POLA EKSPRESI GEN HbACO2 PADA KULIT BATANG DAN LATEKS KARET (Hevea brasiliensis) AKIBAT STRES EKSPLOITASI CHAIRUNISA

Transkripsi

1 POL EKSPRESI GEN HbCO2 PD KULIT BTNG DN LTEKS KRET (Hevea brasiliensis) KIBT STRES EKSPLOITSI CHIRUNIS PROGRM STUDI BIOKIMI FKULTS MTEMTIK DN ILMU PENGETHUN LM INSTITUT PERTNIN BOGOR BOGOR 2008

2 BSTRK CHIRUNIS. Pola Ekspresi Gen HbCO2 pada Kulit Batang dan Lateks Karet (Hevea brasiliensis) kibat Stres Eksploitasi. Dibimbing oleh MRI BINTNG dan TETTY CHIDMSRI. Masa produktif dan kualitas produksi tanaman karet alam (Hevea brasiliensis) amat dipengaruhi oleh respon tanaman terhadap stres eksploitasi. Deteksi dini klon karet yang memiliki respon stres baik dapat dilakukan salah satunya dengan penanda molekuler. Pengetahuan mengenai pola ekspresi gen yang terlibat dalam biosintesis lateks pada tanaman karet diperlukan sebagai langkah awalnya. Penelitian ini mengamati pola ekspresi gen HbCO2 tanaman karet klon PB 260 umur 5 tahun pada pengaruh penyadapan dan stimulasi etefon sebagai dua faktor penyebab stres eksploitasi utama pada tanaman karet perkebunan. Terdapat enam perlakuan; sampel pohon karet yang disadap 2, 4 dan 6 hari sekali serta pohon karet yang diberi 2.5% etefon 3, 6 dan 12 kali setahun (disadap 4 hari sekali). Gen HbCO2 hanya terekspresi pada kulit batang dan ekspresinya lebih dipengaruhi pelukaan disertai pemberian etefon dibanding pelukaan saja. Tingkat ekspresi tertinggi terjadi pada perlakuan stimulasi etefon 12 kali setahun, 30 hari setelah tanaman buka sadap. Ekspresi gen HbCO2 terhenti di bulan ketiga pada intensitas penyadapan dan stimulasi etefon paling sering sementara pada perlakuan lainnya, ekspresi gen terhenti di bulan keempat.

3 BSTRCT CHIRUNIS. The Expression Patterns of HbCO2 gene in Rubber (Hevea brasiliensis) Bark and Latex in Response to Exploitation Stresses. Under the direction of MRI BINTNG and TETTY CHIDMSRI. Productive time and production quality of rubber plants (Hevea brasiliensis) are greatly affected by the plant s response to exploitation stresses. Early detection of a rubber clone which has a good stresses response can be done using molecular marker. The knowledge about the gene expression patterns involved in latex biosynthesis in rubber trees are necessary for the first step. This research observed the HbCO2 gene expression patterns of 5 years old PB 260 rubber clone under the effect of tapping and ethephon stimulation as the two main factors of exploitation stresses in plantation s rubber plants. There were six sample treatments; rubber trees tapped every 2, 4, and 6 days and rubber trees with 3, 6, and 12 times 2.5% ethephon stimulations a year (tapped every 4 days). The gene was expressed only in bark tissues and were more affected by ethephon stimulation followed by tapping rather than tapping only. The highest expression was in 12 times a year ethephon stimulations treatment, 30 days after opening. The gene expressions were stopped on the third month on the highest frequency of tapping and stimulations while others were stopped on the fourth month.

4 POL EKSPRESI GEN HbCO2 PD KULIT BTNG DN LTEKS KRET (Hevea brasiliensis) KIBT STRES EKSPLOITSI CHIRUNIS Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia PROGRM STUDI BIOKIMI FKULTS MTEMTIK DN ILMU PENGETHUN LM INSTITUT PERTNIN BOGOR BOGOR 2008

5 Judul Skripsi Nama NIM : Pola Ekspresi Gen HbCO2 pada Kulit Batang dan Lateks Karet (Hevea brasiliensis) kibat Stres Eksploitasi : Chairunisa : G Disetujui Komisi Pembimbing Prof. Dr. drh Maria Bintang MS Dr Tetty Chaidamsari, MSi Ketua nggota Diketahui Dr. drh. Hasim DE Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan lam Tanggal lulus :

6 PRKT Puji dan syukur kepada llah SWT atas semua karunia dan rahmat-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi sesuai jadwal yang penulis inginkan. Skripsi ini merupakan laporan dari penelitian penulis yang berjudul Pola Ekspresi Gen HbCO2 pada Kulit Batang dan Lateks Karet kibat Stres Eksploitasi yang penulis lakukan mulai bulan Februari hingga Juni 2008 di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. drh Maria Bintang MS selaku pembimbing utama dan Dr Tetty Chaidamsari, MSi. selaku pembimbing anggota yang telah begitu banyak memberi pengarahan dan semangat kepada penulis selama proses penyusunan skirpsi ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak Dr Darmono Taniwiryono, MSc. sebagai Kepala Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia dan semua staf Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia. Tidak lupa untuk mereka yang telah berjuang bersama penulis selama masa penelitian; Fami R, rlyny F, Resti dan David T, terima kasih atas bantuannya, kepada Febri S atas dukungan dan kesabarannya membantu penulis selama penyelesaian laporan ini, juga kepada orang tua untuk semua perhatian dan dukungan moral serta materil. Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam skripsi ini tetapi penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca. Bogor, gustus 2008 Chairunisa

7 RIWYT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor, 9 Mei 1986 sebagai anak pertama dari empat bersaudara pasangan bid bdul Malik dan Siti Hayatin. Tahun 2004 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Bogor dan pada tahun yang sama diterima masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih Program Studi Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan lam. Selama menjadi mahasiswa aktif di IPB, penulis menjadi anggota Himpunan Profesi (Himpro) CREBs periode dan sebagai anggota staf Divisi Biokimia Tumbuhan. Selama dua tahun bergabung dengan Divisi Biokimia Tumbuhan, penulis aktif menjadi panitia penyelenggara atau ketua kegiatan divisi tersebut, di antaranya studium generale, pelatihan, dan seminar. Selain itu penulis juga pernah menjadi juara pertama lomba nnouncer Contest yang diadakan oleh Fakultas Teknologi Pertanian IPB tahun Penulis juga mengikuti lomba Program Kreatifitas Mahasiswa tahun 2007 dan Penulis melakukan praktik lapang di Balai Penelitian Tanaman Obat dan romatik, Cimanggu mengenai kultur jaringan tanaman stevia.

