PROTEIN BIOAKTIF DARI BAGIAN TANAMAN DAN AKAR TRANSGENIK CUCURBITACEAE SERTA AKTIVITAS ANTIPROLIFERASI GALUR SEL KANKER IN VITRO CHURIYAH

Transkripsi

1 PROTEIN BIOAKTIF DARI BAGIAN TANAMAN DAN AKAR TRANSGENIK CUCURBITACEAE SERTA AKTIVITAS ANTIPROLIFERASI GALUR SEL KANKER IN VITRO CHURIYAH SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2005

2 ABSTRAK CHURIYAH. Protein Bioaktif dari Bagian Tanaman dan Akar Transgenik Cucurbitaceae serta Aktivitas Antiproliferasi Galur Sel Kanker In Vitro. Dibimbing oleh G. A. WATTIMENA sebagai ketua komisi pembimbing, SAID HARRAN, BAMBANG PONTJO PRIOSOERYANTO, LATIFAH K. DARUSMAN dan WAHONO SUMARYONO sebagai anggota. Berbagai tanaman menghasilkan protein bioaktif yang berguna untuk melawan penyakit penting seperti hiperproliferasi dan infeksi virus, diantaranya beberapa species Cucurbitaceae. Untuk mendapatkan protein bioaktif dapat secara langsung mengekstraksi tanaman dari lapang atau melalui kultur in vitro. Keuntungan kultur in vitro antara lain: kultur dalam kondisi aseptik, lingkungan tumbuh terkendali dan pertumbuhan cepat. Kultur akar rambut dengan bantuan Agrobacterium rhizogenes merupakan kultur in vitro yang mempunyai kestabilan genetik tinggi karena tidak memerlukan penambahan zat pengatur tumbuh. Tujuan penelitian adalah: 1) mendapatkan bagian tanaman dari tiga spesies Cucurbitaceae yang menghasilkan protein bioaktif dengan rendemen dan aktivitas tinggi, serta mudah penanganannya 2) memperoleh kultur akar rambut Trichosanthes cucumirena L. var anguina (L.) Haines yang dapat tumbuh dan berkembang tanpa pemberian ZPT serta menghasilkan protein bioaktif dengan rendemen dan aktivitas tinggi 3) mendapatkan bagian tanaman atau akar rambut yang menghasilkan protein bioaktif yang dapat menghambat proliferasi galur sel kanker in vitro. Uji pendahuluan aktivitas protein menggunakan uji kematian larva udang untuk mendapatkan konsentrasi protein yang dapat mematikan separuh dari jumlah larva Artemia salina Leach yang diuji (LC 50 ). Uji selanjutnya menggunakan galur sel kanker in vitro untuk mengetahui konsentrasi protein yang dapat menghambat proliferasi sel HeLa dan sel K-562 hingga setengah dari proliferasi sel kontrol (IC 50 ). Hasil penelitian menunjukkan diantara ketiga spesies maupun masingmasing bagian tanaman dalam satu spesies menghasilkan rendemen dan aktivitas protein yang beragam. Berdasarkan tingginya rendemen dan aktivitas protein yang dihasilkan serta kemudahan dalam penanganan bahan tanaman, dari Benincasa hispida (Thunb.) Cogn (bligo) dipilih akar yang menghasilkan fraksi protein BR2 dengan rendemen 0,54% dan LC µg/ml. Dari Coccinia grandis (L..) Voigh (kemarongan) dipilih buah muda yang menghasilkan fraksi protein CYF3 dengan rendemen 0.023% dan LC µg/ml. Sedangkan dari Trichosanthes cucumirena L. var anguina (L.) Haines (paria ular) dipilih biji dan akar yang masing-masing menghasilkan fraksi protein TS3 dengan rendemen 1.11 % dan LC µg/ml dan fraksi protein TR3 dengan rendemen 0.36% dan LC µg/ml. Diantara bagian-bagian tanaman dari tiga spesies, biji paria ular menghasilkan fraksi protein TS3 dengan rendemen dan aktivitas tertinggi. Induksi akar rambut pada biji paria ular yang dikecambahkan secara in vitro menghasilkan enam klon akar rambut, yaitu: klon THR1, THR2, THR3, THR4, THR6 dan THR8 yang dapat tumbuh dan berkembang dengan stabil dalam medium tanpa ZPT. Dari enam klon diseleksi berdasarkan tingginya rendemen dan aktivitas protein yang dihasilkan. Hasil seleksi menunjukkan dua klon yang menghasilkan protein dengan rendemen dan aktivitas paling tinggi adalah klon THR8 dengan rendemen 0.74% dan LC µg/ml dan klon THR2 dengan

