Rul Afiyah Syarif, Mae Sri Hartati Wahyuningsih, Mustofa, Ngatidjan

Transkripsi

1 Artikel Penelitian Aktivitas Penghambatan Ekstrak Terpurifikasi Daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia [Hemsley] A.Gray) pada Pertumbuhan Plasmodium falciparum dan Polimerisasi Heme Rul Afiyah Syarif, Mae Sri Hartati Wahyuningsih, Mustofa, Ngatidjan Bagian Farmakologi dan Terapi, Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Abstrak Pendahuluan: Kembang bulan (T. diversifolia [Hemsley] A.Gray) merupakan tanaman yang memiliki potensi antiplasmodium, salah satunya melalui efek penghambatan polimerisasi heme yang juga merupakan mekanisme kerja obat antimalaria klorokuin. Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji aktivitas antiplasmodium ekstrak terpurifikasi kembang bulanpada P. falciparum dan penghambatannya pada polimerisasi heme. Metode: Penelitian eksperimental laboratorium yang dilakukan in vitro pada P. falciparum strain FCR-3 dengan rancangan post-test control group only design. Ekstrak terpurifikasi dibuat dengan cara memisahkan ekstrak metanol T. diversifolia (Hemsley) A.Gray menggunakan pelarut eter sehingga diperoleh ekstrak larut eter dan tidak larut eter. Kedua ekstrak dengan berbagai konsentrasi dilakukan uji aktivitas antiplasmodium pada P. falciparum strain FCR-3 dan penghambatan polimerisasi heme. Aktivitas antiplasmodium dan penghambatan polimerisasi heme dinyatakan dengan nilai IC 50. Hasil: Uji aktivitas antiplasmodium pada P. falciparum strain FCR-3 didapatkan nilai IC 50 ekstrak larut eter2,60±0,70 µg/ml dan ekstrak tidak larut eter ,9±34.430,75 µg/ml (p=0,02). Ekstraklarut eter menghambat polimerase heme dengan nilai IC ,02±73,5 µg/ ml. Kesimpulan: Ekstrak larut eter daun T. diversifolia (Hemsley) A.Gray mempunyai aktivitas antiplasmodium yang lebih baik daripada ekstrak tidak larut eter. Ekstrak larut eter mempunyai kemampuan menghambat polimerisasi heme. Kata kunci: Tithonia diversifolia, antiplasmodium, Plasmodium falciparum. Korespondensi: Rul Afiyah Syarif 228

2 Inhibitory Activity of Purified Extract of Tithonia diversifolia (Hemsley) A.Gray Leave on Plasmodium falciparum Growth and Heme Polymerization Rul Afiyah Syarif, Mae Sri Hartati Wahyuningsih, Mustofa, Ngatidjan Pharmacology and Therapy Department, Faculty of Medicine,Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Abstract Introduction: Tithonia diversifolia (Hemsley) A.Gray is a potential antiplasmoidal plants with hame polymerization inhibition mechanism, similar to the mechanism of antimalarial drug chloroquine. This research aimed to study the antiplasmodial activity of purified extract of T. diversifolia (Hemsley) A.Gray leave against Plasmodium falciparum and its inhibition on heme polymerization. Method: This was an in vitro experimental study on P. falciparumfcr-3 strain using post-test control group only design. Purified extract was made by separating methanol extract of T. diversifolia (Hemsley)A.Gray leave using ether to get ether-soluble and ether-insoluble extracts. A serial concentration of those extracts were tested antiplasmodial activity on P. falciparum strain FCR-3 and haem polymerization inhibition. Antiplasmodial activity and haem polymerization inhibition were stated as IC 50. Result: Ether-soluble extract of T. diversifolia (Hemsley) A.Gray leave inhibited Plasmodium falciparum growth at IC 50 2,60 ± 0,70 µg/ml whereas ether-insoluble extract at ,9 ± 34430,75 µg/ml (p=0,02). Ether-soluble extract of T. diversifolia (Hemsley) A.Gray leave inhibited haem polymerization at IC ,02 ± 73,5 µg/ml. Conclusion: Ether-soluble extract of T. diversifolia (Hemsley) A.Gray leave had better antiplasmodial activity against FCR-3 strain of Plasmodium falciparumthanether-insoluble extract. Ether-soluble extract of T. diversifolia (Hemsley) A.Gray leavewas able to inhibit haem polymerization. Keywords: Tithonia diversifolia, antiplasmodial, Plasmodium falciparum. Pendahuluan Malaria masih menjadi masalah kesehatan di dunia dan berkontribusi terhadap juta kasus dan hampir 1 juta kematian setiap tahunnya. Plasmodium falciparum merupakan penyebab tersering malaria berat dan kematian. 