8 DFTR ISI Halaman DFTR TBEL...ix DFTR GMBR...ix DFTR LMPIRN... x PENDHULUN...1 TINJUN PUSTK...1 Karet (Hevea brasiliensis)...1 Lateks...2 Etilena...2 CC Oksidase...3 Etefon...3 RT-PCR (Reverse Transcription-Polimeration Chain Reaction)...4 Elektroforesis gel...4 BHN DN METODE...4 Bahan dan lat...4 Metode...5 HSIL DN PEMBHSN...7 Isolasi RN Total Sampel Kulit Batang dan Lateks...7 Kemurnian RN Kulit Batang dan Lateks Hasil Isolasi...8 Konsentrasi RN Kulit Batang dan Lateks Hasil Isolasi...9 Ekspresi Gen HbCO2 pada Kulit Batang...9 Pengaruh Penyadapan terhadap Ekspresi Gen HbCO2 Kulit Batang...10 Pengaruh Etefon terhadap Ekspresi Gen HbCO2 Kulit Batang...11 SIMPULN DN SRN...12 DFTR PUSTK LMPIRN...14

9 DFTR TBEL Halaman 1 Sistem perlakuan dan nomor sampel Nilai kemurnian RN beberapa sampel kulit batang dan lateks Konsentrasi RN beberapa sampel kulit batang dan lateks Tingkat ekspresi gen HbCO2 terhadap pengaruh pelukaan Tingkat ekspresi gen HbCO2 terhadap pemberian etefon...11 DFTR GMBR Halaman 1 Monomer isoprena lur singkat biosintesis etilena Perubahan etefon menjadi etilena pada tanaman karet Elektroforegram RN lateks dengan pita yang utuh Elektroforegram RN kulit batang Elektroforegram RN kulit batang dan RN lateks Ekspresi gen HBCO2 pada beberapa sampel kulit batang Elektroforegram cdn sampel lateks dengan primer aktin Ekspresi gen HbCO2 terhadap pengaruh pelukaan Ekspresi gen HbCO2 terhadap pengaruh stimulasi etefon... 11

10 DFTR LMPIRN Halaman 1 Tahapan penelitian Komposisi larutan sediaan Tahapan isolasi RN kulit batang (metode Chaidamsari 2005) Tahapan isolasi RN lateks (metode Chaidamsari 2005) Elektroforegram RN kulit batang hasil isolasi Elektroforegram RN lateks hasil isolasi Elektroforegram cdn sampel kulit batang Pola ekspresi gen HbCO2 pada kulit batang akibat pelukaan Pola ekspresi gen HbCO2 pada kulit batang akibat stimulasi etefon...28

11 1 PENDHULUN Karet alam (poliisoprena) merupakan salah satu komoditas nonmigas penting di Indonesia. Tercatat pada tahun 2002 produksi karet alam Indonesia sebanyak 1.6 juta ton yang sebagian besar diekspor dengan nilai 1.1 milyar US dolar. Indonesia merupakan produsen karet alam terbesar kedua di dunia setelah Thailand (Nurhaimi-Haris et al 2003) Konsumsi karet alam secara keseluruhan diperkirakan telah meningkat rata-rata 5.9% per tahun sejak tahun 1900 (Budiman 2005). Meskipun saat ini dikenal juga karet sintetis dari bahan baku minyak bumi, karet alam tetap diperlukan karena sifatnya yang tak tergantikan pada beberapa alat dan barang jadi dari karet. Pohon karet baru dapat menghasilkan lateks setelah berumur lima tahun atau lebih (Webster & Baulkwill 1989). Setiap klon tanaman karet memiliki respon berbeda terhadap stres eksploitasi bergantung pada sifat genetiknya. Penyadapan dan penggunaan stimulan (umumnya etefon) merupakan dua stres eksploitasi utama pada tanaman karet perkebunan. Respon tanaman yang kurang baik dapat berakibat pada berkurangnya masa produktif dan kualitas produksi tanaman karet dan seringkali kekurangan ini baru dapat diketahui ketika pohon karet memasuki usia produktif (5 tahun atau lebih) sehingga merugikan perkebunan. Diperlukan cara yang akurat dan efisien (terutama dalam hal waktu) untuk mengetahui kualitas produksi lateks suatu klon karet tanpa harus menunggu hingga tanaman tersebut dapat berproduksi. Gen merupakan informasi genetik yang sangat spesifik menggambarkan sifat suatu individu. Melalui analisis gen, dapat diketahui fenotip individu bahkan sebelum gen tersebut terekspresi. Seleksi dini bibit karet yang memiliki potensi produksi lateks tinggi juga dimungkinkan melalui analisis gen-gen yang terlibat dalam metabolisme pembentukan lateks. Gen HbCO2 merupakan salah satu gen yang terlibat dalam regulasi metabolisme pembentukan lateks dengan menyandi enzim asam aminosiklopropana-1-karboksilat oksidase (CC oksidase atau CO). Enzim ini berperan dalam katalisis oksidasi asam aminosiklopropana-1-karboksilat (CC) menjadi etilena. Etilena itu sendiri dapat meningkatkan aktivitas regenerasi lateks in situ dan metabolisme biosintesis lateks (Kuswanhadi 2005; Jetro 2007). Perkebunan karet umumnya menggunakan senyawa stimulan yang dapat meningkatkan kadar etilena endogen untuk memperpanjang waktu alir lateks. Etefon atau asam 2-kloroetilfosfonat telah lama digunakan sebagai stimulan untuk meningkatkan kadar etilena endogen pada tanaman karet perkebunan (Kuswanhadi 2005). Pemberian etefon akan membuat waktu alir lateks lebih lama dan lateks yang dihasilkan dari satu kali penyadapan lebih banyak. Telah banyak penelitian mengenai efek etefon dan pelukaan terhadap biosintesis etilena endogenus, namun belum sampai pada pengaruhnya terhadap ekspresi gen-gen yang berperan dalam biosintesis etilena. Penelitian ini bertujuan mempelajari pola ekspresi gen HbCO2 sebagai salah satu gen penyandi enzim CO akibat pengaruh pelukaan dan pemberian etefon sebagai stres eksploitasi utama pada tanaman karet perkebunan. Tanaman karet yang digunakan berasal dari klon PB 260 yang memiliki sifat metabolisme lateks tinggi namun kurang responsif terhadap stimulan. Hipotesis penelitian adalah pemberian etefon pada tanaman karet akan meningkatkan ekspresi gen HbCO2. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi berupa pola ekspresi gen HbCO2 saat tanaman mulai buka sadap (umur 5 tahun) yang akan berguna dalam konstruksi penanda molekuler (marka) pada penelitian selanjutnya. Marka tersebut nantinya digunakan untuk deteksi dan seleksi dini klon karet yang mempunyai potensi produksi lateks dan toleransi stres eksploitasi yang baik terhadap pelukaan maupun penggunaan stimulan. Tahapan penelitian meliputi isolasi RN total dari sampel lateks dan kulit batang karet, karakterisasi RN hasil isolasi, sintesis cdn, perbanyakan gen HbCO2 dengan primer H4 dan pengamatan pola ekspresi gen HbCO2. TINJUN PUSTK Karet (Hevea brasiliensis) Karet alam yang biasa kita kenal berasal dari tanaman Hevea Brasiliensis dan merupakan satu-satunya jenis yang ditanam untuk tujuan komersial (Webster & Baulkwill 1989). Saat ini, lateks yang diperoleh dari Hevea brasiliensis memenuhi sekitar 98% dari total lateks yang diproduksi di seluruh dunia (Tim Penulis PS 1998). Tanaman karet berasal dari Brazil dan tumbuh baik pada daerah dataran rendah dengan curah hujan mm/tahun dan