3 rendemen 0.83% dan LC µg/ml. Hasil konfirmasi transformasi pada klon THR2 dengan amplifikasi PCR menunjukkan terintegrasinya TL-DNA A. rhizogenes pada genom, dibuktikan dengan terdeteksinya gen rolb pada hasil elektroforesis pada 780 bp. Fraksinasi protein dari akar rambut klon THR2 menghasilkan empat fraksi, dan fraksi protein THR2-3 memiliki rendemen dan aktivitas paling tinggi yaitu 0.29% dan LC µg/ml. Uji aktivitas penghambatan proliferasi protein asal tanaman dari lapang dan akar rambut terhadap galur sel kanker menunjukkan selektivitas terhadap galur sel tertentu. Fraksi protein BR2, TR3 dan TS3 dan THR2-3 lebih aktif menghambat proliferasi sel K-562, sedangkan TS3 dan THR2 lebih aktif menghambat proliferasi sel HeLa. Akar rambut menghasilkan protein yang lebih potensial dalam menghambat proliferasi sel kanker dibanding bagian tanaman dari lapang. IC 50 dari protein asal akar rambut µg/ml hampir sepersepuluh dari IC 50 dari tanaman lapang µg/ml. Karakterisasi protein dengan SDS-PAGE pada semua fraksi protein yang mempunyai rendemen dan aktivitas tinggi dari bagian tanaman dan akar rambut mempunyai berat molekul antara kda.

4 ABSTRACT CHURIYAH. Bioactive Protein from Plant Parts and Hairy Root of Cucurbitaceae and The Antiproliferation Acivity on In Vitro Cancer Cell Line. Supervised by G. A. WATTIMENA as the chairman, SAID HARRAN, BAMBANG PONTJO PRIOSOERYANTO, LATIFAH K. DARUSMAN and WAHONO SUMARYONO as advisory committee members. Several plants produce bioactive protein which are very useful for treatment of many diseases especially hiperproliferation and virus infections. Various proteins were found in several species belonging to family of Cucurbitaceae. Production of plant protein can be directly extracted from intact plant parts or by in vitro culture. The advantages of the in vitro culture are: the culture is sterile, the environmental condition is under control and the growth is faster. The hairy root culture, resulted from plant transformation using Agrobacterium rhizogenes is the most suitable method of in vitro culture, which does not require growth regulator so the hairy root has high genetic stability. The purpose of this research were : 1) to find the plant part of three species of Cucurbitaceae which produced high yields and activities of the bioactive protein 2) to establish the hairy root culture of Trichosanthes cucumirena L. var anguina (L.) Haines that proliferate without growth regulator addition, and produced high yield and activity of the bioactive protein 3) to find the plant parts or hairy roots that produced the bioactive protein which have the antiproliferation acitivity on cancer cell line in vitro. The protein activities were examinated using the brine shrimp lethality test based on the concentration which can kill half of number the brine shrimp (LC 50 ) treated. Continuously with antiproliferation assay using cancer cell line to find the protein concentration that can inhibit half of the cell proliferation (IC 50 ).. The result indicated that there were difference among the three species and among the plant parts in one species in yield and activities of protein produced. Based on the highest yield and activity of the bioactive protein produced, and the ease to handle the material from the species Benincasa hispida (Thunb.) Cogn was selected to the root which produced protein fractions BR2 (0.54 %) and LC µg/ml, and on the Coccinia grandis (L.) Voigh from immature fruit which produced CYF3 (0.023%) and LC µg/ml. The other were root and seed of Trichosanthes cucumirena L. var anguina (L.) Haines which produced protein fractions TS3 and TR3. The yield and activity of protein of TS3 and TR3 were 1.11 % and LC µg/ml, 0.36 % and LC µg/ml respectively. The seed of Trichosanthes cucumirena L. var anguina (L.) Haines resulted in the highest yield and activity of protein (TS3). Hairy root induction on the germinating seed of T. cucumirena L. var anguina (L.) Haines in vitro, resulted in six root clones those were THR1, THR2, THR3, THR4, THR6 and THR8 that can proliferate in the medium without addition of the growth regulator. Selection of the six root clones based on yield and activity of the protein produced, resulted two clones those were THR8 and THR2. The yield and activity of protein from THR8 and THR2 were 0.74% and LC µg/ml and 0.83% and LC µg/ml, respectively. Confirmation of transformation on the THR2 root clone using PCR amplification technique indicated the integration of the T-DNA from A. rizhogenes to the genome of plant cells which detected of the rolb gene on 780 bp in the electrophoretic agarose gel.

