ISOLASI FRAGMEN GEN STEAROYL ACP DESATURASE (SAD) ASAL 5 SUMBER KERAGAMAN KELAPA SAWIT. Abstrak

Transkripsi

1 12 BAB III ISOLASI FRAGMEN GEN STEAROYL ACP DESATURASE (SAD) ASAL 5 SUMBER KERAGAMAN KELAPA SAWIT Abstrak Kelapa sawit merupakan tanaman penghasil minyak nabati dengan produktifitas per hektar tertinggi dibandingkan tanaman penghasil minyak lainnya. Asam oleat merupakan salah satu komponen asam lemak tidak jenuh yang baik untuk kesehatan dan terdapat pada tanaman penghasil minyak nabati dan mempengaruhi kualitas minyak. Kandungan asam oleat (asam lemak tidak jenuh) pada kelapa sawit komersil (Elaeis guineensis) lebih rendah dibandingkan minyak yangdihasilkan Elaeis Oleifera, yang merupakan spesies kelapa sawit yang belum termanfaatkan secara optimal. Pembentukan asam oleat dipengaruhi oleh gen kunci stearoyl acp desaturase, diduga perbedaan komposisi asam oleat pada E. guineensis dan E.oleifera disebabkan oleh perpedaan basa penyusun gen stearoyl acp desaturase. Pada penelitian ini dilakukan isolasi fragmen gen SAD menggunakan dua primer spesisfik SAD (SAD1 dan SAD2) dari 5 sumber keragaman kelapa sawit yang berasal dari dua spesies kelapa sawit, E.guineensis var Dura, Pisifera, Tenera, Virescens dan spesies E.oleifera (open pollinated), untuk melihat perbedaan basa penyusun gen stearoyl acp desaturase. Hasil sequense pada fragmen gen SAD menunjukkan kemiripan yang tinggi (99%) antar kelima sampel dan dengan sequense SAD aksesi E.guineensis U68756, AF dan aksesi E.oleifera FJ940768, EU yang terdeposit pada NCBI. Primer SAD1 yang menghasilkan fragmen dengan ukuran 1100 bp dan primer SAD2 yang menghasilkan fragmen gen SAD dengan ukuran 600 bp pada kelima sampel yang diisolasi. Kata kunci : asam oleat, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera, kelapa sawit, stearoyl acp desaturase (SAD)

2 STEAROYL ACP DESATURASE (SAD) GENE FRAGMENT ISOLATION FROM 5 DIFFERSITY SOURCE OF OIL PALM 13 Abstract Oil palm is a vegetable oil crops with the highest productivity per hectare than other oil crops. Oleic acid is a component of the unsaturated fatty acids which have good for human health (lowering blood LDL, Low Density Lipoprotein) and influense to the quality of the vegetable oil. The composition of oleic acid content (unsaturated fatty acids) in commercial oil palm (Elaeis guineensis) is lower that other oil palm spesies (Elaeis oleifera), which is not utilize optimally yet. Oleic acid formation on vegetable oil influence by the key enzym stearoyl acp desaturase (SAD). The oleic acid composition different between E. guineensis and E.oleifera may caused by the difference bases constituent stearoyl acp desaturase of both spesies. This research conduvted to isolate of SAD gene fragments was isolate using two spesifik SAD primers (SAD1 and SAD2) from 5 sources of oil palm diversity derived from two species of oil palm, E.guineensis var Dura, Pisifera, Tenera, virescens and species E.oleifera (open-pollinated). The SAD fragment sequense showed high similarity (99%) to each others sample source and oil palm SAD sequense acsesion E.guineensis U68756, AF and E.oleifera acsesion FJ940768, EU of NCBI. The SAD 1 produce SAD sequense fragments 1100 bp and the SAD2 primer 600 bp in all five isolated samples. Keywords : differsity, oleic acid, oil quality, oil palm, Stearoyl ACP Desaturase