12 2 ph tanah di bawah 6.5. Pohon karet alam liar dapat tumbuh mencapai tinggi 40 meter dan hidup lebih dari 100 tahun. Tinggi tanaman karet budidaya biasanya hanya m karena pertumbuhannya terhambat akibat penyadapan dan hanya berumur sekitar 25 tahun karena pada usia tersebut pohon karet tidak produktif lagi sehingga dilakukan penanaman ulang (Webster & Baukwil 1989). Tanaman karet yang produktif menghasilkan karet, normalnya melakukan regenerasi lateks 3-4 hari setelah penyadapan (Sumarmadji 2001). Lateks dibentuk dan terakumulasi di dalam sel-sel dan jaringan pembuluh lateks yang tersusun pada setiap bagian tanaman. Produksi lateks yang didapat dari penyadapan bergantung pada lamanya aliran dan kecepatan biosintesis lateks (Siswanto 1994). Biosintesis lateks itu sendiri ditentukan oleh ketersediaan bahan dasar pembentuk lateks berupa sukrosa dan oleh aktivitas enzim yang berperan langsung (Jacob & Prevot 1992). Berbagai usaha telah dilakukan untuk meningkatkan produksi lateks tanaman karet, misalnya dengan pengembangan klon karet, penggunaan stimulan maupun pemberian nutrisi dan perawatan khusus yang mendukung pertumbuhan optimal tanaman (Nurhaimi-Haris et al. 2003; Tim Penulis Penebar Swadaya 2006). Beberapa contoh klon tanaman karet yang telah dikembangkan di antaranya serial klon VROS (VROS 33, VROS 49, dan VROS 80) dan serial klon TM (TM 2, TM 6, dan TM 9) yang dihasilkan oleh lembaga penelitian di pulau Sumatera. Beberapa klon yang dihasilkan oleh lembaga penelitian di Jawa adalah BD 5, GT 1, WR 4, TJIR1, LCB 479, dan LCB 1320 (Lasminingsih et al 1994). Klon PB 260 yang digunakan pada penelitian ini berasal dari Malaysia dan merupakan klon anjuran perkebunan skala kecil, yaitu klon yang berpotensi untuk dipromosikan menjadi klon skala besar setelah diuji daya adaptasinya secara luas dan dapat ditanam secara terbatas pada 20-40% areal penanaman (Lasminingsih et. al. 1994). Lateks Lateks merupakan suatu sistem kompleks larut lemak yang terdiri atas hidrokarbon karet, karbohidrat, protein, lipid, karotenoid, garam-garam mineral, enzim, dan berbagai bahan lainnya (De Boer 1950). Komponen lateks ini dapat dipisahkan menjadi tiga bagian utama, yaitu fraksi karet, fraksi serum, dan fraksi lutoid. Pemisahan dilakukan dengan sentrifugasi pada kecepatan rpm selama menit (Putri 2005). Fraksi karet berada pada lapisan atas, berwarna putih susu yang berisi partikel karet atau cis-1,4-poliisoprena (Gambar 1) dan dalam lateks segar partikel karet ini sekitar 30% yang merupakan kadar karet kering (Sumarmadji 2001). Fraksi ini juga mengandung bahan bukan karet seperti fosfolipid, lemak, lilin, protein, logam (Ca, Mg, Cu) dan enzim rubber transferase yang berperan dalam pembentukan polimer karet. Lapisan tengah merupakan fraksi serum sitosol (serum C) yang berupa cairan bening kaya protein dan mudah teroksidasi. Lapisan bawah adalah fraksi lutoid yang bersifat kental seperti gelatin, berisi cairan serum B yang terbungkus oleh membran tipis (mikrokapsul) dan rentan terhadap senyawa kimia, enzim atau bakteri sehingga menyebabkan lateks tidak stabil. Serum B ini mengandung ion kalsium dan magnesium bermuatan positif (d uzac & Jacob 1989). Biosintesis partikel karet atau cis-1,4- poliisoprena berlangsung di dalam pembuluh lateks (laticiferous vessel) dengan bahan dasar sukrosa hasil fotosintesis yang ditranspor dari daun ke dalam pembuluh lateks melalui pembuluh tapis (Dalimunthe 2004). Pembuluh lateks ini berada di jaringan floem yang terdapat di bawah permukaan kulit batang (Cornish et al 1993). Gambar 1 Monomer isoprena (Putri 2005). Etilena Etilena merupakan hormon tanaman dengan struktur kimia yang paling sederhana. Tidak seperti hormon tanaman lain, etilena berwujud gas. Etilena disintesis oleh semua tanaman tingkat tinggi dan produksinya berbeda bergantung pada jenis jaringan, spesies tanaman, dan tahap perkembangan tanaman (Salisbury & Ross 1995). Etilena berpengaruh pada berbagai aspek pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Peranan etilena antara lain merangsang pematangan buah, pertumbuhan dan diferensiasi akar serta pucuk daun juga merangsang penuaan (senescence) bunga dan buah. Etilena juga menginduksi efek fisiologis pada jaringan tanaman, seperti peningkatan

13 3 laju respirasi, peningkatan aktivitas beberapa enzim, dan mempengaruhi perubahan kadar mrn (Gidrol et al 1988). Hormon ini juga punya peranan sebagai hormon stres yang ekspresinya dipengaruhi oleh cekaman lingkungan seperti pelukaan, kekeringan, pengaruh ozon, serangan patogen, senyawa kimiawi, dan suhu ekstrem (Salisbury & Ross 1995; Wang et al 2002). Biosintesis etilena pada tanaman tingkat tinggi dikatalisis oleh dua enzim utama, yaitu asam aminosiklopropana-1-karboksilat sintase (CS) dan asam aminosiklopropana-1- karboksilat oksidase (CO). Sintesis etilena terjadi melalui tiga tahap reaksi utama. Pertama, pembentukan S-adenosil metionina (SM) lalu perubahan SM menjadi asam aminosiklopropana-1-karboksilat (CC) dikatalisis CS dan tahap terakhir adalah oksidasi CC menjadi etilena dikatalisis CO (Wang et al 2002). Komponen esensial pada proses ini adalah TP. ir (H 2 O) dan TP digabung dengan metionina menghasilkan SM dengan melepaskan tiga gugus fosfat. Enzim CS mengatalisis perubahan SM menjadi CC. Tahap ini menghasilkan metiltioadenosin (MT) yang akan digunakan kembali untuk pembentukan metionina, sehingga konsentrasi selulernya tetap terjaga saat laju biosintesis etilena meningkat (Wang et al 2002). Selanjutnya oksigen diperlukan untuk oksidasi CC menjadi etilena (Gambar 2). CS CO Gambar 2 lur singkat biosintesis etilena (Wang et al 2002). CC Oksidase Enzim CC oksidase (CO) disebut juga ethylene forming enzyme (EFE), merupakan enzim yang berperan dalam katalisis oksidasi CC menjadi etilena. Enzim ini pada Hevea brasiliensis disandi oleh beberapa gen (multifamili), yaitu HbCO1, HbCO2, dan HbCO3 (Kuswanhadi et al 2005). Gen HbCO1 memiliki panjang 1456 bp, terdiri atas tiga intron dan empat ekson dengan open reading frame (ORF) 936 bp. Gen HbCO2 memiliki panjang 1504 bp, terdiri atas dua intron dan tiga ekson dengan ORF 954 bp sedangkan gen HbCO3 memiliki panjang 1352 bp dengan ORF 954 bp. Ketiga gen ini memiliki homologi nukleotida sebesar 75-86%. Struktur genom dan ekspresi ketiga gen tersebut berbeda dan pada beberapa spesies, ekspresinya amat dipengaruhi faktor perkembangan tanaman dan lingkungan luar seperti pemberian stimulan, pemberian senyawa pertumbuhan (hormon), dan serangan penyakit atau pelukaan (Kuswanhadi 2005). Etefon Etefon (asam 2-kloroetilfosfonat) disebut juga ethylene releaser karena senyawa ini akan terdekomposisi pada jaringan tanaman membentuk etilena (gambar 3). Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa etilena meningkatkan tekanan internal dan perubahan pada pembuluh lateks yang menyebabkan lambatnya penyumbatan aliran lateks (Jetro 2007). Penggunaan etefon sebagai stimulan tidak ditujukan untuk meningkatkan produksi lateks secara kumulatif karena stimulasi harus diikuti dengan pengurangan frekuensi sadap untuk menghindari keletihan fisiologis tanaman. Stimulasi etefon berlebihan dapat menginduksi terjadinya penebalan atau retakan pada kulit batang, nekrosis dan timbulnya bagian tidak produktif pada irisan sadap yang berujung pada gejala kering alur sadap (KS). Pohon karet yang terkena KS akan berhenti mengalirkan lateks dan diperkirakan kejadian ini menimbulkan kerugian nasional sekitar 1.7 miliar per tahun (Sumarmadji 2001). Meski tidak dapat digunakan untuk meningkatkan jumlah produksi lateks secara keseluruhan, etefon tetap digunakan pada perkebunan karet. Keuntungan menggunakan stimulan seperti etefon adalah menghemat waktu dan tenaga penyadap karena tidak perlu terlalu sering melakukan penyadapan namun hasil yang didapat tetap sama banyaknya