5 Protein fractionation on the THR2 root clone resulted in four fractions, and the highest yield and activities was 0.29% and LC µg/ml resulted from THR2-3 protein fractions. Antiproliferation assay using cancer cell line indicated the selectivity of the bioactive protein to certain cancer cell line, and the activity tend to increase with the increasing of protein concentrations as showed by limited number of the living cells. The BR2, TR3,TS3 and THR2-3 bioactive proteins tend to inhibit the K-562 proliferation, on the other hand CYF3 and THR2 have antiproliferation acivity higher on HeLa than on K-562. Protein resulted from hairy root more potent to inhibit cancer cell proliferation than protein from intact plants. The IC 50 of the hairy root protein were about µg/ml, and was lower than IC 50 of the protein plant parts, which were in the range of µg/ml. Protein characterization using SDS-PAGE on the protein fractions resulted from the plant parts and hairy roots indicated that their molecular weights were about kda.

6 PROTEIN BIOAKTIF DARI BAGIAN TANAMAN DAN AKAR TRANSGENIK CUCURBITACEAE SERTA AKTIVITAS ANTIPROLIFERASI GALUR SEL KANKER IN VITRO CHURIYAH Disertasi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Agronomi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2005

7 Judul Disertasi : Protein Bioaktif dari Bagian Tanaman dan Akar Transgenik Cucurbitaceae serta Aktivitas Antiproliferasi Galur Sel Kanker In Vitro Nama : Churiyah NIM : Disetujui Komisi Pembimbing Prof. Dr. Ir. G.A.Wattimena, M.Sc. Ketua Dr. Ir. Said Harran Anggota Drh. Bambang P. Priosoeryanto, Ph.D Anggota Prof.Dr.Ir. Latifah K. Darusman., MS. Anggota Dr. Wahono Sumaryono, Apt.APU Anggota Diketahui Ketua Program Studi Agronomi Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Satriyas Ilyas, M.Sc. Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, M.Sc. Tanggal ujian : 3 Oktober 2005 Tanggal lulus :

8 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Temanggung pada tanggal 17 Agustus 1956 sebagai putri kedua dari bapak H. M. Dharsono dan ibu Imronah (almarhumah). Pendidikan sarjana ditempuh di Fakultas Biologi Universitas Gajahmada, lulus tahun Pada tahun 1992 penulis diterima di Program Studi Agronomi pada Program Pascasarjana IPB dan menamatkannya pada tahun Kesempatan untuk melanjutkan ke program doktor pada program studi dan pada perguruan tinggi yang sama diperoleh pada tahun 1998, dengan beasiswa dari Proyek Peningkatan Kemampuan Personil (PPKP), Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi. Penulis bekerja di Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi sejak tahun Saat ini penulis sebagai peneliti pada Pusat Pengkajian dan Penerapan Teknologi Farmasi dan Medika BPPT.

9 PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala karunia Nya sehingga disertasi dengan judul Protein Bioaktif Dari Bagian Tanaman Dan Akar Transgenik Cucurbitaceae serta Aktivitas Antiproliferasi Galur Sel Kanker In Vitro, berhasil diselesaikan. Penghargaan dan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada Bapak Prof. Dr. Ir. G.A.Wattimena, MSc., Bapak Dr. Ir. Said Harran, Bapak Drh. Bambang Pontjo Priosoeryanto, Ph.D., Ibu Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS. dan Bapak Dr. Wahono Sumaryono, Apt. APU., selaku komisi pembimbing atas segala bimbingan, petunjuk serta pengarahannya selama penelitian sampai selesainya penulisan disertasi. Penghargaan dan terimakasih yang sebesarbesarnya kepada Ibu Prof Dr. Ir. Livy Winata Gunawan (Alm) yang telah berkenan memberikan kesempatan kepada penulis untuk bergabung dalam hibah Tim-URGE yang dipimpinnya. Penghargaan dan terimakasih juga disampaikan kepada dosen pengajar pada Sekolah Pascasarjana IPB yang telah banyak memberikan ilmu dan pengetahuan. Kepada Ketua Program Studi Agronomi penulis ucapkan terimakasih atas saran dan pengarahannya dalam penulisan disertasi. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada bapak Prof. Dr. Ir. Sudarmadi Hardjosuwignyo, MSc. dan ibu Dr. Ir. Maharani Hasanah, APU atas perkenannya menjadi dosen penguji luar komisi pada sidang terbuka, dan atas saran-sarannya untuk perbaikan disertasi. Kepada Ibu Dr. Ir. Sandra Arifin Azis, MS., penulis ucapkan terimaksih yang sebesar-besarnya yang telah berkenan menjadi dosen penguji luar komisi pada sidang tertutup, dan atas kebaikannya memberikan koleksi tanamannya. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Ir. Achkam Subroto, peneliti dari LIPI atas kebaikannya memberikan A. rhizogenes yang dikoleksinya. Penghargaan dan ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada Bapak Deputi Kepala BPPT Bidang Teknologi Agroindustri dan Bioteknologi dan kepada Ibu Direktur Pusat Pengkajian dan Penerapan Teknologi Farmasi dan Medika atas perkenan, dukungan dan kesempatan yang telah diberikan kepada penulis untuk mengikuti mengikuti program S3 di Sekolah Pascasarjana IPB. Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Kepala

10 Balai Bioteknologi, Kepala Lab. Bioteknologi Pertanian dan staf, Kepala Lab. Rekayasa Genetika beserta staf, Kepala Lab. Recovery dan staf Balai Bioteknologi BPPT, Kepala Lab. Bioindustri, Kepala Lab. Teknologi Farmasi dan Medika., Puspiptek Serpong. Koordinator Lab Patologi FKH-IPB, yang telah memperkenankan penulis melaksanakan penelitian untuk disertasi. Ucapan terimaksih juga penulis sampaikan kepada Pimpinan Proyek Peningkatan Kemampuan Personil (PPKP) BPPT atas beasiswa yang diberikan, dan kepada Pimpinan Proyek Hibah Tim-URGE atas bantuan sebagian biaya penelitian. Kepada Ibu Dr. Ir. Yusnita, MSc. dan Dra. Rismayanti penulis ucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya atas bantuannya dalam dokumentasi. Terutama kepada seluruh staf Pusat Pengkajian dan Penerapan Teknologi Farmasi dan Medika penulis ucapkan terima kasih atas segala bantuan moril dan materiil dalam melaksanakan penelitian. Terimakasih yang sedalam-dalamnya kepada seluruh keluarga, suami (Alm) serta anak-anak tercinta Maulana dan Haikal, bapak, kakak dan adik-adik, Amma dan adik-adik ipar, semua keponakan serta seluruh keluarga atas segala do a, dorongan dan bantuan yang tiada ternilai yang telah diberikan. Akhirnya kepada semua pihak yang telah memberikan bantuan, penulis menyampaikan terima kasih. Semoga Allah SWT membalas segala kebaikan yang telah diberikan kepada penulis, dengan balasan yang berlipat ganda. Amien. Semoga tulisan ini bermanfaat. Bogor, Desember 2005 Churiyah

11 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR SINGKATAN DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR. DAFTAR LAMPIRAN... xiv xv xvi xvii I. PENDAHULUAN UMUM A. Latar Belakang... 1 B. Tujuan Penelitian... 3 C. Hipotesis... 4 D. Manfaat Penelitian... 4 E. Perumusan Masalah... 4 II. TINJAUAN PUSTAKA A. Diskripsi Cucurbitaceae Benincasa hispida (Thunb.) Cogn Coccinia grandis (L.) Voigh Trichosanthes cucumirena L. var anguina (L.) Haines... 7 B. Proses Pembentukan Akar Rambut C. Biosintesis Protein Pada Tanaman Pembentukan Asam Amino Sintesis Protein D. Protein Bioaktif E. Uji Kematian Larva Udang F. Uji Menggunakan Galur Sel Kanker In Vitro III. PENAPISAN PROTEIN BIOAKTIF DARI BAGIAN TANAMAN BEBERAPA SPESIES CUCURBITACEAE A. Pendahuluan B. Bahan dan Metode Tempat, Waktu, dan Bahan a. Tempat dan waktu b. Bahan Prosedur Kerja a. Persiapan Tanaman di Lapang... 26

12 b. Ekstraksi Protein c. Fraksinasi Protein d. Uji aktivitas Protein e. Karakterisasi Protein C. Hasil dan Pembahasan Koleksi Tanaman di Lapang Ekstraksi Protein Fraksinasi Protein Uji aktivitas Protein Karakterisasi Protein D. Kesimpulan IV. INDUKSI KULTUR AKAR RAMBUT (HAIRY ROOT) Trichosanthes cucumirena L. var anguina (L.) Haines UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN BIOAKTIF A. Pendahuluan B. Bahan dan Metode Tempat, Waktu, dan Bahan a. Tempat dan Waktu b. Bahan Prosedur Kerja a. Induksi Kultur Akar Rambut b. Kurva Pertumbuhan Akar Rambut c. Ekstraksi Protein d. Uji Aktivitas Protein e. Konfirmasi Transformasi f. Fraksinasi Protein g. Karakterisasi Protein C. Hasil dan Pembahasan Induksi Kultur Akar Rambut Kurva Pertumbuhan Akar Rambut Ekstraksi Protein Fraksinasi Protein Uji Aktivitas Protein Uji Konfirmasi Transformasi Karakterisasi Protein D. Kesimpulan V. AKTIVITAS PROTEIN BIOAKTIF DARI BAGIAN TANAMAN DAN KULTUR AKAR RAMBUT CUCURBITACEAE TERHADAP PROLIFERASI GALUR SEL KANKER IN VITRO.

13 A. Pendahuluan B. Bahan dan Metode Tempat, Waktu, dan Bahan a. Tempat dan Waktu b. Bahan Persiapan Sampel Protein Persiapan Media dan Kultur Sel C. Hasil dan Pembahasan D. Kesimpulan VI. PEMBAHASAN UMUM VII. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan B. Saran VIII DAFTAR PUSTAKA DAFTAR SINGKATAN APS : Amonium persulfat ATCC : American Type Culture Collection BAP-1 : Bougenvillea Antivirus Protein- 1 BF : Benincasa fruit