3 14 Pendahuluan Kualitas Minyak Kelapa Sawit Kebutuhan terhadap kualitas minyak nabati yang sehat dengan harga yang murah menjadi tren pada perkembangan industri minyak dan asam lemak secara global. Kelapa sawit sebagai salah satu tanaman penghasil minyak utama dengan produktifitas per hektar tertinggi dibandingkan semua tanaman penghasil minyak lainnya, diharapkan dapat memenuhi kebutuhan tersebut. Oleh karena itu perlu dikembangkan materi genetik kelapa sawit dengan hasil tinggi dan kualitas minyak yang baik guna memenuhi kriteria sebagai bahan pangan maupun non pangan. Salah satu cara mempercepat mendapatkan tanaman unggul kelapa sawit, yang memenuhi kriteria diinginkan adalah dengan mengembangkan marka molekuler yang dapat mengidentifikasi kualitas minyak yang dihasilkan. Mesokarpa buah kelapa sawit merupakan sumber penghasil minyak terbesar pada tanaman kelapa sawit. Perbaikan kualitas minyak yang dihasilkan mesokarpa penting dilakukan untuk perkembangan industri kelapa sawit pada masa sekarang dan yang akan datang. Kualitas minyak berkaitan erat dengan biosintesis pembentukan asam lemak dan perbandingan komposisi asam lemak jenuh dan asam lemak tidak jenuh yang dihasilkan tanaman, kualitas minyak berkorelasi dengan kandungan asam lemak tidak jenuh, semakin tinggi kandungan asam lemak tidak jenuh (asam oleat) kualitas minyak juga semakin tinggi. Lintasan pembentukan asam lemak tidak jenuh pada kelapa sawit diawali oleh aktifitas gen SAD (Gambar 4). Ini merupakan gen kunci yang mempengaruhi pembentukan asam lemak tidak jenuh pada kelapa sawit, baik asam oleat yang merupakan monounsaturated fatty acid (MUFA) maupun asam linoleat dan linolenat (PUFA). Tabel 1. Komposisi asam lemak jenuh dan asam lemak tidak jenuh pada minyak sawit spesies Elaeis guineensis dan sejumlah aksesi plasma nutfah E. oleifera. Spesies Asal Asam lemak jenuh (%) Asam lemak tidak jenuh (%) C16.0 a.palmitat C18.0 a.stearat Total C18.1 a.oleat C18.2 a.linoleat Total Honduras Costa Rica E.oleifera Panama Colombia Brazil Suriname E.guineensis Sumber: Latiff (2000)

4 15 Kandungan dan komposisi asam lemak yang berbeda pada E.guineensis dan E.oleifera (Tabel 1) mengindikasikan adanya perbedaan gen penyandi enzim yang berperanan dalam lintasan biosintesis pada pembentukan asam lemak pada genom kedua tanaman tersebut. Perbedaan ini dapat diidentifikasi dengan mengevaluasi keragaman DNA sekuens dari masing-masing gen terkait menggunakan teknologi molekuler. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan primer gen SAD spesifik dan fragmen gen SAD yang berasal dari 5 sumber keragaman genom kelapa sawit spesies E.guineensis dan E.oleifera. Bahan dan Metode Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan November 2012 sampai Mei 2013, di Laboratorium Teknologi Gen dan Kultur Jaringan Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT Serpong, Tangerang, Banten. Bahan dan Alat Bahan tanaman yang digunakan adalah daun kelapa sawit Elaeis guinensis, Tenera, Dura, Pisifera, Virescens dan Elaeis oleifera. Bahan lain yang digunakan meliputi liquid nitrogen, buffer CTAB (cetyltrimetilammonium bromide) yang terdiri atas CTAB 2 %, 100 mm Tris (ph8), 20mM EDTA (ph8), 1.4 M NaCl, dan dh2o, kloroform - isoamil alkohol (24 : 1), agarose, etanol absolut, 5x phusion HF buffer, 10 mm dntp, DMSO, Phusion Hot start II DNA Polymerase. DNA fragments Extraction kit (Genaid). Loading dye, Gelred, ladder 1 kb, pasangan Primer SAD, SAD1 dan SAD2 forward dan revers 10µL. Alat yang digunakan meliputi mesin PCR, Elektroforesis tank, Laminar Air Flow Cabinet, sentrifus, Water bath, mesin nanodrop, timbangan analitik, oven, mikrowave, pinset, bunsen, petri, mikropipet, shaker, tabung eppendorf, erlenmeyer, ice keeper, mortar, spatula, Tabung Liquid Nitrogen dan pipet tips. Alat gelas yang digunakan labu erlenmeyer 250 ml, tabung penyimpan bahan 200 ml, dan cawan petri. Pelaksanaan Penelitian Persiapan Sampel berupa daun diperoleh dari material kelapa sawit koleksi Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT, Kebun PT PN.8 yang ada di Cimulang dan Cikumpai, Bogor serta asal PT. Astra Agro Lestari. Daun tanaman tenera yang berasal dari lapangan yang digunakan merupakan daun tombak yang masih berwarna putih. Daun tanaman Dura, Pisifera, Virescens dan E.oleifera merupakan material hasil kultur jaringan yang berasal dari kultur embrio. Material E.oleifera mrupakan material introduksi dari Camerun yang merupakan open pollinated, yang

5 16 diintroduksikan oleh PT. AAL. Bahan kimia untuk isolasi DNA, PCR, dan elekstroforesis disiapkan di laboratorium Teknologi Gen. Isolasi DNA Genom Isolasi DNA daun dilakukan berdasarkan metode CTAB Doyle and Doyle (1990) yang dimodifikasi. Sampel daun (0.5 1 gr) digerus dengan bantuan nitrogen cair, kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan ditambahkan 700 µl bufer ekstraksi. Campuran tersebut divorteks lalu diinkubasi dalam water bath selama 30 menit pada suhu 65 o C. Setelah dibiarkan dingin hingga suhu kamar, campuran tersebut ditambahkan dengan 700 µl kloroform - isoamil alkohol (CIA) (24:1). Campuran disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan rpm pada suhu 4 o C, supernatan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf baru. Prosedur penambahan CIA diulangi sampai dua kali dengan tujuan untuk mendapatkan hasil isolasi yang murni. Pelet DNA dicuci dengan menambahkan etanol absolut dua kali volume sampel, kemudian disentrifugasi 10 menit dengan rpm pada suhu 4 0 C, kedalam pelet ditambahkan etanol 70% dan disentrifus rpm pada suhu 4 0 C selama 5 menit, supernatan dibuang kemudian pellet dikeringkan. Endapan DNA yang telah kering dilarutkan dalam 50 µl bufer TE (10 mm Tris-HCl ph 8,0; 1 mm EDTA ph 8,0). Pengecekan kualitas dan kuantitas DNA genom dilakukan dengan elektroforesis (1% gel agarose) dan nanodrop. Disain Primer Spesifik Disain primer spesifik dilakukan dengan mengakses data sekuenss gen Stearoyl ACP Desaturase dari aksesi tanaman, Elaeis oleifera, Elaeis guineensis, yang terdeposit di NCBI yang terdiri atas U68756 (E.guineensis var Tenera) yang merupakan fragmen gen SAD kelapa sawit terpanjang yang terdapat di NCBI, FJ (E.oleifera), EU (E.oleifera, klon). Daerah yang sama diidentifikasi menggunakan Clustalw Bioedit, sedangkan primer dirancang menggunakan software primer3plus. Amplifikasi DNA Genom dengan Primer Spesifik Sampel DNA yang akan digunakan sebagai template PCR dicek konsentrasi dan kemurniannya terlebih dahulu dengan nanodrop, kemurnian DNA yang digunakan pada panjang gelompang 260/280 berkisar antara 1,8-2,0. Total volume mixed PCR adalah 20µL yang terdiri atas : 4 µl 5x Phusion HF buffer, 0.4 µl 10 µm dntps, masing-masing 1 µl Primer Forward dan Revers 10 µm, 0.2 µl Phusion Hot Start II DNA polymerase, 100 ng template DNA dan sisanya dh20. Reaksi PCR dilakukan dengan 30 siklus pada suhu 98ºC selama 30 detik, 98ºC selama 5 detik, 52ºC selama 30 detik, 72ºC selama 15 detik, dan 72ºC selama 5 menit. Elektroforesis Elektroforesis hasil amplifikasi PCR menggunakan 1% gel agarose. 0.3 gram agarose ditambahkan ke dalam 30 ml 1x TAE, kemudian dihomogenkan menggunakan microwave dan ditambahkan sybr safe 1 µl. Sampel DNA dicampur loading dye dengan perbandingan 5:2 kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel dalam tank elektroforesis. Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 120 volt selama 30 menit, kemudian dilihat hasilnya menggunakan UV lumination. Hasil

6 PCR dinyatidakan positif apabila terlihat adanya produk yang spesifik sesuai ukuran primer. Perunutan nukleotida dan analisis sekuen produk PCR Produk PCR (single band) dipurifikasi menggunakan PCR DNA fragments Extraction kit (Genaid kit). Hasil purifikasi digunakan sebagai bahan untuk perunutan nukleotida menggunakan mesin DNA sequenser otomatis AB 3130 Genetic Analyzer DNA. Hasil runutan DNA dianalisis menggunakan perangkat lunak BLAST 2.0, yang tersedia secara online di situs NCBI ( Blast.cgi) untuk mengetahui identitas fragmen genomic DNA yang didapatkan serta tingkat kemiripannya dengan gen SAD tanaman lain. 17 Hasil dan Pembahasan Disain Primer SAD Spesifik Disain primer dilakukan untuk membuat untaian basa nukleotida yang akan menempel dan mengapit daerah untaian DNA tertentu dari total genom yang ada pada kromosom. Pengapitan daerah untaian DNA diperlukan untuk melakukan perbanyakan (amplifikasi) hanya pada daerah untaian DNA tertentu sehingga lebih mudah dalam melakukan analisis. Keberhasilan melakukan amplifikasi daerah untai DNA sangat dipengaruhi oleh kecocokan primer terhadap kondisi DNA target. Disain primer gen SAD spesifik dilakukan dengan mengakses data sekuens gen SAD kedua spesies kelapa sawit dari NCBI aksesi U68756 (E.guineensis var Tenera), FJ (E.oleifera), EU (E.oleifera). Daerah yang sama diidentifikasi dengan Clustalw Bioedit, sedangkan primer dirancang dengan software primer3plus untuk dua daerah dengan urutan basa yang berbeda (Gambar 6) sehingga dihasilkan dua pasang primer, SAD 1 dan SAD 2 seperti pada Tabel 2, lokasi primer berdasarkan aksesi U68756 terdapat pada Lampiran 1. Gen SAD : Ukuran 1715 bp pada aksesi U68756 F1 F2 R1 R2 Gambar 6. Disain Primer SAD spesifik, SAD 1 terdiri atas pasangan primer Forward (F1) dan Revers 1 (R1), SAD 2 terdiri atas pasangan primer Forward (F2) dan Revers 1 (R2) Optimasi suhu annealing dilakukan untuk mendapatkan suhu optimal guna mengamplifikasi gen SAD dari genom kelapa sawit. Dari hasil optimasi diperoleh, suhu optimal untuk primer SAD1 guna mengamplifikasi genom kelapa sawit adalah 52 o C, sedangkan suhu optimal untuk primer SAD2 adalah 50 o C. Asmini et al. (2010) menambahkan selain suhu annealing (penempelan) dan konsentrasi ion Mg, spesifisitas primer merupakan salah satu faktor penting dalam amplifikasi suatu fragmen DNA.