14 4 selain juga mampu menghemat penggunaan kulit batang karet (Karyudi et al 1994). Gambar 3 Perubahan etefon menjadi etilena pada tanaman karet (Jetro 2007). RT-PCR (Reverse Transcription- Polimeration Chain Reaction) Secara prinsip, PCR merupakan proses replikasi berulang antara kali. Tiap siklusnya terdiri atas tiga tahap reaksi, yaitu peleburan (melting), penempelan primer (annealing) dan pemanjangan nukleotida (elongation). Peleburan berlangsung pada suhu tinggi (94 96 C) agar ikatan hidrogen DN putus sehingga DN menjadi utas tunggal. Saat itulah primer akan menempel pada sekuen DN yang komplementer (annealing). Suhu tahap penempelan berkisar C. Suhu yang tidak tepat dapat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Proses elongasi membutuhkan suhu yang bergantung pada jenis DN polimerase yang digunakan. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 C jika menggunakan Taq polimerase (Sambrook et al 1989). Metode RT-PCR adalah pengembangan teknik dari PCR yang prinsipnya adalah sintesis DN dari mrn sebagai templatnya (transkripsi balik). Enzim yang digunakan untuk proses ini adalah reverse transcriptase (RT) yang secara komersial diisolasi dari sel bakteri yang terinfeksi Moloney murine leukemia virus (MMLV) dan vian myleoblastosis virus (MV). Fungsi kedua enzim tersebut relatif sama namun berbeda pada suhu dan ph optimum (Reece 2004). Saat proses transkripsi balik, primer oligodt akan menempel pada bagian poli- mrn. Enzim RT mengatalisis pembentukan utas pertama (first strand) cdn dengan memasangkan basa (dntp) yang komplementer terhadap basa pada mrn. RNase H akan memisahkan mrn dari molekul hibrid yang terbentuk. Enzim terminal transferase lalu mensintesis sekuen C berulang (ekor poli-c) pada ujung 3 cdn sebagai situs untuk penempelan primer oligodg. Selanjutnya terjadi pembentukan utas cdn kedua sehingga terbentuk cdn utas ganda (Reece 2004). Elektroforesis Gel Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DN, RN, atau protein memiliki muatan yang dapat dipisahkan oleh medan listrik. Gel yang digunakan biasanya berupa polimer bertaut silang (crosslinked) dengan porositas yang dapat diatur sesuai kebutuhan. Gel yang umum digunakan untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil adalah poliakrilamida. Pemisahan molekul yang lebih besar (lebih dari beberapa ratus basa) menggunakan gel agarosa yang dibuat dari ekstrak rumput laut yang sudah dimurnikan. Sampel molekul ditempatkan pada sumur gel (well) di dalam larutan penyangga. Saat listrik dialirkan, molekul sampel akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai muatannya. Rangka gula-fosfat menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif sehingga molekul asam nukleat akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif. Marka (marker) ikut dielektroforesis pada lajur gel yang paralel dengan sampel. Marka atau penanda molekuler merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda yang dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul pita sampel (Khopkar 1990). Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna biru Coomassie (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Etidium bromida yang ditambahkan pada larutan gel akan membuat molekul sampel terlihat berpendar dalam sinar ultraviolet. Gel kemudian difoto di bawah sinar ultraviolet. Pita-pita (band) yang berbeda pada gel dibandingkan letaknya pada lajur terhadap pita marka untuk menentukan ukurannya. BHN DN METODE Bahan dan lat Bahan yang diperlukan untuk isolasi RN antara lain sampel lateks dan kulit batang tanaman karet klon PB 260, N 2 cair, PVP (polivinyl pyrrolidone), buffer ekstraksi yang terdiri atas EDT 20 mm, NaCl 2 M, Tris HCl 100 mm ph 8.2, CTB (N-cetyl-N,N,Ntrimethylammoniumbromide) 2%, larutan kloroform : isoamilalkohol (Ch : I) 24:1, ß- merkaptoetanol, larutan fenol : kloroform : isoamilalkohol (Ph : Ch : I) 25:24:1, LiCl 8 M, DEPC, ddh 2 O, natrium asetat 3 M ph 5.8,