1 Berbagai usaha penanggulangan malaria telah dilakukan, namun hingga saat ini penyebarannya tetap tinggi seiring meningkatnya prevalensi P. falciparum yang resisten terhadap obat antimalaria kuinolon, terutama klorokuin,dan nyamuk Anopheles yang resisten terhadap insektisida.salah satu strategi untuk mengatasi masalah tersebut adalah menemukan antimalaria baru yang berasal dari bahan alam maupun sintetis. Klorokuin merupakan antimalaria schizontocid dan menghambat polimerisasi heme secara in vitro. Plasmodium pada tahap schizon secara aktif mendegradasi hemoglobin di vakuol digesti dan menghasilkan pigmen hemozoin. 2,3 Proses degradasi hemoglobin akan menghasilkan heme yang bersifat toksik bagi Plasmodium dan globin sebagai sumber asam amino untuk pertumbuhannya. Agar tidak bersifat toksik, Plasmodium akan mempolimerisasi heme menjadi hemozoin. 2 Tanaman kembang bulan (Tithonia diversifolia [Hemsley] A.Gray) merupakan salah satu tanaman obat yang mempunyai khasiat mencegah dan mengobati malaria. 4 Tanaman ini secara empiris sudah digunakan untuk mengobati malaria di Kenya Tengah serta Sao Tome dan Principe. 5 Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun T. diversifolia (Hemsley) A.Gray mempunyai aktivitas antiplasmodium pada P. falciparum strain FCR-3, yaitu strain yang resisten klorokuin, lebih baik dari kloroform dengan nilai IC 50 ekstrak metanol 8,12 ± 0,53 µg/ml dan ekstrak kloroform 10,64 ± 2,55 µg/ml. 5 Akan tetapi, penelitian lebih lanjut tentang efek ekstrak larut eter dan ekstrak tidak larut eter daun T. diversifolia (Hemsley) A.Gray yang diperoleh dengan cara memisahkan senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol menggunakan solven eter terhadap pertumbuhan P. falciparum strain FCR-3 belum pernah dilakukan, begitu pula terhadap penghambatan polimerisasi heme. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mengkaji aktivitas ekstrak larut eter dan tidak larut eter dari daun T. diversifolia (Hemsley) A.Graypada P. falciparum strain FCR-3 dan penghambatan 229

3 polimerisasi heme. Hasil penelitian diharapkandapat memberikan bukti ilmiah tentang efek dan mekanisme kerja T. diversifolia sebagai antiplasmodium. Metode Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoriumpada P. falciparum secara in vitro dengan rancangan post-test control-group only design dan telah mendapat persetujuan dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan FK Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Bahan Daun T. diversifolia [Hemsley] A.Gray diambil dari Pakem Sleman, Yogyakarta, dan telah dideterminasi di Bagian Biologi Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Pembuatan Ekstrak Terpurifikasi Daun T. diversifolia [Hemsley] A.Gray Ekstrak terpurifikasi dibuat dengan cara memisahkan senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol menggunakan pelarut eter secara sentrifugasi sehingga didapatkan ekstrak larut dan tidak larut eter. Sebanyak 500 gram serbuk kering daun diekstraksi dengan cara maserasi disertai pengadukan selama 24 jam pada suhu kamar menggunakan 1 L metanol. Filtrat disaring dan ampasnya dimaserasi kembali sebanyak 3 kali dengan cara yang sama. Filtrat diuapkan hingga diperoleh ekstrak metanol kental. Ekstrak metanol selanjutnya