BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Bahan dan Alat Pelaksanaan Penelitian

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biofarmaka, Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong dari bulan April 2008 Mei Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: hipokotil tumbuhan sarang semut yang diperoleh dari Papua. Bahan kimia metanol teknis, metanol p.a., n-heksana, etil asetat, asam klorida, larutan amoniak, pereaksi Mayer, pereaksi Dragendorff, eter, pereaksi Liebermann-Burchard, serbuk magnesium, HCl pekat, amil alkohol, FeCl 3, NaOH, pereaksi Molisch, timbal (II) asetat, isopropanol, asetat anhidrat, asam sulfat pekat, kloroform, serium sulfat, akuades, butanol, serbuk silika gel 60 GF 254, akuabides, sephadex LH-20, sea sand B, celite 545, dimetilsulfoksida (DMSO), kapas, kista udang A. Salina Leach, air laut dan DPPH. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: timbangan analitik, peralatan refluks, plat silika gel GF 254, chamber kromatografi lapis tipis (KLT), rotary evaporator, labu ekstraksi, corong pisah, kolom kaca panjang 60 cm dan diameter 3 cm, spektrofotometer inframerah Fourier Transform (FT-IR) Shimadzu, spektrofotometer ultraviolet-cahaya tampak (UV-VIS) Shimadzu, spektrometer resonansi magnetik inti (RMI) JNM ECA-500 MHz, sonikator Bronson, detektor KLT sinar UV pada panjang gelombang 254 nm, kaca objek, aerator, pipet Pasteur, dan alat-alat gelas. Pelaksanaan Penelitian Penelitian ini meliputi beberapa tahap kerja, yaitu : 1) determinasi sampel, 2) preparasi dan ekstraksi, 3) uji penapisan fitokimia, 4) uji toksisitas, 5) uji antioksidan, 6) kromatografi kolom, dan 7) penentuan struktur molekul.

2 Determinasi Tumbuhan sarang semut yang diperoleh dari Papua diterminasi di Laboratorium herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Cibinong. Preparasi Sampel dan Ekstraksi Hipokotil tumbuhan sarang semut dibersihkan dari kotoran yang melekat, dicuci dengan air, dipotong kecil-kecil, dikeringkan dengan cara diangin-anginkan sampai kadar air 10-20% dan disebut sebagai simplisia. Sebanyak 1 kg simplisia direfluks dengan 2000 ml aquadest selama 4 jam. Ekstrak aquadest kemudian dipartisi dengan larutan n-butanol dengan menggunakan corong pisah sebanyak tiga kali. Fraksi n-butanol yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator, sedangkan fraksi air keringkan dengan freeze dryer, sehingga diperoleh dua fraksi yaitu fraksi n-butanol dan fraksi air. Uji Penapisan Fitokimia (Franswort 1996) Uji penapisan fitokimia bertujuan untuk mengetahui golongan senyawa yang terdapat pada fraksi n-butanol dan fraksi air hipokotil tumbuhan sarang semut. Golongan senyawa yang diuji adalah: alkaloid, steroid dan triterpenoid, flavonoid, saponin, kumarin, kuinon, karbohidrat, dan glikosida. Uji Alkaloid. Sebanyak 0,5 g ekstrak aktif ditambah 5 ml asam klorida 10 % kemudian dikocok dan ditambah 5 ml larutan amoniak 10 %. Diekstraksi dengan kloroform dan diuapkan. Residu yang terbentuk ditambah 1,5 ml asam klorida 2% dan dibagi dalam dua tabung. Tabung pertama ditambah 2-3 tetes pereaksi Mayer. Jika terbentuk endapan putih kekuningan menunjukkan adanya alkaloid. Tabung kedua ditambah 2-3 tetes pereaksi Dragendorff, jika terbentuk endapan merah bata menunjukkan adanya alkaloid. Uji Steroid dan Triterpenoid. Sebanyak 0,5 g ekstrak aktif diekstraksi dengan 10 ml eter lalu disaring. Filtrat yang diperoleh kemudian ditambah pereaksi Liebermann-Burchard (3 tetes asam asetat anhidrat 1 tetes H 2 SO 4 pekat). Jika