14 BM : Berat Molekul BR : Benincasa root BS : Benincasa seed BSLT : Brine shrimp Lethality Test CMF : Coccinia mature fruit CR : Coccinia root CYF : Coccinia young fruit DNA : Deoxyribo nucleic acid GE : Gel elektroforesis HIV : Human immunodefisiense virus HSA : Hari setelah antesis HST : Hari setelah tanam IC 50 : Inhibitive concentration 50% kda : Kilo Dalton LC 50 : Lethal concentration 50% LMW : Low Molecular Weight MAP-50 : Momordica charantia Anti virus Protein MS0 : Murashige dan Skoog tanpa zat pengatur tumbuh MSA : Minggu setelah antesis MST : Minggu setelah tanam MTT : 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl-tetrazolium bromide NCPPB : National Collection Phyto Pathogenic Bacteria PAP : Phytolaca americana Protein PBS : Phosphat Buffer Saline PCR : Polymerase chain reaction PR-5 : Pathogenesis Related 5 Ri-plasmid : Root Inducing-plasmid RIPs : Ribosome inactivating protein rol-gene : Root locus- gene SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfat Polyacrylamid Gel Electrophoresis TAP : Trichosanthes Antivirus Protein T-DNA : Transfer- DNA TEMED : Tetrametil-ethilendiamin TF : Trichosanthes Fruit THR : Trichosanthes Hairy Roots TL-DNA : Transfer Left DNA TMV : Tobacco Mosaic Virus TR : Trichosanthes Root TR-DNA : Transfer Right - DNA TS : Trichosanthes Seed UV-Vis : Ultra Violet - Visible YMA : Yeast malt agar DAFTAR TABEL Halaman 1. Rendemen protein dari 3 spesies Cucurbitaceae Rendemen fraksi protein bligo... 48

15 3. Rendemen fraksi protein kemarongan Rendemen fraksi protein paria ular Aktivitas protein dan fraksinya dari 3 spesies Cucurbitaceae Fase pertumbuhan akar rambut pada perlakuan berat inokulum Waktu panen dan berat biomasa akar rambut Rendemen ekstrak protein 6 klon akar rambut Rendemen fraksi protein akar rambut klon THR Aktivitas protein dan fraksinya dari klon THR DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Diagram alir penelitian Artemia salina Leach Koleksi tanaman di Kebun Percobaan IPB Baranangsiang... 29

16 4. Bagian tanaman dari bligo Bagian tanaman dari kemarongan Bagian tanaman dari paria ular Pola pemisahan protein bligo Pola pemisahan protein kemarongan Pola pemisahan protein paria ular Hasil elektroforesis SDS-PAGE protein bligo Hasil elektroforeis SDS-PAGE protein kemarongan Hasil elektroforeis SDS-PAGE protein paria ular Kultur in vitro Trichosanthes cucumirena L.var anguina (L) Perkembangan akar adventif T. Cucumerina Kultur akar rambut T. Cucumerina umur 18 HST Kurva pertumbuhan akar rambut variabel berat inokulum Perkembangan kultur akar rambut klon THR2 dalam MS0 cair Pola pemisahan protein dari T. cucumerina klon THR Hasil amplifikasi PCR DNA akar rambut klon THR Hasil elektroforesis SDS-PAGE akar rambut klon THR Kurva standar galur sel kanker dengan metode MTT Aktivitas protein asal tanaman lapang terhadap galur sel HeLa Aktivitas protein asal akar rambut terhadap galur sel HeLa Galur sel Hela : A. Kontrol, B. Perlakuan Akitivitas protein asal tanaman lapang terhadap galur sel K Aktivitas protein asal akar rambut terhadap galur sel K Galur sel K-562 : A. Kontrol, B. Perlakuan IC 50 protein asal tanaman dari lapang dan akar rambut DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Komponen larutan stok media Murashige dan Skoog (MS) yang dimodifikasi Media kultur akar rambut Media Yeast Manitol Agar (YMA) Elektroforesis... 91

17 5. Hasil absorbansi analisis MTT sel Hela Hasil absorbansi analisis MTT sel K