dipisahkan/dipartisi menggunakan pelaruteter dan disentrifus pada temperatur 5 o C, 5000 rpm (Sentrifus [Hitachi 18PR/5, automatic high speed refrigerated]) selama 10 menit sehingga diperoleh dua ekstrak, yaitu ekstrak larut eter dan ekstrak tidak larut eter. Semua hasil pemisahan/partisi dimonitor dengan KLT (kromatografi lapis tipis). Hasil partisi ekstrak metanol, yaitu ekstrak larut eter dan tidak larut eter, selanjutnya diuji aktivitas antiplasmodiumnya. Ekstrak yang menunjukkan aktivitas antiplasmodium terbaik kemudian dilakukan uji mekanisme aksi antimalaria, yaitu uji penghambatan polimerisasi heme. Penyiapan Larutan Uji Ekstraklarut eter dan tidak larut eter masing-masing ditimbang seberat 5 mg kemudian dilarutkan dalam 100 µldimetil-sulfoksida (DMSO) sehingga didapatkan konsentrasi 50 mg/ml. Larutan ini sebagai larutan stok. Selanjutnya, dibuat seri konsentrasi 0,25 12,5 ìg/ml dengan cara mengencerkan larutan stok secara serial menggunakan media RPMI Uji Aktivitas Antiplasmodium Uji ini dilakukan menurut Contreras, et al 6 Setiap sumuran dalam 96-wellmicroplate diberi 100 ìl medium komplet yang mengandung serum 10%, hematokrit 3%, dan parasitemia 2% yang telah disinkronisasi dengan sorbitol 5%. Sebanyak 100 ìl ekstrak larut dan tidak larut eter berbagai konsentrasi dimasukkan ke dalam sumuran. Setiap dosis dibuat triplikat. Parasit dalam media RPMI tanpa senyawa uji sebagai kontrol negatif. Mikroplat diinkubasi dalam inkubator 5% CO 2 pada suhu 37 o C selama 72 jam. Setelah inkubasi berakhir, tiap sampel dibuat sediaan apus tipis dan diwarnai dengan Giemsa kemudian dihitung persentase parasitemia dengan cara menghitung jumlah eritrosit yang terinfeksi parasit dari sejumlah 1000 eritrosit menggunakan mikroskop cahaya. Persentase penghambatan dihitung dengan membandingkan parasitemia senyawa uji dengan kontrol negatif. Aktivitas antiplasmodium dinyatakan dalam IC 50 yang diperoleh dengan menganalisis hubungan antara konsentrasi senyawa uji dengan persentase penghambatan dengan analisa log probit program SPSS versi 13. Uji Penghambatan Polimerase Heme Uji ini dilakukan menurut metode Bassilico 7 Sebanyak 100 µl hematin 1 mm dalam NaOH 0,2 M dan 50 µl senyawa uji dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf. Akuades sebagai kontrol negatif. Asam asetat glasial 100% sebanyak 50 µlditambahkan untuk memulai reaksi polimerase, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam, disentrifus 8000 rpm selama 10 menit. Setiap konsentrasi yang diuji, dibuat duplikat. Supernatan dibuang sedangkan endapan dicuci 200 µl DMSO dan disentrifus 8000 rpm selama 10 menit. Pencucian ini dilakukan 3 kali. Endapan dilarutkan 200 µl NaOH 0,1 M. Sejumlah 100 µl larutan tersebut dipindah ke microplate 96 sumuran dan dibaca absorbansi dengan Elisa Reader pada panjang gelombang 405 nm. Kadar â-hematin kelompok yang diberi senyawa uji ditentukan dengan membandingkan absorbansi kelompoktersebut dengan kurva standar, sedangkan nilai IC 50 penghambatan polimerase dihitung dengan analisa log probit program SPSS versi 13. Analisis Data Untuk mengetahui perbedaan aktivitas antiplasmodium antara ekstraklarut eter dan tidak larut eter dilakukan uji statistik t-test (α=0,05). Hasil Senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol T. diversifolia (Hemsley) A.Gray dipisahkan dengan solven eter dan diperoleh ekstrak larut eter dan tidak larut eter berturut-turut seberat 20,80 gram (4,16%) dan 3,52 gram (0,70%). Untuk mengetahui bahwa senyawa-senyawa yang terkandung dalam kedua ekstrak tersebut terpisah dan berbeda dideteksi dengan KLT. Fase diam yang digunakan adalah silika gel GF 254, sedangkan fase geraknya untuk partisi adalah heksan dan etil-asetat dengan perbandingan 1:1. Didapatkan pemisahan yang sempurna antara ekstrak larut dan tidak larut eter ditandai dengan tidak adanya atau sedikit kesamaan bercak antara kedua ekstrak tersebut ketika dilihat di lampu 230

4 UV 254 dan 366. Ekstrak tidak larut éter yang diteteskan ke KLT tetap diam tidak bergerak dalam fase gerak dan sebaliknya dengan ekstrak larut éter. Bercak-bercak tersebut merupakan gambaran komponen senyawa yang terkandung dalam kedua ekstrak. Deteksi dengan serium sulfat menunjukkan bahwa ekstrak larut eter mengandung senyawa terpenoid (Gambar 1). Uji aktivitas antiplasmodium pada P. falciparum strain FCR3 didapatkan bahwa pada konsentrasi terendah (0,25 µg/ ml) ekstrak larut dan tidak larut eter secara berturut-turut menghambat pertumbuhan parasit sebesar 10,9% dan 3,8%, sedangkan pada konsentrasi tertinggi (12,5 µg/ml) keduanya menghambat sebesar 85,19% dan 10,82%. Penghambatan pertumbuhan P. falciparumdengan nilai IC 50 untuk ekstrak A B C Hexan : EtOAc (1:1,v/v) Hexan : EtOAc (1:1,v/v) larut eter adalah 2,60 ± 0,70 µg/ml sedangkan tidak larut eter >10 µg/ml, yaitu ,9 ± ,75 µg/ml (Tabel 1). Berdasarkan ujit-test hal ini berbeda secara bermakna (p =0,02). Berdasarkan nilai IC 50, Rain,et al 8 menggolongkan suatu ekstrak tanaman mempunyai efek antiplasmodium sangat baik bila nilai IC 50 <0,1 µg/ml; baik (aktif) bila IC 50 0,1-1 µg/ml; cukup sampai baik bila IC 50 1,1-10 µg/ml; lemah bila IC µg/ml; sangat lemah bila IC µg/ml, dan tidak aktif bila IC 50 >100 µg/ml, sedangkan Muñozmenggolongkan aktivitas antiplasmodium suatu ekstrak sangat baik bila nilai IC 50 kurang dari 5 µg/ml, baik bila IC µg/ml, dan tidak mempunyai aktivitas antiplasmodium bila IC 50 >10 µg/ml. 5 Tabel 2. Rata-rata Kadar β-hematin, Persentase Penghambatan Polimerisasi Heme, dan IC 50 Penghambatan Polimerisasi Heme Ekstrak Larut Eter Daun Kembang Bulan (T. diversifolia [Hemsley] A.Gray) Konsentrasi Rata-rata Kadar Rata-rata Rata-rata Ektrak Larut β-hematin (mm) Pengham- IC 50 ± SD Eter (µg/ml) batan (%) (µg/ml) 12,5 6,97±0,46 17,08±5,46 68,02±73,5 50 4,44±0,49 47,17±5, ,34±0,35 48,36±4,09 Kontrol 8,4±0, Gambar 1. KLT Partisi: 1. Ekstrak eter [larut eter] dan 2. Ekstrak tidak larut eterdaun T. diversifolia (Hemsley) A.Gray Keterangan: Fase diam: silika gel GF 254 ;Fase gerak: perbandingan n- heksan : etil asetat = 1:1 (v/v) Deteksi: A. UV 254, B. UV 366, C. Cerium sulfat. Ekstrak larut eter sebagai senyawa yang menunjukkan aktivitas antiplasmodium lebih baik daripada ekstrak tidak larut eter selanjutnya dilakukan uji penghambatan polimerisasi heme. Kadar hematin, persentase penghambatan polimerisasi heme, dan konsentrasi ekstrak eter daun T. diversifolia (Hemsley) yang mampu menghambat polimerisasi heme 50% disajikan pada Tabel 2. Ekstrak larut eter mempunyai kemampuan menghambat polimerase heme dengan nilai IC ,02±73,5 µg/ml. Diskusi Ditinjau dari kepolarannya, eter bersifat nonpolar sehingga akan menarik lebih banyak senyawa tidak larut air dan sedikit senyawa yang larut air. Hasil penapisan Tabel 1. Rata-rata Persentase Parasitemia, Penghambatan Pertumbuhan P.falciparum dan IC 50 pada Pemberian Ekstrak Larut Eter dan Tidak Larut Eter Daun Kembang Bulan (T. diversifolia [Hemsley] A.Gray) dalam Berbagai Konsentrasi Konsentrasi Ekstrak Larut Eter Ekstrak Tidak Larut Eter (µg/ml) Rata-rata Rata-rata Rata-rata Rata-rata Rata-rata Rata-rata Parasitemia Penghambatan IC 50 ±SD Parasitemia Penghambatan IC 50 ± SD (%±SD) (%±SD) (µg/ml) (%±SD) (%±SD) (µg/ml) 0,25 12,88±1,25 10,90±8,68 2,60±0,70 10,93±0,03 3,89±0,31 >10 0,5 12,91±0,73 10,74±5,05 10,75±0,05 5,47±0,46 2,5 11,48±1,96 20,63±13,52 10,49±0,12 7,79±1,09 5 2,42±1,07 83,23±7,42 10,27±0,02 9,68±0,18 12,5 2,14±0,59 85,19±4,06 10,14±0,08 10,82±1,68 Kontrol 14,46±0, ,37±0,