3 terbentuk warna hijau atau biru menunjukkan adanya steroid sedangkan warna merah atau ungu menunjukkan triterpenoid. Uji Kumarin. Sebanyak 0,5 g ekstrak aktif ditambah 10 ml eter kemudian didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh kemudian diuapkan, ditambah 10 ml air panas kemudian didinginkan dan ditambah 0,5 ml larutan ammoniak 10%. Jika terbentuk fluoresensi hijau atau biru pada sinar UV menunjukkan adanya kumarin. Uji Flavonoid. Sebanyak 0,5 g ekstrak aktif di dalam gelas piala ditambah 100 ml air panas, didihkan selama 5 menit kemudian disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Sebanyak 10 ml filtrat ditambah serbuk magnesium lalu 0,2 ml HCl pekat dan ditambah amil alkohol. Campuran dikocok dan dibiarkan memisah. Jika terbentuk warna merah, kuning, dan jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan senyawa golongan flavonoid. Uji Saponin. Sebanyak 0,5 g ekstrak aktif di dalam gelas piala ditambah 100 ml air panas, didihkan selama 5 menit kemudian disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Sebanyak 10 ml filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup kemudian dikocok dan biarkan selama 10 menit. Jika terbentuk busa yang stabil menunjukkan adanya saponin. Uji Tanin. Sebanyak 0,5 g ekstrak aktif di dalam gelas piala ditambah 100 ml air panas, didihkan selama 5 menit kemudian disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Sebanyak 10 ml filtrat ditambah beberapa tetes FeCl 3 1%. Jika terbentuk warna biru tua/hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin. Uji Kuinon. Sebanyak 0,5 g ekstrak aktif di dalam gelas piala ditambah 100 ml air panas, didihkan selama 5 menit kemudian disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Sebanyak 10 ml filtrat ditambah NaOH 1N. Jika terbentuk warna merah menujukkan adanya kuinon. Uji Karbohidrat. Sebanyak 1 ml ekstrak aktif dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambah 1 ml pereaksi Molish dan diaduk. Tabung dimiringkan dan dialirkan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung sehingga tidak tercampur. Jika terbentuk cincin ungu pada perbatasan kedua lapisan cairan menunjukkan adanya karbohidrat.

4 Uji Glikosida. Sebanyak 3 g ekstrak aktif diekstraksi dengan 30 ml etanol 95%:air (7:3) dalam alat pendingin alir balik selama 10 menit kemudian didinginkan dan disaring. Sebanyak 20 ml filtrat ditambah 25 ml timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok lalu didiamkan selama 5 menit dan disaring. Filtrat diekstraksi tiga kali dengan 20 ml kloroform:isopropanol (3:2). Hasil ekstraksi ditambah natrium sulfat anhidrat kemudian disaring dan diuapkan pada suhu tidak lebih dari 50 C. Sebanyak 0,1 ml filtrat diuapkan di penangas air, sisanya dilarutkan dalam 5 ml asam asetat anhidrat kemudian ditambah 10 tetes asam sulfat. Jika terbentuk warna biru atau hijau menunjukkan adanya glikosida. Sebanyak 0,1 ml filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu diuapkan di penangas air. Residu yang terbentuk ditambah 2 ml air kemudian 5 tetes pereaksi Molish dan ditambah asam sulfat pekat dengan hati-hati. Jika terbentuk cincin berwarna ungu pada batas cairan menunjukkan adanya ikatan gula. Uji Toksisitas Brine Shrimp Letahality Test (BSLT) Penetasan Kista Artemia salina Leach. Kista A. Salina Leach ditimbang kurang lebih 50 mg kemudian dimasukkan ke dalam gelas piala yang berisi 500 ml air laut yang telah disaring dan dipasang aerator, lalu dibiarkan selama 48 jam dengan pencahayaan lampu TL agar telur menetas sempurna. Larva yang sudah menetas dipipet ke dalam botol percobaan dan diberi ekstrak sesuai perlakuan. Persiapan Sampel. Larutan ekstrak 2000 ppm dibuat dengan cara menimbang 40 mg ekstrak dengan teliti kemudian dilarutkan dengan air laut menjadi 20 ml. Ekstrak yang sukar larut, dapat ditambah DMSO 1% (5 tetes) untuk meningkatkan kelarutan. Konsentrasi 200 ppm dibuat dengan memipet 2 ml larutan ekstrak 2000 ppm dan ditambah air laut sampai 20 ml. Konsentrasi 20 ppm dibuat dengan memipet 2 ml larutan konsentrasi 200 ppm dan ditambah air laut sampai 20 ml. Larutan ekstrak 1000 ppm dibuat dengan cara memipet 5 ml larutan ekstrak 2000 ppm dan ditambah air laut 5 ml. Konsentrasi 100 ppm dibuat dengan cara memipet larutan ekstrak 200 ppm sebanyak 5 ml dan ditambah air laut 5 ml. Larutan ekstrak 10 ppm dibuat dengan cara memasukkan larutan ekstrak 20 ppm dan ditambah 5 ml air laut.