15 5 etanol absolut, dan etanol 70%. Bahan untuk elektroforesis gel agarosa antara lain bubuk agarosa (Sigma), buffer TBE (Tris basa, asam borat, EDT) 0.5x, etidium bromida 1% (w/v), loading buffer (Brom fenol biru 2.5%, sukrosa 40%), dan marker 1 kb plus (invitrogen). Sintesis cdn menggunakan paket Transcriptor First Strand cdn Synthesis kit (Roche), terdiri atas enzim reverse transcriptase (20 U/µL), bufer RT (5x), inhibitor RNase (40 U/µL), dntp, molecular water (MW), dan primer oligo(dt)18. Perbanyakan DN menggunakan primer H4 forward dan reverse, buffer PCR, cdn hasil RT-PCR, enzim Taq polimerase (Bioron), dntp dan MW. Peralatan untuk isolasi RN antara lain mortar, ruang asam, sentrifus Beckman llegra 64R, sentrifus Eppendorf 5417R, penangas air, autoklaf, pipet Eppendorf, freezer Decby (-40 C) dan Sansio (-20 C). Uji kualitatif dan kuantitatif RN menggunakan spektrofotometer UV-Vis Beckman Coulter-DU 530, sisir dan cetakan agar, bak elektroforesis, parafilm, adaptor 100 volt, UV T2201 (sigma), dan Polaroid Fuji Film FP-3000B. mplifikasi DN menggunakan mesin Genemp PCR System Peralatan gelas yang digunakan antara lain gelas piala, gelas ukur, pipet Mohr, dan labu Erlenmeyer. Metode Penyadapan dan plikasi Stimulan Pengambilan sampel lateks dan kulit batang tanaman Hevea brasiliensis dilakukan berdasarkan metode dari Balai Penelitian Perkebunan Sembawa (1982). Batang dilukai (disadap) sepanjang setengah spiral (s2). Etefon diberikan dengan cara dioleskan pada kulit batang di bawah irisan sadap. Kontrol percobaan berupa kulit batang Hevea brasiliensis yang tidak disadap; dengan dan tanpa pemberian etefon, masing-masing satu sampel. Terdapat enam perlakuan berdasarkan frekuensi sadap dan pemberian etefon. Perlakuan berdasarkan frekuensi sadap terdiri atas pohon karet yang disadap dua hari sekali (d2), empat hari sekali (d4) dan enam hari sekali (d6). Berdasarkan pemberian etefon, perlakuan terbagi atas tiga kelompok, yaitu pohon karet yang diberi etefon tiga kali setahun (E3), enam kali setahun (E6) dan 12 kali setahun (E12) dengan penyadapan empat hari sekali. Konsentrasi etefon yang digunakan 2.5%. Jumlah sampel sebanyak 65 untuk sampel kulit batang dan 58 untuk sampel lateks (Tabel 1). Penomoran sampel dilakukan berdasarkan urutan waktu penyadapan yang dilakukan oleh Balai Penelitian Perkebunan Sembawa. Pengamatan terhadap gen ini dilakukan selama lima bulan mulai Mei hingga Oktober Tabel 1 Sistem perlakuan dan nomor sampel Perlakuan Nomor sampel (K) Nomor sampel (L) Kontrol 1 9 (etefon) 1 9 (etefon) S2 d2 2, 8, 10, 15, 21, 22, 28, 35, 43, 50, 59 S2 d4 3, 11, 16, 23, 29, 36, 44, 51, 60 S2 d6 4, 17, 24, 30, 37, 45, 52, 61 S2 E3 d4 5, 12, 18, 25, 31, 38, 46, 53, 56, 62 S2 E6 d4 7, 14, 20, 27, 33, 40, 42, 48, 55, 58, 64 S2 E12 d4 6, 13, 19, 26, 32, 34, 39, 41, 47, 49, 54, 57, 63, 65 K = kulit batang; L = lateks 2, 8, 10, 15, 21, 22, 28, 35, 43, 50 3, 11, 16, 23, 29, 36, 44, 51 12, 43, 63, 81, 102, 126, 147 5, 12, 18, 25, 31, 38, 46, 53, 56 7, 14, 20, 27, 33, 40, 42, 48, 55, 58 6, 13, 19, 26, 32, 34, 39, 41, 47, 49, 54, 57 Isolasi RN Kulit Batang Karet Isolasi RN kulit batang dilakukan menggunakan metode Chaidamsari et al (2005). Sampel kulit pohon karet 1.5 gram digerus halus dengan N 2 cair dan PVP 1.5 %. Serbuk sampel dimasukkan ke tabung sentrifusa lalu ditambah 15 ml buffer ekstraksi (suhu 65 C) yang telah ditambah 150 L -merkaptoetanol (1%) lalu dikocok kuat sekitar 1 menit. Suspensi diinkubasi dalam waterbath (suhu 65 C) selama 1 jam sambil dikocok kuat tiap 15 menit. Setelah inkubasi, didiamkan 5 menit pada suhu ruang kemudian diekstrak dengan 15 ml Ch : I (24:1) dan dikocok perlahan. Suspensi disentrifugasi 15 menit pada kecepatan rpm, suhu 25 C.

16 6 Supernatan diambil (dihitung volumenya) dan dipindahkan ke tabung sentrifusa baru lalu diekstrak dengan Ph : Ch : I (25:24:1) sebanyak volume supernatan yang didapat kemudian disentrifugasi lagi. Ekstraksi berikutnya dengan Ch : I dilakukan dua kali. Tiap sentrifugasi dilakukan pada kecepatan rpm, suhu 25 C selama 15 menit. Supernatan yang didapat ditambahkan LiCl 10 M hingga konsentrasinya 2 M kemudian disimpan pada suhu 4 C selama semalam. Setelah itu, larutan disentrifugasi dengan kecepatan rpm, 4 C selama 30 menit. Supernatan dibuang, pelet dilarutkan dengan 750 µl ddh 2 O lalu dipindahkan ke tabung mikro. Larutan kemudian diekstrak tiga kali berturut-turut masing-masing dengan fenol, Ph : Ch : I dan Ch : I (sebanyak 1 kali volume supernatan). Tiap ekstraksi diikuti dengan sentrifugasi pada kecepatan rpm, 15 menit dan 4 C. Lapisan atas dipindahkan ke tabung mikro baru lalu ditambahkan Na-asetat 3 M, ph 5.8 sebanyak 0.1 kali volume dan etanol absolut sebanyak 3 kali volume. Larutan disimpan dalam freezer suhu -40 C selama 3 jam. Setelah 3 jam, larutan disentrifugasi pada kecepatan rpm, 4 C selama 30 menit. Supernatan dibuang, pelet dicuci dengan 100 L etanol 70% dan disentrifugasi pada rpm, 4 C selama 5 menit. Etanol dibuang, pelet disentrifugasi lagi pada kecepatan rpm, 4 C, selama 2 menit. Pelet dikeringanginkan beberapa saat lalu ditambah 30 µl DEPC.ddH 2 O. Jumlah inilah yang didapat sebagai stok RN. Isolasi RN Lateks Isolasi RN lateks dilakukan dengan metode Chaidamsari et al (2005) yang telah dimodifikasi. Sebanyak 6 ml sampel lateks yang telah ditambah 6 ml buffer ekstraksi dipanaskan pada suhu 50 C selama 1 jam lalu disentrifugasi 30 menit pada kecepatan rpm dan suhu 20 C. Supernatan dipipet (dihitung volumenya) lalu diekstrak dengan larutan Ph : Ch : I sebanyak 1 kali volume supernatan kemudian disentrifugasi lagi 10 menit pada kecepatan rpm, suhu 4 C. Lapisan atas dipindahkan ke tabung sentrifusa baru dan ditambah Ch : I 1 kali volume, disentrifugasi lagi selama 10 menit, rpm, 4 C. Lapisan atas diambil dan ditambah LiCl 8 M hingga konsentrasi LiCl 2 M lalu disimpan semalam pada suhu 4 C. Setelah semalam, larutan disentrifugasi pada kecepatan rpm, suhu 4 C selama 30 menit. Pengerjaan selanjutnya dilakukan pada kondisi dingin (dalam penangas es). Supernatan dibuang, pelet dilarutkan dengan 750 µl ddh 2 O lalu dipindahkan ke tabung mikro. Larutan diekstrak berturut-turut dengan larutan Ph : Ch : I dan Ch : I (sebanyak 1 kali volume). Tiap ekstraksi diikuti dengan sentrifugasi selama 10 menit, kecepatan rpm pada suhu 4 C. Lapisan atas dipindahkan ke tabung baru lalu diendapkan dengan Na-asetat 3 M, ph 5.8 sebanyak 0.1 kali volume dan etanol absolut sebanyak 3 kali volume. Larutan disimpan dalam freezer pada suhu -40 C selama 3 jam. Setelah 3 jam, larutan disentrifugasi pada kecepatan rpm, 4 C selama 30 menit. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 100 µl etanol 70% kemudian disentrifugasi pada kecepatan rpm, suhu 4 C selama 5 menit. Etanol dibuang, tabung mikro berisi pelet disentrifugasi dengan kecepatan rpm, suhu 4 C, selama 2 menit untuk mengendapkannya. Pelet dikeringanginkan beberapa saat lalu ditambah 30 µl DEPC.ddH 2 O. nalisis Kemurnian dan Konsentrasi RN Larutan RN lateks dan kulit batang hasil isolasi dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif untuk mengetahui kemurnian dan konsentrasinya. Uji kemurnian RN dilakukan dengan dua cara. Pertama dengan metode spektrofotometri, membandingkan serapan larutan RN pada? 260 dan 280 nm (nilai 260/280) juga pada? 260 dan 230 nm (nilai 260/230). Larutan sampel RN sebanyak 2 µl dicampur dengan 198 µl DEPC.ddH 2 O dan diukur serapannya pada panjang gelombang 230, 260, dan 280 nm. Menurut Sambrook et al (1989), kemurnian larutan RN hasil isolasi dapat dikatakan baik jika nilai perbandingan serapan 260/280 nm antara Cara kedua dengan elektroforesis, sebanyak 5 µl sampel RN dicampur dengan 1 µl loading buffer menggunakan pipet mikro di atas kertas parafilm. Sampel yang telah dicampur dimasukkan ke dalam sumur gel dan dielektroforesis pada gel agarosa 1%, tegangan 25 volt selama 2 jam. Setelah itu, gel difoto dengan bantuan sinar UV dan jumlah pita yang terbentuk diamati. Bila dari hasil elektroforesis masih terdapat pita DN maka ditambahkan enzim DNase pada larutan RN lalu diinkubasi pada suhu dan waktu optimum kerja enzim DNase. Konsentrasi RN (uji kuantitatif) ditentukan dengan cara konversi nilai serapan larutan RN pada panjang

