puncak yang dihasilkan lebih banyak daripada metode elusi isokratik, berkisar antara 3 dan 7 puncak. Puncak-puncak yang teridentifikasi juga tidak muncul hanya pada menit awal saja, tetapi muncul selama analisis berlangsung sampai menit ke 55. Dengan demikian, profil yang terbentuk dengan metode gradien lebih representatif dibandingkan dengan metode isokratik. Profil yang terbentuk pada metode elusi gradien lebih baik dibandingkan dengan metode isokratik, karena pada metode elusi gradien, susunan pelarut diubah tahap demi tahap, setiap tahap lebih polar daripada tahap sebelumnya. Adanya perubahan kepolaran tersebut membuat senyawa flavonoid lebih terbawa dalam fase gerak. Seperti penjelasan sebelumnya, senyawa flavonoid termasuk golongan fenolik yang bersifat polar sehingga akan cenderung berasosiasi dengan fase gerak. Profil ekstrak etanol 7% S. arvensis Solo dengan elusi gradien pada 35 nm menghasilkan bentuk kromatogram yang lebih ramping dan sempit. Bentuk tersebut sesuai dengan kriteria kromatogram yang diinginkan. Oleh karena itu, dapat dikatakan kondisi tersebut menghasilkan profil terbaik dibandingkan dengan profil metode elusi etanol 7% S. arvensis Solo pada 36 nm dan 662 nm. a. c. Densitas optik () b. Densitas optik () Densitas optik () Detector A Ch2:35nm min Detector A Ch1:36nm 1.786/ / / / min 1.778/ / Detector A Ch2:662nm 1.8/ / / min Gambar 4 Kromatogram isokratik ekstrak etanol 7% S. arvensis Solo dengan metanol-asam asetat.1% (v/v) pada 35(a), 36 (b), dan 622 nm (c). 9

6 a. Densitas optik () b. Densitas optik () Detector A Ch2:35nm / / / min Detector A Ch1:36nm / / / / / / / / /13817 dan kalkon menyerap sinar UV pada daerah nm. Karena itu, penentuan profil ekstrak etanol 7% S. arvensis Solo dilakukan pada 35 nm dan 36 nm. Penentuan profil pada 662 nm berdasarkan pada nilai absorbans tertinggi. Dengan menggunakan panjang gelombang dari absorbans maksimum, jika terjadi penyimpangan (deviasi) kecil terhadap panjang gelombang dari cahaya yang masuk, maka hanya menyebabkan galat yang kecil dalam pengukuran (Day dan Underwood 1998). SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Ekstrak S. arvensis etanol 7% berpotensi sebagai antikanker. Potensi terbesar sebagai antikanker didapatkan pada ekstrak etanol 7% S. arvensis Solo dengan nilai rerata LC 5 sebesar ppm. Golongan flavonoid yang terkandung dalam ekstrak tempuyung di antaranya adalah flavon, flavonol, dan kalkon. Profil kromatogram terbaik didapatkan dengan menggunakan metode elusi gradien dengan pendeteksian sinar UV pada panjang gelombang 35 nm. c. Densitas optik () min Detector A:662nm /18711 Saran Perlu diadakan pengujian toksisitas lanjutan dengan menggunakan hewan lain seperti tikus untuk mengetahui efek toksisitas dari ekstrak tempuyung dan juga untuk mengetahui konsentrasi yang aman untuk digunakan sebagai obat. Selain itu diperlukan optimasi dan validasi lebih lanjut hasil kromatogram yang ada supaya hasil yang diperoleh lebih akurat. DAFTAR PUSTAKA min Gambar 5 Kromatogram gradien ekstrak etanol 7% S. arvensis Solo dengan metanol-asam asetat.1% (v/v) pada 35 (a), 36 (b), dan 622 nm (c). Sriningsih et al. (25) menyatakan bahwa S. arvensis mengandung senyawa flavonoid, seperti flavon, flavonol, dan kalkon. Menurut Markham (1988), golongan flavon, flavonol, Akbar HR. Isolasi dan identifikasi golongan flavonoid daun dandang gendis (Clinachantus nutans) berpotensi sebagai antioksidan [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika Ilmu Pengetahuan dan Alam, Institut Pertanian Bogor. Alexandrova RI, Alexandrova M, Valcheva, Varadinova T. 2. Phytoproduct and cancer. J Experimental Pathol Parasitol J 3: