BEBERA PA [SOL AT Phytophthuru palmivoru

Transkripsi

1 IDENTIFKASI SIFAT-SIFAT MORFOLOGI DAN MOLEKULER BEBERA PA [SOL AT Phytophthuru palmivoru Pendahuluan SeIain P. pulmivoru, juga dijumpai beberapa spesies Plrylophfhoru yang dapat menyebabkan penyaki t pada kakao se perti P. megukurya (A fri ka Barat), P. capsici (Brazil, negara-negm Amerika Latin lainnya, Kamerun), P. citrophthoru (Brazi I), P- heveue (Malaysia) dm P. megaspermu (Venezuela) yang mengalubatkan berbagai tingkat kerugian (Erwin dan Ribeiro 1996). Di samping terdapat spesies Plrytophthorcr yang berbeda, juga dijumpai keragarnan genetik yang nyata pada P. palmivora, yang merupakan patogen pada lebih dari 150 spesies tanaman diantaranya tanaman kakao, kelapa, durian, karet, nangka, pepaya, jeruk, anggrek, lada, vanili &n manggis (Drenth, ). Oleh karena itu identifikasi spesies dengan mempelajari sifat-sifat morfologi dan molukuler menjadi sangat penting untuk dilakukan. Identi fikasi spesies melaiui studi morfologi cendawan meliputi sifat-sifat aseksual (tip koloni, pembengkakan hfa, produksi dan diameter klamidospora, percabangan sporangiofor, bentuk dan ukuran sporangia, caducity, panjang pedisel dan papila) dan seksual (ukuran anteridia, ukuran oogonia, ukuran oospora) sudah umum dilakukan, sedangkan si fat-sifat rnolekuler belurn banyak dilakukan. Ident ifikasi spesies secara morfologi merni I iki kelemahan karena dapat dipengad oleh Iingkungan, sebal i knya identifi kasi secara molekuler akin menghasilkan infomasi genetik dengm ketepatan yang lebih akurat dan relatif Iebih cepat, dan hasilnya tidak dipengaruhi oleh lingkungan.

2 42 DNA ribosorn (rdna) adalah daerah penyandi genom untuk komponen RNA ribosom. Sekuen DNA ribosom dapat digunakan sebagai alat penting untuk rekonstruksi hubungan kekerabatan, karena setiap unit DNA ribosom terdiri dari gen untuk 18S, 5,8S dan 28s DNA ribosom. Gen-gen ini dipisahkan oleh spclcers yaitu ETS (External Trunscribed Spacer), IGS (Inter-Genic Spacer) dm ITS (Internal Trmcribed Spacer) (Schlotterer 1998). Daerah ITS rdna Phytophthoru dapat diarnplifikasi menggmakan PCR dengan primer ITS 5 dan ITS 4 atau ITS 1 dm ITS 4. HasiI arnplifikasi berupa pita tunggal berukuran lebih kurang 900 bp untuk P. pdmivora, 862 bp untuk P. capsici dan 94 1 bp untuk P. fiuguriae. Cendawan lain khas spesies tumbuhan menghasilkan pit. bendcuran 600 bp dengan primer ini. Hasil PCR setelah didigesti dengan enzim restriksi menghasilkan pita-pita DNA y ang spesifik spesies, sehingga analisis ini clapat digunakan untuk identi fi kasi species (Darmono clan Purwantara 2001 ; C howdappa el al. 2003). Penelitian ini bertujuan untuk melakukan identifikasi species />hyrophthora yang menyerang tanaman kakao di Indonesia. mpotesis yang diajukan &lam penelitian ini adalah penyebab penyakit busuk buah pada tanaman kakao di Indonesia disebabkan ole h beberapa species Plytophlhr~ru. Hipotesis ini berdasarkan pada penelitian clan pustaka sebel urnnya yang mengatakan bahwa penyebab penyalut busuk buah pada tanaman kakao di Indonesia adalah P. paimivora (Purwantara 1987; Sudarmadj i dan Pawimsoemardj o 1990; Sernangun 2000), tetapi beberapa species lain juga dilaporkan sebagai patogen bus& buah di luar negeri (Erwin dm Ribeiro 1996).

3 43 Bahao dan Metode Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mi kroba dan Labratori urn Bioiogi Molekuler dan Immunologi, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Bogor, dari bulan Mei 2002 sampai April Bahan-bahan yang digunakan diantaranya isolat P. palmivora a d enam provinsi (Tabel 51, media PDA, sejumlah bahan-bahan yang diperlukan untuk ekstrasi DNA dan identifikasi molekuier menggunakan ITS. Metode Isolasi. Patogen diisolasi dari buah atau batang kakao sakit dengan cara bagian jaringan buah atau batzing kakao sakit ditanamkan pada buah kakao sehat yang sebelumnya telah dibersihkan menggunakan air yang mengalir dm sterilisasi pemukaan buah dengan alkohol 70 persen, kemudian dibungkus dengan kertas dan diinkubasi pada suhu ruang. Setelah inkubasi selarna tiga hari, patogen diisolasi dari bush kakao sakit dengan cara penanaman jaringan yang diarnbil antara perbatasan jaringan buah sehat dan sakit pa& media PDA. Sampe1 tanah yang diduga rnengandung patogen di baiting dengan buah kakao sehat dan selanj utnya dikerjakan dengan cara seperti dijelaskan di atas. Metode identifikasi Morfologi dam MoIekuler. Beberapa s~fat morfologi yang dipelajari meliputi tipe koloni, pembengkakan hifa, produksi dan diameter klamidospora, percabangan sprangiofor, bentuk dm ukuran sporangia, caducity, panjang pedisel dan papila. Identifi kasi berdssarkan pada kri teria morfologi yang dikemukakan Waterhouse ( I 974% 1974b), Holliday ( 19801, Erwin dm Ribeiro ( 1996), Dxenth dan Sendall (2001). Untuk keperluan ini, isolat ditumbuhkan pada media PDA, dan pengarnstan di Iakukan dengan menggunakan mikros kop yang dilengkapi

4 dengan rnikrometer okuler dan mi krometer obyektif, mikroskop 01 ympus BX5 1 yang dilengkapi kamera, dm kamera Ricoh A50 yang dilengkapi lensa close-up. Pengukuran dimensi sporanga dilakukan pada 60 sporangia yang dipilih secara acak untuk masing-masing isolat. Identi fi kasi berdasarkan si fat molekuler diawali dengan perban yakan miselium, yang di peroieh dengan membiakkan potongan-potongan hi fa yang ditumbuhkan pads media PDB &lam tabung Erlenmeyer sebanyak 100 ml. Setelah diinkubasikan pada suhu rung di atas shaker dengan kecepatan 125 rpm selama 7 hari, miselia disaring dengan menggunakan saringan teh yang telah disteril isasi dengan otoklaf terlebi h dahul u, kemudlan dicuci dengan PBS (Phosphate BGer Saline) sebanyak tiga kaf i untuk rnenghllangkan karbohidrat dari medium cair yang tertinggal atau melekat pada miselia. Miselia &tern- dalam cawan Petri yang berisi kertas saring steril agar cairan yang tersisa pada miseiia &pat terserap oleh kertas saring. Miselia yang didapat selanjutnya digunakan untuk ekstrasi DNA. Ekstraksi DNA cendawan patogen dilaldan menun~t metode Orozco-Castillo et al. (1994) yang dimodifikasi khususnya penambahan PVPP (Polyvinyl Po!y Pyrrol idm) pada waktu penggerusan ke dalam lumpmg porsel i n dan merkaptoetanol ke dalarn bufer ekstraksi (Toruan-Mathius el a/. 1997). Tahapan ke j a meliputi pemecahan dinding sel miselium, dilanjutkan pemisahan DNA dari komponen senyawa lain seprti protein dan senyawa orgamk lainnya melalui tahapan sebagai beri kut:

5 Tabel 5 Daftar isolat P. palmivora asal enam provinsi di Indonesia No. Kode Isolat Asal Isolat Bahan IsoIasi 1 SU-3 Desa Sungai Tahuang Kec.Secanggang Kab. Langkat Prov. Sumatera Utara 2 SU-4 Desa Sayumsabah Kec. Sibolangit Kab. Deli Serdang Prov. Sumatera Utara 3 LP-B Desa Negeri Sakti Kec. Gedong Tataan Kab. Lampung Selatan Prov. Lampung 4 LP-T Desa Negeri Sakti Kec. Gedong Tataan Kab. Lampung Selatan Prov. Lampung 5 JB-B 1 -CIO Kebun BPBP Ciomas, Bogor Prov. Jabar 6 JB-T-CIO Kebun BPBP Ciomas, Bogor Prov. Jabar 7 JB-B LS2 Kebun Layungsari PT. Intergreen Estate, Cianj ur Prov. Jabar 8 JB-BLS4 Kebun Layungsari PTJntergreen Estate, Cianjur Prov, Jabar 9 JB-BLS6 Kebun Lay ungsari PT. Intergreen Estate, Cianjur Prov. Jabar I0 JB-RAP Kebun Rajamandala PTPN VII1 Prov. Jabar 11 JB-BAP Kebun Bunisari PTPN VIII Prov. Jabar 12 JT-R Kebun Renteng PTPN VII Jember Prov. Jatim 13 JT-CP Kebun Puslit Kopi & Kakao Jember Prov. Jatim 14 JT-GC7 Kebun Puslit Kopi & Kakao Jernber Prov. Jatim 15 SS-I3 1 Bonepute, Kotip Palopo Prov. Sulsel 16 SS-B2 bonepute, Kotip Palopo Prov. Sulsel 17 ST-6 Desa Tasahea Kec. Tirawta Kab. Kolaka Prov. Sultra 18 ST-8 Desa Ujung Kec. Lilirian Kab. Soppeng Prov. Sultra 19 ST-9 Desa Dangia Kec. Ladongi Kab. Kolaka Prov. Sultra 20 ST- I 0 Desa Gunung Jaya Kec. Ladongi Kab. Kolaka Prov. Sultra.' dari satu pohon. Tanah ~uah*' Buhh Buh suah Kanker batas Sampel miseliurn sebanyak 0,3 g digerus pada mortar dingin dengan Nz cair dan 0,l g antioksidan PVPP. Bubuk putih (powder) yang didapa~ dimasukkan ke dafarn tabung eppendorf ukuran 2 ml, ditambah bufer ekstraksi 1 ml dan

6 merkaptoetanol I 0 pl, dikocok kuat dan divorteks, dan dipanaskan ddam penangas air (65 C) selarna 30 menit dengan sesekali dikocok. Selanjutnya ditambahkan campuran kloroform : isoamil dkohol (24:l) sebanyak 750 ml, disetimbangkan dan disentrifuse pada I rpm selama 10 menit. Cairan jernih (supemtan) yang ada di bagan atas diarn bil dengan hat i-hati supaya endapan tidak terbawa, dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf yang baru, clan disetimbangkan dengan menambah bufer ekstraksi. (penambahan kloroform : isoamil alkohol (24:l) sebanyak 750 ml dilakukan dua kaii). Kemudian ditambahkan isopropanol dingin 1 ml dm digoyang halus sampai tampak endapan DNA dan disimpan di dalam freezer -20 C selama 30 menit. Larutan disetirnbangkan dengan menambah isopropanol dingin clan disentri fuse pada rpm selama 10 menit untuk mendapatkan pellet DNA. PelIet dicuci dengan alkohol dingin 70 % sebanyak 500 PI. Tabung Eppendorf dikeringkan pada posisi terbali k di atas kertas serap seiama lebi h kurang 1 5 meni t. Pel let yang didapat selanjutnya dilarutkan dengan larutan TE dan disimpan pada jreezer -2U C sebagai stok DNA, untuk dipakai dalam analisis menggunakan teknik ITS, RAPD dan AFLP. Penetapan konsentrasi DNA dilakukan dengan cara membandingkan dengan h DNA dengan konsentrasi 536 pdrnl. mendapatkan working solution 25 n&1. Selanjutnya DNA diencerkan untuk Ampli fikasi DNA dilakukan dengan rnenggunakan primer spesifik ITS 4 dan ITS 5 pada reaksi PCR yang meliputi tahapan denaturasi cetakan DNA, annealing primer dan polimerasi. Tahapan ini berulang beberapa kali sehingga dicapai hasil amplifikasi yang tinggi. Sekuen primer ITS 4 dm ITS 5 disajikan pa& Tabel 6.

7 Tabel 6 Sekuen primer ITS4 dan ITS 5 No. Nama primer Sekuen oligonukleotida (5'--3') Pustaka 1. ITS 4 TCCTCCGCTTATTGATATGC White et ul. (1990) 2. ITS 5 GGAAGTAAA AGTCGTAACAAGG White er al. (1990) Campuran reaksi PCR yang terdiri atas berbagai kornponen untuk analisis ITS dapat dilihat pada Tabel 7. Campuran reaksi tersebut dimasukkan ke &lam tabung Eppendorf steril ukuran 0,5 m1, dihomogenkan, dan ditambah 20 pl mineral oil. PCR diiakukan pada Thennocycler ~m~litron@- 1 dengan program tahap denaturasi 94 C selarna 1 menit tahap anneuling 42 C seiama 1 menit dan tahap externion 72OC selama 2 menit kemudian ditambah 72 C selama 4 menit. Reaksi PCR berlangsung berulanghli sebanyak 35 siklus. Untuk mengetahui keberhasilan amplifihsi DNA, hasil PCR dielektroforesis pada gel agarose 2%, dengan tegangan 50 V, selarna 1 jam. Gel kemudian difoto pada transiluminator W. Sarnpel hasil PCR kemudian didigesti dengan enzim restnksi Alu I dan Msp I pada 37 C selarna 1 jam, serta iruq I pada suhu 65 C selama 1 jam. Hasil digesti selanjutnya dielektroforesis pada gel agarose 2%, 50 V, selama 1 jam, kemudian difoto pa& transiluminator UV.

8 Tabel 7 Campuran reaksi PCR mtuk analisis ITS Komponen Reaksi 1 x (PI) Buffer lox 5 Primer ITS 4 (1 0 p rnol/pl) 1 Primer ITS 5 (1 0 p mol/yl) 1 Taq polimerase (5U/p1) 0,4 DNA template (25 nglpl) 4 Jumlah 50 Sifat-Sifat Morfologi Isoht-Isola t P. palmiwra Sebanyak 20 isolat yang diisolasi dari buah dan batang kakao sakit serta dari tanah di sekitar pertanaman kakao, koloni cendawm penyebab penyakrt busuk buah pada tanaman W o yang berasal dari beberapa lokasi daerah penghasil kakao di Indonesia, yaitu Sumatera Utara (Sumut), Lampung, Jawa Barat (Jabar), Jawa Timur (Jatim), Sulawesi Selatan (Sulsel), dm Sulawesi Tenggara (Sultra), yang dipelajari ddarn penelitian ini, mempunyai sifat yang sama walaupun disubkulturkan krkalikali, yaitu tumbuh lambat pada PDA, berbentuk bulat dengan pinggiran tidak rata, seperti kapas, berwarna putih, jika dipotong-potong menggunakan skalpel term agak kenyal (Gambar 4).

9 Siikt1Sif~t Molekuler ~ ~ 9. pukbm h f Bfeksi dihkukm den= txga iimpw DNA 20 isoh p wp den- Ppimer ITS 41bn rss 5 rner@gmabmm&pgr, kemudian gel Wse 2 %. AmpMkasi DNA 20 hiat pmgen nmgldlkati pi?a DNA tunggai berukurm lehih hmg 900 bp (Gslmba 5). SekIah dg&i d- mi Ag I didapt pita-pita ymg bwdam * 500, I60 dan bp9 - diingm enzim restriksi Mp I di dqat pitst-pita yang bemhm.soq dan 400 bp, dm ckm~ Tq 1 di dapat pita-pim benhm k 300,280,150 dan LDB bp (Gmbqr 6).

10 Tabei 8 Karakteristik aseksual dua pduh isolat P. palmivora Klamidospora Sporangia No. lsolata' Pembeng Produksi 0 (pm) Cabang Cadu Panjang kakan c) Sporangiofor ~ous~) pedisel hi fab) (pm) I. SU Simple LP-B +I S& + 4. LP-T sda + 5. JB-BLS S& i- 6. JB-BLS4 +/- -t sda + 7. JB-BLS sda + 8. JB-B-Cio sda + 9. JB-T-Cio sda JB-BAP sda JB-RAP sda JT-GC sda JT-CP t / sda JT-R sda t 15. SS-B1 +/ sda SS-B2 -t sda i 17. ST sda i- 18. ST-8 +/ sda ST-9 +/ sda ST-10 +I sda + "' Kode isolat lihat Tabel 5. "- Tidak ada pembengkakan hifa; +/- adahidak ada pembengkakan hi fa "I + Klamidospora di produksi " + Sporangia caducous.

11 Tabel 9 Bentuk, ukuran dan papila sporangia dua puiuh isolat P. palmivora No. lsolata) &ntukb' Panjang Lebar (B) Rerata LIB Papila c) (L) (urn) (ym) (vm) rasio I. SU-3 OVO; GI x42 1,3-I,4 P 2. SU-4 Ova; GI x40 1,2-1,4 P 3. LP-B OVO; Glo x38 1,4-1,8 P 4. LP-T Ovo; Glo x38 1,8-1,9 P 5. 3B-BLS2 OVO; Glo x38 1,4-1,s P 6. JB-BLS4 Ova; Glo x38 1,2-1,7 P 7. JB-BLS6 Ova; Glo x38 1,4-I,5 P 10. JB-BAP Ova; Glo x34 1,4-1,7 P 11. JB-RAP Ova; Glo x38 1,6-1,7 P 12. JT-GC7 Ova; G10;Obp x34 1,4-1,7 P 13. JT-CP OVO; Glo x32 1,6-I,7 P 14. JT-R Ova; Glo x38 1,4-1,7 P 15. SS-B 1 OVO; G10;Obp x38 1,4-1,5 P 16. SS-B2 O~O x34 1,4-1,6 P 18. ST-8 O~Q; G10;Obp x38 1,6-1,9 P 19. ST-9 OVO; Glo x34 1,5-1,8 P 20. ST-10 OVO; GI x38 I,7-2,O P ") Kode isolat lihat Tabel 5. b' Ovo = Ovoid; Glo = Globose; Obp = Obpyrifom; Ellip = Elf ipsoid "'P = Papila.

12 Gambar 5 Pita DNA tunggal (f 900) bp hasil amplifikasi DNA dua puluh isolat P. pulnzivuru dengan primer ITS 4 dan ITS 5. (M) Marker, (1) isolat SS- B2, (2) JB-BLS6, (3) JT-CP, (4) ST-10, (5) ST-8, (6) JT-R, (7) JB-T- CIO, (8) JB-BI. -CIO, (9) ST-9, (10) ST-6, (I 1) SU-4, (12) SU-3, (13) JB- BLS2, (14) JB-BLS4, (1 5) SS-B 1, (16) JB-BAP, (1 7) LP-8, (1 8) LP-T, (19) JT-GC7, dan (20) isolat JB-RAP. Detuil isolat lihat Tabel 5. Gambar 6 Pita-pita berukuran f 500, 160, 155 bp hasil restriksi dengan enzirn AIu I (atas); pita-pita berukuran dan 400 bp hasii restriksi dengan enzirn ~Wsp I (tengah); pita-pita berukuran f 300, 280, 150, dan 100 bp hasil restriksi dengan enzirn I'uy I (bawah); M = marker; 1-20 adalah nomor isolat P. pulmrvoru seperti pa& Gambar 5.

13 Pem ba hasan Tipe koloni dua puluh isolat P. paimivora pada media PDA sama yaitu berbentuk bulat dengan pinggiran tidak rata seperti kapas dan benvarna putih. (Garnbar 4). Menurut Pmtara (1987) koloni P. palmivora benvama putih, tumbuh sangat baik pada media CMA clan LBA, dengan sporangia lebih banyak diproduksi pada media LBA, tetapi tumbuh lebih lambat dengan sporangia yang dihasilkan lebih sedikit pada media PDA dan VJA. Hendrawati (1997) mefaporkan bahwa koloni beberapa isolat P. pu/mivora asal kakao yang dipelajarinya berbentuk bulat dengan pinwran tidak rata, berwarna putih, dengan hifa tampak lurus, jika dipotong menggunakan skal pel akan terasa ken yal sehingga agak menyulitkan keti ka &an disubkulturkan pada media kaldu kentang. Variasi di antara dua puluh isolat yang dipelajari sangat sedikit, terutama te j adi pada bentuk hi fa dan diameter kiamidospora, sedangkan semua isolat memproduksi klamidospora berkntuk bulat, terminal dan beberapa interkalar, dengan cabang sporangiofor simple sympodial, caducous dengan pedisel berukuran 44 pm. Pedisel dengan ukuran tersebut di katagorikan sebagai pedisel y ang pendek (Waterhouse 1974 a). Pada umumnya sporangia berbentuk ovoid atau buah per, dengan satu papila yang jelas, banyak juga yang berbentuk globose dan ada juga beberapa isolat yang mempunyai bentuk obpyrifonn clan ellipsoid, dengan A m sporangia x pm. Menumt Semangun (2000), sporangia P. paimivora penyebab busuk buah kakao