17 7 gelombang 260 nm dengan perbandingan bahwa 1 nilai pada serapan 260 nm sama dengan serapan RN dengan konsentrasi 40 µg/ml (Sauer et al 1994). Sintesis cdn Proses ini dilakukan dengan metode RT- PCR untuk mendapatkan utas pertama cdn yang akan digunakan sebagai templat (cetakan) untuk uji ekspresi gen HbCO2. Sebanyak 2 µg/ml larutan RN sampel kulit batang dan lateks hasil isolasi ditambahkan 1 µl primer oligo(dt)18 dan molecular water (MW) hingga volume totalnya 13 µl. Campuran kemudian diinkubasi dalam mesin PCR (Fermentas) pada suhu 65 C selama 10 menit. Setelah 10 menit, semua tabung dipindahkan segera ke penangas es lalu ditambahkan larutan campuran yang berisi 4 µl bufer RT, 1 µl inhibitor RNase (40 U/µL), 2 µl dntp sebagai substrat, dan 1 µl enzim reverse transcriptase (20 U/µL). Tabung kemudian dimasukkan lagi ke dalam mesin PCR dan diinkubasi pada suhu 55 C selama 30 menit dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 85 C (5 menit) untuk inaktivasi enzim dan mendenaturasi DN. Terakhir, suhu dikondisikan 10 C dan dapat dibiarkan selama yang diinginkan. Uji Ekspresi Gen HbCO2 Uji ekspresi gen HbCO2 dilakukan dengan elektroforesis hasil PCR cdn dengan primer H4. Metode PCR berdasarkan prosedur pada Kit Roche. Pertama, dibuat larutan campuran berisi 2.5 µl buffer complete RT-PCR (Roche), 1 µl dntp, 1 µl primer H4 Forward, 1 µl primer H4 Reverse, 1 µl enzim Taq polimerase dan 17.5 µl MW (total 24 µl). Volume larutan campuran yang dibuat dikalikan sesuai jumlah sampel. Tiap 24 µl larutan campuran dipipet ke dalam tabung mikro, diletakkan dalam penangas es lalu ditambahkan 1 µl cdn sampel. Primer aktin ditambahkan pada sampel yang perlu diketahui kualitas cdn-nya. Larutan diinkubasi dalam mesin PCR (Fermentas) yang telah diatur suhu dan waktunya. Denaturasi pada suhu 94 C selama 30 detik, suhu penempelan primer 55 C selama 1 menit dilanjutkan dengan 72 C selama 1 menit untuk aktivasi enzim Taq polimerase dan suhu 72 C selama 7 menit untuk proses polimerasi. Proses PCR dilakukan sebanyak 35 siklus. Setelah itu, dilakukan inaktivasi enzim Taq polimerase pada suhu 10 C. HSIL DN PEMBHSN Isolasi RN Total Sampel Kulit Batang dan Lateks Gen HbCO2 dicari pada kulit batang Hevea brasiliensis karena jaringan ini merupakan tempat terjadinya metabolisme pembentukan lateks tepatnya pada pembuluh lateks atau laticiferous vessel (Dalimunthe 2001). Ekspresi gen ini juga diamati pada lateks sebagai produk dari pembuluh lateks tanaman karet. Isolasi RN untuk sampel kulit batang dimulai dengan penggerusan sampel yang bertujuan menghancurkan dinding sel. Umumnya RN lebih rentan terhadap degradasi enzimatik dibandingkan DN sehingga senyawa diethyl pirocarbonate (DEPC) ditambahkan sebagai denaturan kuat untuk mencegah kerja RNase, yaitu enzim yang dapat mendenaturasi RN. Hancurnya dinding sel menyebabkan sitoplasma beserta RN total keluar dari sel sehingga mudah diekstrak. Nitrogen cair diperlukan pada proses ini untuk menjaga agar RNase tetap inaktif selain juga untuk membekukan jaringan agar mudah dihancurkan (Koolman & Roehm 2005). Polivinil pirolidon ditambahkan untuk mengikat polifenol. Polifenol merupakan senyawa umum pada jaringan tanaman yang dapat menginaktifkan protein sehingga menghambat reaksi lanjutan seperti PCR (Knight 2004). Komponen cetyl trimethylammonium bromide (CTB) dalam buffer ekstraksi berfungsi sebagai antiseptik terhadap bakteri dan jamur. EDT berguna untuk mengikat Mg 2+ (chelating agent) sehingga mempermudah lisis membran sel dan menghambat kerja RNase (Mg 2+ merupakan kofaktor RNase). Merkaptoetanol bekerja sebagai antioksidan yang memangsa (scavenging agent) radikal hidroksil (Knight 2004) sedangkan tris-hcl merupakan komponen bufer untuk menjaga kestabilan ph larutan. Penggunaan senyawa pelarut organik seperti fenol, kloroform dan isoamilalkohol pada proses ekstraksi bertujuan memisahkan kontaminan seperti DN dan protein dari RN. Enzim DNase ditambahkan pada sampel yang masih mengandung DN untuk mendegradasi DN. Senyawa LiCl, natrium asetat dan etanol berguna untuk mengendapkan RN sehingga RN dapat terpisah dari senyawa kontaminan (Chaidamsari et al 2005).

18 8 Isolasi RN yang baik akan menghasilkan dua pita utuh (Gambar 4). Kedua pita tersebut adalah rrn berukuran 28 S dan 18 S yang merupakan rrn sitoplasma utama pada tanaman (Heldt 2005). RN 28 S RN 18 S Gambar 4 Elektroforegram RN lateks dengan pita yang utuh. Kemurnian RN Kulit Batang dan Lateks Hasil Isolasi Kemurnian RN kulit batang dan lateks Hevea brasiliensis hasil isolasi ditentukan dengan metode spektrofotometri dan elektroforesis. Pengukuran serapan larutan dilakukan pada panjang gelombang 230, 260 dan 280 nm. Basa-basa bernitrogen pada molekul RN menyerap sinar ultraviolet (UV) maksimum pada panjang gelombang 260 nm. Berbeda dengan asam nukleat, kontaminan protein memiliki serapan UV maksimum pada panjang gelombang 280 nm. Kontaminasi fenol dapat diketahui pada panjang gelombang 230 nm. Selain fenol, garam-garam chaotropic juga dapat menimbulkan puncak (peak) pada? (Sruhig & mberger 1994). Larutan RN dikatakan memiliki kemurnian yang baik apabila nilai perbandingan serapan? 260/280 nm dan serapan? 260/230 nm antara (Sambrook et al 1989). Bila nilai perbandingan kurang dari 1.8, larutan RN tersebut dapat dikatakan masih banyak mengandung kontaminan seperti protein, fenol, garam-garam chaotropic atau polisakarida. Jika nilai perbandingan melebihi 2, kemungkinan besar masih terdapat DN dalam larutan. Hal ini karena serapan maksimum DN sama dengan RN (260 nm) sehingga adanya DN dalam larutan akan membuat nilai perbandingan serapan RN lebih tinggi (O Connell 2002). Elektroforesis diperlukan untuk memastikan adanya DN kontaminan dalam sampel. Tabel 2 menunjukkan beberapa contoh kemurnian sampel RN kulit batang dan lateks beserta nilai perbandingan serapan tertinggi dan terendahnya masing-masing (cetak tebal). Nilai kemurnian RN kulit batang berkisar antara sedangkan RN lateks berkisar antara Dilihat dari nilai tersebut, secara umum dapat dikatakan hasil isolasi RN lateks relatif lebih tinggi kemurniannya dibanding RN kulit batang. Kisaran nilai kemurnian RN kulit batang menunjukkan bahwa beberapa sampel RN kulit batang masih mengandung kontaminan. Hal ini dapat terjadi disebabkan terbawanya fase fenolik saat proses ekstraksi. Selain itu, isolasi RN kulit batang lebih sulit mendapatkan kemurnian tinggi karena lebih banyak mengandung senyawa polifenol dan polisakarida dibandingkan sampel lateks. Kontaminan DN akan terlihat setelah hasil elektroforesis gel dilihat dengan bantuan sinar UV seperti pada sampel nomor 10, 11, 12, 13 yang nilai perbandingan serapannya lebih dari 2.0 (Gambar 5). Sampel yang masih terkontaminasi DN akan ditambah dengan enzim DNase untuk mendegradasi DN sebelum digunakan untuk proses RT-PCR. Tabel 2 Nilai kemurnian RN beberapa sampel kulit batang dan lateks No sampel 260 nm (260/280) (260/230) K K K K K K K L L L L L L L K = kulit batang; L = lateks; = nilai serapan (a) DN 28 S 18 S (b) Gambar 5 Elektroforegram RN kulit batang (a) nilai kemurnian kurang dari 1.8 (b) nilai kemurnian lebih dari 2.0.

19 9 Konsentrasi RN Kulit Batang dan Lateks Hasil Isolasi Konsentrasi RN hasil isolasi diperkirakan dengan cara spektrofotometri. Menurut Sauer et al 1994, satu nilai serapan () larutan RN pada panjang gelombang 260 nm merupakan serapan RN dengan konsentrasi 40 g/ml sehingga konsentrasi RN didapat dari perhitungan nilai serapan larutan RN pada? 260 nm dikalikan 40 g/ml dikalikan faktor pengenceran (100 kali). Tabel 3 menunjukkan beberapa contoh konsentrasi RN kulit batang dan lateks beserta nilai tertinggi dan terendahnya masing-masing (cetak tebal). Konsentrasi RN kulit batang bervariasi antara 104 hingga 1012 µg/ml sedangkan konsentrasi RN lateks berkisar antara 108 hingga 3798 µg/ml. Konsentrasi RN hasil perhitungan dikonfirmasi dengan elektroforesis, caranya dengan membandingkan tingkat kecerahan pita RN pada gel. Konsentrasi larutan RN yang digunakan untuk elektroforesis dibuat sama, yaitu 250 g/ml dengan tujuan agar intensitas cahaya yang dihasilkan oleh semua pita sampel dapat dibandingkan. Secara teori, pada pita RN yang utuh, makin cerah pita RN pada gel, makin tinggi konsentrasinya. Hal ini tidak berlaku jika kita mengamati pita RN kulit batang nomor 27 (konsentrasi tertinggi) dan nomor 58 (konsentrasi terendah) yang tingkat kecerahan pitanya hampir sama. Kejadian ini menunjukkan bahwa konsentrasi RN nomor 27 sebenarnya lebih rendah daripada yang terukur oleh spektrofotometer akibat sampel tersebut tidak murni. Kontaminasi DN dapat menyebabkan nilai perbandingan serapan larutan RN lebih tinggi (Gambar 6). Terlihat juga dari tingkat kecerahan dan keutuhan pita, secara umum dapat dikatakan perolehan konsentrasi RN lateks lebih tinggi daripada RN kulit batang (Tabel 3). Perbedaan perolehan konsentrasi antara RN kulit batang dan RN lateks dapat disebabkan karena kurang halusnya bubuk kulit batang saat digerus. Semakin halus bubuk kulit batang, semakin luas permukaannya sehingga makin banyak sel yang dapat diekstrak. Lateks lebih mudah diekstrak RN-nya karena tidak berupa sel (hanya cairan). Konsentrasi RN kulit batang yang rendah dapat juga disebabkan oleh proses pengocokan yang kurang kuat saat ekstraksi dengan buffer ekstraksi sehingga tidak semua sel kulit batang terlisis. Tabel 3 Konsentrasi RN beberapa sampel kulit batang dan lateks No sampel (260 nm) Konsentrasi ( g/ml) K K K K K K L L L L L L K = kulit batang; L = lateks (a) (b) Gambar 6 Elektroferegram (a) RN kulit batang konsentrasi rendah (b) RN lateks konsentrasi tinggi. Ekspresi Gen HbCO2 pada Kulit Batang Terekspresi atau tidaknya gen HbCO2 dilihat dari ada tidaknya pita gen pada gel elektroforesis sedangkan tingkat ekspresinya dilihat dan dibandingkan dari intensitas kecerahan pita. Ukuran gen HbCO2 adalah 510 bp sehingga pita DN yang dicari adalah yang sejajar atau dekat dengan pita marker kelima dari bawah (ukuran 500 bp). Pengamatan selama lima bulan menunjukkan bahwa gen HbCO2 pada kulit batang terekspresi tiga hari setelah pemberian etefon. Kontrol kulit batang dengan pemberian etefon (K1) memiliki tingkat ekspresi amat tinggi sementara kontrol kulit batang tanpa etefon (K9) tidak menunjukkan ekspresi gen ini (Gambar 7). Sampel beserta kontrol lateks dengan dan tanpa pemberian etefon (L1 dan L9) tidak memperlihatkan ekspresi gen HbCO2 (tidak muncul pita DN pada gel) sehingga diduga bahwa gen HbCO2 tidak terekspresi pada