7 18 Tabel 2. Dua pasang primer SAD spesifik untuk mengamplifikasi genomik fragmen gen SAD. Primer Forward Reverse Suhu Annealing ( o C) SAD1 ATGCTCAACACCCTTGATGG GGCATAGTCCTTGGCTGTGT 52 SAD2 CCTGCCCATCTGATGTATGA CGAGCAAGAACTAGGTTCCA 50 Primer SAD didisain untuk mendapatkan spesifisitas primer untuk gen SAD kelapa sawit, dimana gen SAD merupakan gen kunci pada lintasan pembentukan asam lemak tidak jenuh pada kelapa sawit, karena merupakan gen awal yang terbentuk ke arah lintasan pembentuk asam lemak tidak jenuh (diawali dengan pembentukan asam oleat oleh gen SAD). Biosintesis asam lemak kelapa sawit dikendalikan oleh gen-gen kunci penyandi enzim yang berperanan dalam pembentukan asam lemak pada tanaman secara umum. Biosintesis asam lemak menghasilkam asam palmitat (palmitic acid) dan asam stearat (stearic acid) yang merupakan produk asam lemak jenuh, sedangkan asam oleat (oleic acid) dan asam lonoleat serta asam linolenat merupakan produk asam lemak tidak jenuh. Proses pembentukan asam lemak tidak jenuh berhubungan dengan aktifitas gen SAD pada buah kelapa sawit, ini merupakan gen kunci yang berperanan penting dalam proses biosintesis asam lemak tidak jenuh (Basri et al. 2004). Isolasi DNA Genom dari Daun Kelapa Sawit DNA genom yang diisolasi berasal dari tanaman E. guineensis var. Tenera, Dura, Pisifera (Nigrescens), dan E. guineensis var. Tenera (Virescens) serta E. Oleifera untuk mendapatkan informasi sekuens gen SAD. Bahan isolasi DNA yang digunakan dapat digolongkan atas dua yakni dari daun muda yang berasal lapangan dan dari daun serta tahap multiplikasi embrio asal kultur jaringan (Gambar 7). Tenera berasal dari daun muda tanaman di lapangan, sedangkan untuk tanaman Dura, Pisifera, Virescens dan E.oleifera berasal dari daun kultur jaringan embrio. Isolasi DNA dilakukan dengan metode CTAB Doyle dan Doyle (1990), yang dimodifikasi dengan melakukan pengulangan tahap penambahan CIA sampai 3x. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan kualitas hasil isolasi DNA yang lebih bagus tanpa bahan pengotor seperti karbohidrat dan metabolit sekunder. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid, sehingga diperlukan cara untuk menghindari hal tersebut (Syafaruddin dan Joko 2011).Saat proses isolasi DNA genom tanaman, keberadaan polisakarida dan senyawa metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam proses isolasi asam nukleat. Struktur polisakarida yang mirip dengan asam nukleat akan menyebabkan polisakarida tersebut akan mengendap bersama dengan asam nukleat.

8 19 A B Gambar 7. Bahan Isolasi DNA, a). Daun hasil kultur jaringan, b) daun tombak dari lapangan. Isolasi DNA menunjukan hasil yang baik, dilihat dari hasil uji kualitatif dan kuantitatif yang telah dilakukan. Hasil isolasi DNA secara kualitatif memperlihatkan intensitas pita hasil elektroforesis yang tampak jelas (Gambar 8). Adanya pita pada bagian awal proses migrasi menunjukkan bahwa DNA yang dihasilkan adalah DNA total. Hasil kuantitatif terdapat pada Tabel 3 dimana konsentrasi DNA yang didapat memadai dengan kemurnian bervariasi berkisar dari kecuali virescens dengan kemurnian 1.72, namun ini masih dapat ditolerir karena menghasilkan produk amplifikasi yang bagus (Gambar 9). Tabel 3. Hasil isolasi 5 sampel sumber keragaman kelapa sawit NO Sumber Keragaman ng/µl 260/280 1 Tenera Dura Pisifera Virescens E.oleifera DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid (Safaruddin et al. 2011). Pengukuran konsentrasi DNA dengan spektrofotometer dilakukan pada panjang gelombang 260nm, sedangkan protein diukur pada panjang gelombang 280. Kemurnian larutan DNA dihitung melalui perbandingan A260 nm dengan A280 nm. Batas kemurnian yang biasa dipakai dalam analisis molekuler pada rasio A260/A280 adalah 1,8-2,0 (Sambrook et al. 1989).

