BAB III METODE PENELITIAN

Transkripsi

1 BAB III METODE PENELITIAN A. Bahan dan Alat 1. Bahan Bahan yang digunakan adalah daun tapak liman (E. scaber) diperoleh dari lapangan Dukuhwaluh, Purwokerto; untuk uji aktivitas anti virus digunakan telur ayam kampung berembrio (diperoleh dari Dinas Peternakan Bantul, Yogyakarta) dan virus Newcastle Disease (vaksin aktif Medivac ND La Sota); bahan kimia yang digunakan adalah, etanol 96% (Brataco chemika), Phosphate buffered saline (PBS) (Sigma ), kromatografi lapis tipis (Merck), fase gerak dan pereaksi semprot untuk KLT, pembanding rutin (Sigma ) untuk identifikasi flavonoid. 2. Alat Alat-alat yang digunakan adalah, alat-alat gelas (Pyrex), maserator, timbangan analitik, inkubator (Naise TM IR autoflow), mikro pipet (Gilson ), spuit injeksi, pensil, kasa halus, pinset tajam, diluter (Gilson ), mikroplate (Nunclone ), lampu teropong telur, nampan telur. B. Batasan Variabel Operasional Variabel bebas : Variasi konsentrasi dosis ekstrak etanol daun tapak liman Variabel tergantung : Aktivitas antivirus eksrak etanol daun tapak liman terhadap telur ayam berembrio yang terinfeksi virus Newcastle Disease Variabel kendali : Telur ayam kampung berembrio yang telah dieramkan hari dan diberi virus Newcastle Disease dan diinkubasi selama 2-3 hari C. Cara Kerja Penelitian 1. Determinasi tanaman (E. scaber) Determinasi tanaman tapak liman (E. scaber) dideterminasi oleh Dra. Yayu Widiawati, MS. di laboratorium Morfologi dan Taksonomi Tumbuhan 19

2 Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto. Determinasi tanaman bertujuan untuk memastikan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian adalah tanaman tapak liman. 2. Pengumpulan dan pengeringan bahan Bahan yang diambil adalah daun segar dari tanaman daun tapak liman yang diambil dari Dukuhwaluh, Purwokerto. Bahan dicuci dengan air yang mengalir untuk menghilangkan kotoran yang menempel, kemudian dikeringkan dengan lemari pengering. Simplisia daun tapak liman kemudian diserbuk menggunakan blender. 3. Pembuatan ekstrak Serbuk diekstraksi dengan teknik maserasi, dengan menggunakan penyari etanol 96% dengan perbandingan 1:10 kemudian dilakukan remaseasi menggunakan etanol 96% dengan perbandingan 1:4. Maserat diuapkan penyarinya hingga diperoleh ekstrak kental etanol. Masing-masing ekstrak dilakukan uji aktivitasnya terhadap virus. 4. Uji aktivitas terhadap virus Uji ini dilakukan terhadap semua ekstrak etanol daun tapak liman hasil isolasi yang bertempat di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada. Uji aktivitas ini dilakukan dengan beberapa kelompok perlakuan yaitu: a. Kelompok 1 Perlakuan ekstrak etanol daun tapak liman dengan konsentrasi 100 µg/ml b. Kelompok 2 Perlakuan ekstrak etanol daun tapak liman dengan konsentrasi 10 µg/ml c. Kelompok 3 Perlakuan ekstrak etanol daun tapak liman dengan konsentrasi 1 µg/ml

3 d. Kelompok 4 Kontrol virus (satu dosis vaksin aktif virus Newcastle Disease (berisi 10 7 EID 50 )) Masing-masing uji tersebut dilakukan dengan replikasi 3 kali Cara kerja uji ini adalah sebagai berikut: a. Persiapan telur uji Telur berembrio yang telah dieramkan hari diperiksa dengan lampu di dalam kamar gelap. Telur berembrio yang hidup, bagian kepala embrio dan batas rongga hawa diberi tanda dengan pensil. b. Inokulasi virus dan sampel ke dalam cairan alantois Kutub telur yang mengandung rongga hawa dan di sekitar kepala embrio didesinfeksi dengan menggosokkan iodium tincture atau alkohol 70% ditambah biocid atau betadine, kemudian dibuat lubang dengan bor. Sebanyak 0,1 ml suspensi virus diinokulasikan ke dalam ruang alantois menggunakan kanul yang cukup halus. Setelah inokulasi virus, dengan cara yang sama, masing-masing sampel dengan berbagai seri kadar diinokulasikan ke dalam cairan alantois. Lubang kanul ditutup dengan parafin atau lem karet, kemudian telur berembrio dieramkan dalam mesin tetas selama 2-3 hari. c. Membuka telur berembrio yang diinokulasi virus Setelah dieramkan selama 2-3 hari, telur disimpan dalam almari es semalam (18 jam). Kutub tumpul telur berembrio didesinfeksi dengan alkohol kemudian disulut api. Kerabang telur dipecahkan dengan pinset tajam, kemudian dibuat lubang sebesar atau lebih kecil dari rongga hawa. Embrio ditekan ke samping dengan pinset, cairan korio alantois yang terdapat di sisi embrio dihisap dengan spuit 5 ml. Sebanyak 0,25 ml cairan diteteskan di atas pelat agar darah untuk menguji ada tidaknya pertumbuhan virus. Sisanya disimpan dalam refrigerator. (Kuswandi, 2008). 5. Pengolahan dan Analisa Data Dilakukan perhitungan titer dari cairan alantois, dengan sistem hemaglutinasi (HA) menggunakan plat mikro. Hemaglutinasi yang ada pada sumuran mikro plate dihitung persentase penghambatannya. Perhitungan

4 persentase penghambatan pertumbuhan virus oleh ekstrak etanol daun tapak liman, menggunakan rumus: Keterangan: P : persentase penghambatan infeksi A : jumlah titer pada telur ayam berembrio tanpa perlakuan ekstrak etanol daun tapak liman. B : jumlah titer pada telur ayam berembrio dengan perlakuan ekstrak etanol daun tapak liman. (Kuswandi, 2008). Data persentase hambatan antivirus dapat dianalisa secara statistik menggunakan program SPSS versi 12. Analisis data yang digunakan adalah dengan uji anava variabel satu arah untuk mengetahui signifikansi masingmasing konsentrasi ekstrak etanol daun tapak liman. Kemudian dilakukan uji BNT untuk mengetahui korelasi konsentrasi ekstrak etanol daun tapak liman, dengan taraf kepercayaan 95 % (p<0,05). 6. Deteksi golongan senyawa. Untuk mengetahui kandungan golongan senyawa dalam ekstrak etanol daun tapak liman yang mempunyai potensi sebagai antivirus dapat dilakukan deteksi dengan kromatografi lapis tipis (KLT) a. Flavonoid Fase diam : Selulosa Fase gerak : Asam asetat 15% Pembanding : Rutin Deteksi : Lampu UV 366 nm dan pereaksi semprot Sitroborat (Markham, 1988) b. Saponin Fase diam : Silica gel F 254 Fase gerak : Kloroform : methanol : air (65:50:10) Deteksi : Pereaksi semprot vanilin asam sulfat (Anonim, 1987)

5 c. Seskuiterpen lakton Fase diam : Silica gel F 254 Fase gerak : benzene : methanol (9:1) Deteksi : pereaksi semprot vanilin asam sulfat (Harborne, 1987) d. Steroid Fase diam : silika gel Fase gerak : heksana-eter (97:3) Deteksi : Menggunakan pereaksi carr-price dan deteksi Liebermann Burchard (Harborne, 1987) Analisis steroid dilakukan dengan melarutkan ekstrak pada pereaksi Liebermann Burchard akan tetapi adanya klorofil dapat mengganggu pengamatan hasil reaksi, sehingga perlu digunakan larutan pembanding atau lebih tepat dilakukan analisis dengan KLT (Anonim, 1987).