20 10 lateks. Sampel lateks tersebut kemudian dielektroforesis lagi dengan menambahkan primer aktin untuk memastikan ada tidaknya RN total dalam larutan. Elektroforegram menunjukkan hanya terdapat pita aktin pada semua sampel lateks yang diuji kembali tanpa ada pita lain pada gel (Gambar 8). Hal ini dilihat dari ukuran pita yang muncul pada gel terletak antara pita marker kedua (200 bp) dan ketiga (300 bp) dari bawah yang sesuai dengan ukuran aktin yaitu 290 bp. Hasil ini memastikan bahwa gen HbCO2 memang tidak terekspresi pada lateks. ktin adalah komponen mikrofilamen, merupakan protein yang paling melimpah di dalam sel eukariot dan selalu dibutuhkan oleh sel (Koolman & Roehm 2005). Protein yang selalu dibutuhkan oleh sel, akan disintesis secara konstan sehingga mrn-nya akan selalu ada pada sitoplasma tanpa terpengaruh kondisi perlakuan. Sifat tersebut membuat mrn aktin dalam sampel uji dapat dijadikan kontrol internal sebagai petunjuk bahwa pada larutan hasil isolasi mengandung RN total. Terkadang pita hasil elektroforesis tidak utuh tetapi memanjang vertikal dan buram (smear). Hal ini dapat disebabkan RN terdegradasi (rusak) akibat aktivitas enzim atau suhu annealing yang tidak tepat. Munculnya pita lain pada gel dapat disebabkan primer yang digunakan kurang spesifik sehingga primer menempel di sembarang tempat dan akhirnya pita DN yang muncul lebih dari satu Gambar 7 Ekspresi gen HbCO2 pada beberapa sampel kulit batang Gambar 8 Elektroforegram cdn sampel lateks dengan primer aktin. Pengaruh Penyadapan terhadap Ekspresi Gen HbCO2 Kulit Batang Tinggi rendahnya ekspresi gen HbCO2 dapat dilihat dari tingkat kecerahan pita DN pada gel elektroforesis yang dapat juga dinyatakan secara semikuantitatif menggunakan program UN-SCN-IT Gel 6.1. Prinsip program tersebut membandingkan nilai piksel pita sampel yang terdeteksi dengan nilai piksel pita marka sebagai standar yang diberi nilai tertentu kemudian dikonversi menjadi satuan konsentrasi (ng) melalui persamaan kurva standar. Konsentrasi pita gen yang dihasilkan dari program ini lebih tepat diinterpretasikan sebagai tingkat ekspresi gen (Tabel 4). Hasil uji ekspresi gen HbCO2 pada sampel kulit batang menunjukkan gen HbCO2 mulai terekspresi pada penyadapan kedua dengan ekspresi paling tinggi pada frekuensi penyadapan dua hari sekali (s2d2). Ekspresi gen HbCO2 pada frekuensi penyadapan empat (s2d4) dan enam hari sekali (s2d6) tidak jauh berbeda (Gambar 9). Setelah seminggu, pengambilan sampel tidak dilakukan per hari perlakuan penyadapan tetapi diambil bersamaan sebulan sekali hingga bulan kelima. Pengamatan per bulan menunjukkan ekspresi tertinggi gen HbCO2 terjadi pada bulan pertama untuk penyadapan s2d2, bulan kedua untuk penyadapan s2d4 dan bulan ketiga untuk penyadapan s2d6. Gen HbCO2 paling sering dan paling tinggi ekspresinya pada kelompok s2d2 namun ekspresi gen ini juga berhenti lebih awal, yaitu pada bulan ketiga sementara kedua kelompok lain terhenti pada bulan keempat. Hal ini memberi kemungkinan bahwa penyadapan dengan frekuensi tinggi (kurang dari 4 hari sekali) menginduksi ekspresi gen HbCO2 lebih tinggi dan sering tetapi juga lebih cepat terhentinya. Ekspresi gen HbCO2 yang cenderung lebih tinggi pada kelompok s2d2 diakibatkan pelukaan tanaman karena penyadapan. Seperti yang telah disebutkan, etilena merupakan salah satu hormon tanaman yang merespon cekaman lingkungan (Salisbury & Ross 1995; Wang et al 2002). Penyadapan direspon tanaman sebagai salah satu cekaman lingkungan berupa pelukaan. Intensitas pelukaan tanaman yang lebih sering akan meningkatkan ekspresi gen HbCO2 sebagai salah satu anggota gen multifamili penyandi enzim CO yang berperan dalam katalisis reaksi perubahan asam aminosiklopropana karboksilat menjadi etilena.

21 11 Tabel 4 Tingkat ekspresi gen HbCO2 terhadap pengaruh pelukaan Hari Tingkat ekspresi ke- d2 d4 d (-) = tidak dilakukan penyadapan. Tingkat ekspresi Hari ke- s2 d2 s2 d4 s2 d6 Gambar 9 Ekspresi gen HbCO2 terhadap pengaruh pelukaan. Pengaruh Etefon terhadap Ekpresi gen HbCO2 Kulit Batang Etefon sebagai stimulan lateks ikut diteliti pengaruhnya terhadap ekspresi gen HbCO2 karena selain sebagai yang paling umum diapakai di perkebunan, juga telah terbukti mempengaruhi kadar etilena endogenus tanaman (Jetro 2007). Tabel 5 memperlihatkan ekspresi tertinggi gen HbCO2 sampel tanpa etefon (s2d4) masih jauh di bawah ekspresi tertinggi sampel dengan pemberian etefon meski frekuensi penyadapannya sama, yaitu empat hari sekali. Hal ini menunjukkan pengaruh etefon dalam meningkatkan ekspresi gen HbCO2. Gen HbCO2 terekspresi tiga hari setelah pemberian etefon yang merupakan ekspresi tertinggi untuk perlakuan etefon tiga (E3) dan enam (E6) kali setahun. Ekspresi gen HbCO2 perlakuan etefon 12 kali setahun (E12) mencapai puncaknya sebulan setelah buka sadap dan tidak terekspresi lagi pada bulan ketiga meskipun tetap diberi etefon hingga bulan kelima. Serupa dengan efek penyadapan s2d2, ekspresi gen HbCO2 kelompok E12 juga berhenti lebih awal dari dua kelompok lainnya yang baru berhenti pada bulan keempat (Gambar 10). Penyadapan yang lebih cepat dari waktu normal regenerasi lateks, yaitu 4-5 hari (Sumarmadji 2001) dan pemberian etefon terlalu sering, yaitu lebih dari 6 kali setahun (Balai Penelitian Perkebunan Sembawa 2007) mempercepat terhentinya ekspresi gen HbCO2. Kenaikan ekspresi gen HbCO2 pada sampel yang diberi etefon diduga merupakan regulasi sel untuk menjaga kestabilan kadar etilena endogen tanaman akibat cekaman fisiologis. Secara umum, gen HbCO2 hanya terekspresi tiga bulan di awal tahun kelima tanaman. Hal ini karena HbCO2 merupakan transient gene, yaitu gen yang hanya diekspresikan selama periode tertentu pada tahap perkembangan tanaman (Kuswanhadi 2005). Tabel 5 Tingkat ekspresi gen HbCO2 terhadap pemberian etefon Hari Tingkat ekspresi ke- E3 E6 E (-) = tidak dilakukan penyadapan; cetak tebal merupakan hari pemberian etefon Tingkat ekspresi Hari ke- s2 d4 s2 E6 d4 s2 E3 d4 s2 E12 d4 Gambar 10 Ekspresi gen HbCO2 terhadap pengaruh pemberian etefon.