9 bp 500 bp Gambar 8. Hasil elektroforesis DNA genom 1) Ladder 1 kb, 2) Tenera 3) Pisifera, 4). Dura Amplifikasi Fragmen Genomik gen SAD Kelapa Sawit Hasil amplifikasi PCR menggunakan total genom kelapa sawit sebagai templat (cetidakan) dengan dua pasang primer SAD spesifik, SAD1 dan SAD2 menghasilkan satu pita tunggal fragmen DNA genomik. Primer SAD1 menghasilkan fragmen dengan ukuran 1100 bp pada semua sampel, sedangkan primer SAD2 menghasilkan pita tunggal fragmen DNA genomik yang berukuran 600 bp pada semua sampel. Representasi hasil elektroferogram produk PCR yang didapat pada sampel E.guineensis var. Tenera, Dura, Pisifera, Virescens dan E.oleifera dapat dilihat pada Gambar 9. Tenera Virescens Dura Pisifera E.oleifera SAD1 SAD2 SAD1 SAD2 SAD1 SAD2 SAD1 SAD2 SAD1 SAD bp 500 bp Gambar 9. Elektroforegram hasil SAD Primer pada E.guineensis Var. Tenera, Virescens, Dura, Pisifera dan E. oleifera Primer SAD1 yang diprediksi menghasilkan fragmen dengan ukuran 600 bp untuk mengamplifikasi DNA genom semua sampel kelapa sawit, Tenera, Dura, Pisifera, Virescens dan E.oleifera (open pollinated), ternyata menghasilkan fragmen dengan ukuran 1100 bp, diduga terdapat intron diantara sekuens primer yang didisain. Primer SAD 2 menghasilkan fragmen sekuen gen SAD dengan ukuran 600 bp sesuai dengan prediksi awal dan tidak menunjukkan adanya intron.

10 21 (A) Gen SAD : Ukuran 1715 bp pada aksesi U68756 F1 F2 R1 R2 (B) Prediksi produk PCR dengan primer spesifik SAD: Intron(507 bp) SAD 1 (1100 bp) SAD 2 (600 bp) Gambar 9. Panjang sekuens yang dihasilkan oleh primer SAD 1 dan SAD 2. (a) Ukuran Gen SAD aksesi U68756, (b) Hasil amplifikasi Primer SAD 1 dan SAD 2 pada dua daerah yang berbeda. Identifikasi Sequense SAD Hasil analisis BLAST runutan DNA fragmen gen SAD dari 5 sampel keragaman kelapa sawit (Lampiran 2) yang berhasil diisolasi memiliki tingkat kemiripan 99% dengan sequense SAD kelapa sawit E.guineensis aksesi U68576 dan AF serta E.oleifera aksesi AF dan EU (Tabel 4). Kemiripan dengan Vitis vinifera 80%, sedangkan dengan tanaman jagung (Zea mays) tingkat kemiripannya 79-80%. Hal ini mengindikasikan bahwa fragmen genomik DNA yang dihasilkan dalam penelitian ini adalah benar sebagai fragmen DNA genomik dari gen SAD asal kelapa sawit. Tabel 4. Contoh tingkat kemiripan sequense sampel (Tenera) dengan informasi sequense SAD yang terdeposit di Bank gen, NCBI Aksesi Deskripsi Query cover Kemiripan Nilai E (%) (%) U68756 Elaeis guineensis FJ Elaeis oleifera EU Elaeis oleifera AF Elaeis guineensis AF Elaeis guineensis var. tenera XM_ Vitis vinifera E FQ Vitis vinifera E NM_ Zea mays E EU Zea mays clone E EU Zea mays clone E XM_ Sorghum bicolor E XM_ Setaria italica E GU Arachis hypogaea E

11 22 Simpulan Dua pasang primer gen SAD spesifik berhasil didisain untuk mengisolasi fragmen gen SAD dari genom kelapa sawit yakni primer SAD1 dan SAD2. DNA genome dari daun kelapa sawit yang berasal dari lima sumber keragaman kelapa sawit lapangan, maupun yang berasal dari hasil kultur jaringan embrio menghasilkan kualitas dan kuantitas DNA genom yang baik. Fragmen gen SAD telah berhasil diisolasi dan diamplifikasi dari DNA genom 5 aksesi kelapa sawit yang terdiri atas satu aksesi spesies E.oleifera dan 4 aksesi dari spesies E.guineensis var tenera, Dura, Pisifera, dan Virescens menggunakan primer SAD1 yang menghasilkan fragmen dengan ukuran 1100 bp dan primer SAD2 yang menghasilkan fragmen gen SAD dengan ukuran 600 bp.