14 54 berbentuk buah pir, dengan ukuran 3060 x pm. Sporangiofor cendawan patogeni k P. pa~mivora tumbuh syrnpodiaf, dengan sporangianya berbentuk ovoid, ellipsoid atau obpyrifom, mempunyai papila, I/b rasio 1,6-2,0, dengan ukuran sporangia x 2040 pm. Variasi ukuran in; diantaranya disebabkan oleh perbedaan kondsi mdum, inang, umur biakan, kelembaban dan cahaya (Waterhouse 1974a; Holliday 1980; Erwin dan Ribeiro 1996; Drenth dan Sendall 200 1). Hasil amplifikasi DNA dua puluh isolat dengan primer ITS 4 clan ITS 5 didapat pita tunggal berukuran sekitar 900 bp. Kernudian dilanjutkan digesti hgmen DNA ini dengan enzim restriksi Alu I, Msp I dm Taq I sehingga dihasilkan fragmenfragmen berukuran sekitar 500, 160, 155 bp untuk Aiu'I; 500,400 bp untuk Msp I; dm 300, 280, 150, 100 bp untuk 7uq I. Sifat-sifat molekuler tersebut rnerupakan sifatsifat yang dimiliki oleh cendawan patogen P. pulm~vora (Darmono dm Purwantara ; Punvantara dan Darmono 2002). Berdasarkan siht-sifat morfolog dan molek~der di atas maka dapat diidentifi kasi bahwa dua puluh isolat tersebut adalah P. pulmivora sebagai penyebab penyakit busuk buah dan kanker batang kakao di Indonesia. HasiI ini mendukung laporan Sudarmadji dan Pawirosoemardjo ( 1 990) bahwa penyakit utarna pada tanaman kakao di Indonesia dewasa ini adaiah busuk buah, kanker batang dan hawar daun yang dlsebabkan oleh P. pa~mrvora (Butler) Butler (MFI).

15 Kesimpulan Dm puluh isolat yang dikumpulkan clan sentra produksi kakao di Indonesia menunjukkan sifat-sifat mofologi yang relatif sama yaitu turnbuh larnbat pada media PDA, koloni berbentuk bulat dengan pinggiran tidak me&, berwarna putih, sepert! kapas, dm apabila diptong-potong menggmakan skalpel terasa agak kenyal. S porangia kebany &an berbentuk buah per (ovoid), caduceus, pedisel pendek, l/b rasio 1,6-2,O dan kiamidospora berbentuk globose terminal dan beberapa interkalar. Arnpli fikasi DNA dua puluh isolat yang dipelajari darn penelitian ini dengan primer ITS 4 dan ITS 5 rnenghasilkan pita tunggal berukuran,+ 900 bp, dan setelah digesti dengan enzim restriksi Alu I didapat pita-pita yang berukuran f 500, I60 dan 155 bp, dengan enzim restriksi Msp 1 didapat pita-pita yang berukuran f 500 dan 400 bp, dengan enzim resb"ik~i Taq I didapat pita-pita berukuran f 300, 280, 150 dan 100 bp yang merupakan karakteristik molekuler spesies P. plmivora Berdasarkan si fat-si fat morfblogi dan molekuler di atas maka terbukti bahwa isolat-isolat tersebut sernuanya adalah isolat P. palmrvora, bukan spesies I'hylophfhoru lain sebagai penyebab penyakit busuk buah dan kanker batang kakao di Indonesia.