5 Uji Bioaktivitas. Uji bioaktivitas dilakukan dengan memasukkan 15 ekor larva udang A. salina Leach yang berumur 48 jam ke dalam botol yang telah berisi larutan ekstrak dan air laut. Untuk setiap konsentrasi dilakukan 3 kali ulangan (triplo). Sebagai kontrol adalah air laut yang tidak diberi ekstrak sampel. Botol percobaan disimpan dibawah pencahayaan lampu TL. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam. Jumlah larva udang yang mati dicatat kemudian dihitung persentase kematiannya. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan Probit Analysis Method untuk menentukan LC 50 dengan selang kepercayaan 95%. Uji Aktivitas Antioksidan Terhadap fraksi n-butanol dan air yang diperoleh dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) dan vitamin C sebagai kontrol positif.: Pembuatan larutan 1 mm DPPH. 39,5 mg DPPH (BM = 394,2) ditimbang dan dilarutkan dalam 100 ml metanol p.a, dihomogenkan kemudian ditempatkan dalam botol gelap. Pembuatan larutan blanko. Larutan DPPH 1 mm dipipet 1 ml lalu di masukan ke dalam labu volumetrik 5 ml kemudian dihomogenkan. Pembuatan larutan uji. 10 mg sampel ditimbang menggunakan timbangan analitik, dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10 ml (1000 µg/ml) dalam labu volumetrik. Larutan ini merupakan larutan induk. Kemudian dipipet 25, 50, 125, 250, dan 500 µl larutan induk tersebut ke dalam tabung reaksi yang telah ditara 5 ml untuk mendapatkan konsentrasi sampel 5, 10, 25, 50, dan 100 µg/ml. Pembuatan larutan vitamin C (kontrol positif). 10 mg vitamin C ditimbang, lalu dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10 ml (1000 µg/ml) dalam labu volumetrik. Larutan ini merupakan larutan induk. Kemudian dipipet 15, 30, 45, 60, 75 µl. Larutan induk ke dalam tabung reaksi yang telah ditara 5 ml untuk mendapatkan konsentrasi sampel 3, 6, 9, 12, 15 µg/ml. Uji aktivitas antioksidan. Tambahkan 1 ml larutan DPPH 1 mm ke dalam setiap tabung larutan uji dan kontrol positif kemudian ditambah metanol hingga 5 ml, dihomogenkan. Larutan blangko, larutan uji, dan larutan kontrol positif segera

6 diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37ºC, kemudian serapan dibaca pada panjang gelombang 515 nm. Persen inhibisi/hambatan dihitung dengan rumus berikut: Serapanblanko serapan sampel Hambatan (inhibisi) = x100% Serapanblanko Dihitung IC 50 dengan memasukkan nilai dari konsentrasi larutan uji sebagai sumbu x dan persen hambatan terhadap DPPH sebagai sumbu y ke dalam persamaan garis regresi. Kromatografi Kolom Kromatografi kolom dilakukan terhadap fraksi air dengan fase diam yang digunakan adalah serbuk silika gel 60 ukuran mesh. Fase gerak yang digunakan untuk kromatografi kolom pertama menggunakan kloroform; kloroform:metanol (10:1 ~ 1:1). Kromatografi kolom kedua (fraksi Mp-Aq.2) menggunakan kloroform:metanol (5:1); kloroform:metanol:air (7:3:1). Kromatografi kolom ketiga (fraksi Mp-Aq.2.6) menggunakan kloroform:metanol (5:1). Fraksi-fraksi yang diperoleh dari hasil kromatografi kolom kemudian diidentifikasi dengan kromatografi lapis tipis untuk melihat pola pemisahannya serta dilakukan uji aktivitas sitotoksik (BSLT) dan aktivitas sebagai antioksidan (DPPH). Elusidasi Struktur Kimia Senyawa murni yang diperoleh kemudian dielusidasi struktur kimianya menggunakan spektrofotometer UV-VIS, spektrofotometer FT-IR, dan spektrometer RMI. Pengukuran Spektrofotometer UV-VIS. Sebanyak 1 mg senyawa hasil isolasi dilarutkan ke dalam 10 ml pelarut yang sesuai sehingga terbentuk larutan yang homogen. Larutan tersebut ditentukan panjang gelombang maksimum (λ maks ). Pengukuran Spektrofotometer FT-IR. Sebanyak 1 mg senyawa hasil isolasi digerus dengan 50 mg KBr dalam mortar sampai homogen, selanjutnya ditekan dengan alat penekan hidrolik sehingga terbentuk pelet. Pelet KBr diukur vibrasinya pada rentang bilangan gelombang cm -1.

7 Pengukuran Spektrometer RMI. Sebanyak kurang lebih 5 mg senyawa hasil isolasi dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, selanjutnya diukur RMI 1 dimensi proton, karbon, DEPT dan RMI 2 dimensi HMQC, 1 H- 1 H COSY dan HMBC.