5 menunjukkan bahwa ekstrak air daun T. diversifolia (Hemsley) A.Graymengandung flavonoid,tanin, 9,10 dan alkaloid. 9 Ekstrak metanolnya mengandung flavonoid, tanin, terpenoid, glikosida, fenol, saponin, dan alkaloid. 10 Selain itu, tumbuhan suku Compositae ini termasuk tumbuhan yang kaya dengan minyak atsiri. Senyawa yang terkandung dalam minyak atsiri bisa berupa terpene, yaitu monoterpen dan seskuiterpen.tanin, saponin, fenol, glikosida dan flavanoid merupakan senyawa yang larut air atau polar, sedangkan minyak atsiri bersifat nonpolar. Berdasarkan deteksi dengan serium sulfat dalam penelitian ini, ekstrak larut eter daun T. diversifolia (Hemsley) A.Gray terkandung terpenoid, suatu senyawa yang larut eter dan tidak larut dalam air. Terpenoid dalamtanaman merupakan zat beracun untuk melindungi diri dari serangga,herbivora, dan mikroba patogen. 11 Dengan demikian T. diversifolia (Hemsley) A.Gray mempunyai aktivitas antiplasmodium karena mengandung senyawasenyawa tersebut. Peneliti lain mendapatkan bahwa ekstrak eter kembang bulan (T. diversifolia [Hemsley] A.Gray) mempunyai IC 50 sebesar 0,75 ìg/ml pada P. falciparum strain FCA dan 0,83 ìg/ml pada strain FCB Perbedaan nilai IC 50 studi ini dengan penelitian tersebut diduga akibat perbedaan strain P. falciparum yang digunakan, bagian tanaman yang diuji, tempat pengambilan sampel dan metode pembuatan ekstrak. Sebagai contoh, Goffin, et al 12 mengambil semua bagian tanaman yang ada di permukaan tanah sebagai sampel uji, sedangkan penelitian ini hanya mengambil daunnya saja. Peneliti tersebut,juga mendapatkan bahwa senyawa aktif yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antiplasmodium dalam ekstrak eter tanaman ini adalah seskueterpen lakton tagitinin C, namun komponen-komponen minor lainnya kemungkinan memiliki aktivitas antiplasmodium. Mekanisme penghambatan polimerase heme atau pembentukan hemozoin merupakan salah satu mekanisme kerja antimalaria. Mekanisme kerja antimalaria lainnya, antara lain menghambat/mengganggu sistein protease, glikolisis, sintesis protein, RNA dan DNA, pengaturan siklus sel, serta fungsi mitokondria. 13 Polimerisasi heme berlangsung dalam vakuola digesti P. falciparum yang bersuasana asam sebagai bentuk pertahanan Plasmodium mengatasi heme teroksidasi (hematin). Heme (hematin) atau ferriprotoporfirin IX (FPIX) bersifat toksik tehadap membran biologis dan enzim parasit. 2 Heme ini terbentukketika P. falciparum mendegradasi hemoglobin sebagai sumber nutrisinya di dalam vakuola digesti. 2,12 Agar tidak bersifat toksik bagi Plasmodium, hematin akan dipolimerisasi membentuk hemozoin (β-hematin). Penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak larut eter kembang bulan (T.diversifolia) menghambat polimerisasi heme secara in vitro dengan nilai IC ,02±73,5 µg/ml. Obat antimalaria golongan kuinolin yang awalnya ditemukan dalam tanaman Chincona, yaitu kuinin, klorokuin, kuinidin, dan meflokuin, juga menghambat polimerisasi heme secara in vitro. Penghambatan ini diduga berkaitan dengan akumulasi obat di vakuola digesti sebagaitempat polimerisasi heme berlangsung karena semakin tinggi akumulasi obat dalam parasit semakin besar daya hambat polimerase heme. 14 Klorokuin mampu menghambat polimerisasi heme karena zat tersebut membentuk komplek klorokuin-heme dalam vakuola digestif, mengakibatkan akumulasi heme bebas yang bersifat toksik bagi Plasmodium,demikian pula yang terjadi pada pemberian artemisinin. Kemampuan artemisinin mengikat heme mengakibatkan polimerisasi heme terhambat. 2 Dengan demikian aktivitas antimalaria ektrak larut eter dari ekstrak metanol kembang bulan (T.diversifolia) terjadi karena kemampuannya menghambat polimerase heme dan kemungkinan kemampuannya berakumulasi dalam vakuola digestive. Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan dengan menggunakan senyawa hasil fraksinasi ekstrak eter kembang bulan (T.diversifolia), baik untuk uji aktivitas antiplasmodium, sitotoksisitas, maupun mekanisme kerja lainnya sehingga akan diketahui senyawa murni yang berefek antiplasmodium dan aman digunakan. Kesimpulan Ekstrak larut eter T. diversifolia (Hemsley) A.Gray memiliki aktivitas antiplasmodium yang lebih baik daripada ekstrak tidak larut eter dengan nilai IC 50 2,60 ± 0,70 µg/ml. Ekstrak larut eter mempunyai kemampuan menghambat polimerisasi heme dengan nilai IC ,02±73,5 µg/ml. Ucapan Terima Kasih Peneliti mengucapkan terimakasih kepada Badan Litbangkes Depkes RI yang telah memberikan dana penelitian melalui Dana Risbin Iptekdok, dan kepada Dr.dr. Mahardika Agus Wijayanti, DTM&H, M.Kes atas bimbingannya, serta Ibu Rumbiwati yang telah membantu penelitian ini. Daftar Pustaka 1. Niles JC, DeRisbi JL, Marlwtta MA.Inhibiting Plasmodium falciparum growth and heme detoxification pathway using hemebinding DNA aptamers. PNAS. 2009; (Early Edition): MehlhornH. Encyclopedia of parasitology, 3rded. New York: Springer; Sigala PA, Crowley JR, Hsieh S, Henderson JP, Goldberg DE. Direct tests of enzymatic heme degradation by the malaria parasite Plasmodium falciparum. J Biol Chem.2012 Nov 2; 287(45): GraceNN, Rainer BW, Barbara G, Erie NL, Victoris N. Utilization of weed species as sources of traditional medicines in Central Kenya. Lyonia. 2004;7(2): Syarif RA, Wahyuningsih MSH, Mustofa, Ngatidjan, Kurniawan H, Al Hilal SR. Aktivitas antiplasmodium in vitro ekstrak kembang bulan (Tithonia diversifolia [Hemsley] A.Gray)terhadap Plasmodium falciparum. Majalah Obat Tradisional. 2008;13(43): Contreras CE, Rivas MA, Dom ýnguez J, Charris J, Palacios M, Bianco, et al. Stage-specific activity of potential antimalarial compounds measured in vitroby flow cytometry in comparison to optical microscopy and hypoxanthine uptake. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2004;99(2): Bassilico N, Pagani E, Monti D, Olliaro P, Taramelli D. A 232

6 microtitre-based method for measuring the haem polimerization inhibitory activity (HPIA) of antimalarial drugs. J Antimicrob Chemother. 1998;42: Rain NA, Khozirah S, Mohd Ridzuan MAR, Ong BK, Rohaya C, Rosilawati M, et al. Antiplasmodial properties of some Malaysian medicinal plants. Trop Biomed. 2007;24(1): Taofik M, Yulianti E, Barizi A, Hayati EK. Isolasi dan identifikasi senyawa aktif ekstrak air daun paitan (Thitonia diversifolia) sebagai bahan insektisida botani untuk pengendalian hama tungau Eriophyidae. Alchemy. 2010;2(1): Otusanya O, Ilori O. Phytochemical screening and the phytotoxic effects of aqueous extracts of Tithonia diversifolia(hemsl) A. Gray. Int J Biol. 2012;4(3): Cheng AX, Lou YG, Mao YB, Lu S, Wang LJ, Chen XY. Plant terpenoids: biosynthesis and ecological functions. JIntegr Plant Biol.2007;49(2): Goffin E, Ziemons E, de Mol P, de Madureira Mdo C, Martins AP, da Cunha AP, et al. In vitro antiplasmodial activity of Tithonia diversifolia and identification of its main active constituent: taginin C. Planta Med. 2002;68(6): Ginsburg H. Targets for antimalarial drug development derived from basic research.in: Fairlamb AH, Ridley RG, Vial HJ, editors. Drugs against parasitic diseases: R&D methodologies and issues discoveries and drug. Geneva: UNDP/World Bank/WHO; p Hawley SR, Bray PG, Mungthin M, Atkinson JL, O Neill PM, Ward SA. Relationship between antimalarial drug activity, acccumulation, and inhibition of heme polymerization in Plasmodium falciparum in vitro. AntimicrobAgents Chemother. 1998;42(3):