ISOLASI FRAGMEN cdna DARI GEN PENYANDI AKTIN DARI Melastoma malabathricum

Transkripsi

1 MAKARA, SAINS, VOL. 14, NO. 2, NOVEMBER 2010: ISOLASI FRAGMEN cdna DARI GEN PENYANDI AKTIN DARI Melastoma malabathricum Saleha Hannum 1,2, Kinya Akashi 3, Utut Widyastuti Suharsono 1,2, Alex Hartana 2, Akiho Yokota 3, dan Suharsono 1,2*) 1. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680, Indonesia 2. Departemen Biologi, FMIPA, Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680, Indonesia 3. Graduate School of Biological Sciences, Nara Institute of Science and Technology, Nara , Japan *) Abstrak Melastoma malabathricum adalah tumbuhan yang tumbuh baik pada tanah asam dengan kelarutan Al yang tinggi, sehingga dapat digunakan sebagai tanaman model untuk toleransi terhadap cekaman aluminium dan asam. Analisis ekspresi gen-gen yang diinduksi oleh aluminium pada M. malabathricum memerlukan kontrol internal. Aktin adalah gen housekeeping yang biasa digunakan sebagai kontrol internal. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengklon fragmen cdna MmACT yang menyandi aktin dari M. malabathricum. RNA total telah berhasil diisolasi dan dijadikan sebagai cetakan untuk sintesis cdna total melalui transkripsi balik. Empat fragmen cdna MmACT telah berhasil diisolasi dan disisipkan ke dalam plasmid pgem-t Easy. Keempat fragmen ini selanjutnya dinamakan fragmen MmACT1, MmACT2, MmACT3, dan MmACT4. Analisis urutan nukleotida menunjukkan bahwa fragmen MmACT1 dan MmACT2 berukuran 617 pb, dan fragmen MmACT3 dan MmACT4 berukuran 735 pb. Antar keempat fragmen cdna MmACT ini memiliki kemiripan nukleotida sekitar 78%-99%, dan kemiripan asam amino sekitar %. Analisis hubungan filogenetik berdasarkan urutan asam amino menunjukkan bahwa pada ketidakmiripan 1%, MmACT1, MmACT2, MmACT3 mengelompok dengan ACT5 Populus trichocarpha sementara MmACT4 mengelompok dengan ACT9 P. trichocarpa dan ACT1 Gossypium hirsutum. Kedua kelompok ini terpisah dari aktin tumbuhan monokotil. Keempat fragmen MmACT ini telah terdaftar di GenBank/EMBL/DDBJ dengan nomor aksesi AB500686, AB500687, AB500688, dan AB Abstract Isolation of cdna Fragment of Gene Encoding for Actin from Melastoma malabthricum. M. malabathricum grows well in acidic soil with high Al solubility, thereby it can be used as a model plant for tolerance to aluminum and acid stresses. Actin is housekeeping gene used as an internal control for gene expression analysis. The objective of this research was to isolate and clone the cdna fragments of MmACT encoding for actin of M. malabathricum. Total RNA was isolated and used as the template for cdna synthesis by reverse transcription. Four cdna fragments of MmACT, called MmACT1, MmACT2, MmACT3, and MmACT4, had been isolated and inserted into pgem-t Easy plasmid. Nucleotide sequence analysis showed that the size of MmACT1 and MmACT2 is 617 bp, whereas MmACT3 and MmACT4 is 735 bp. The similarity among these four MmACT is about 78%-99% based on nucleotide sequence and about 98%-100% based on amino acid sequence. Phylogenetic analysis based on amino acid sequence showed that at 1% dissimilarity, the MmACT1, MmACT2, MmACT3 and the ACT5 Populus trichocarpha are clustered in one group, while the MmACT4 is grouped with ACT9 P. trichocarpa and ACT1 Gossypium hirsutum, and these two groups are separated from actin group of monocotyledonous plants. The sequence of MmACT fragments were registered in GenBank/EMBL/DDBJ database with accession numbers AB500686, AB500687, AB500688, and AB Keywords: actin, cdna, cloning, internal control gene, Melastoma malabathricum 1. Pendahuluan Aktin adalah protein yang sangat penting bagi sel eukariotik. Protein ini berperan penting dalam membentuk jaringan yang memberikan dukungan mekanik sel, menentukan bentuk sel, pergerakan sel, dan juga pembelahan sel [1,2]. Aktin juga penting dalam morphogenesis sel pada tumbuhan, sebagai komponen 163

2 164 MAKARA, SAINS, VOL. 14, NO. 2, NOVEMBER 2010: dinding sel, terlibat dalam pertumbuhan rambut akar, sel trikom, tabung pollen, perpanjangan sel dan apikal meristem [3]. Gen aktin termasuk housekeeping gene [4], yaitu gen yang memiliki tingkat eksperesi yang stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan. Sifat gen yang seperti ini menjadikan gen aktin digunakan sebagai kontrol internal pada analisis ekspresi, khususnya analisis ekspresi gen dengan metode qrt- PCR (quantitative reverse transcriptase polymorphisme chain reaction) yang merupakan metode analisis ekspresi yang berkembang saat ini. Gen aktin telah digunakan sebagai kontrol ekspresi gen pada kentang [5], kedelai [6], dan padi [7]. Aktin termasuk salah satu kontrol internal yang paling stabil pada uji ekspresi gen di daun dan akar Cichorium intybus [8]. Melastoma malabathricum adalah tumbuhan yang dapat tumbuh dengan baik pada lahan asam dengan konsentrasi aluminium (Al) yang tinggi [9]. Tumbuhan ini sangat toleran terhadap cekaman asam dan Al sehingga sangat baik digunakan sebagai tanaman model untuk toleransi terhadap asam dan Al. Untuk mempelajari ekspresi gen-gen pada M. malabathricum, informasi housekeeping gene dari tumbuhan tersebut sangat dibutuhkan sebagai kontrol internal. Sampai saat ini informasi tersebut belum ada. Sementara itu, beberapa gen dari M. malabathricum yang diduga terlibat dalam toleransi tumbuhan tersebut terhadap cekaman asam dan Al seperti, multidrug resistance associated protein [10], metallothionein type 2 (Mt2) [11], dan H+-ATPase membran plasma [12] belum dipelajari ekspresinya. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengklon gen aktin dari M. malabathricum. 2. Metode Penelitian Isolasi RNA total. Isolasi RNA mengikuti metode CTAB [10] yang dimodifikasi. Daun sebanyak 0,1 g digerus dengan bantuan nitrogen cair di dalam mortar sampai menjadi tepung. Hasil gerusan dimasukkan ke ependorf yang telah berisi 500 µl buffer ekstraksi (2% CTAB, 2% PVP 40000, 100 mm Tris-HCl ph 8, 20 mm EDTA, 1,4 M NaCl dan 1% β-mercapto ethanol), kemudian divorteks dan diinkubasikan pada suhu 65 o C selama 10 menit. Sebelum ditambahkan 1 x volume kloroform : isoamil alkohol (24 : 1), suspensi didinginkan terlebih dahulu. Campuran kemudian divorteks dan disentrifugasi pada kecepatan x g (TOMY MX- 205) pada suhu 4 o C selama 10 menit. Cairan bagian atas dipindahkan ke ependorf baru, ditambahkan 0,25 volume 10 M LiCl, dan diinkubasi pada suhu -30 o C selama 2,5 jam. Campuran disentrifugasi pada x g pada suhu 4 o C selama 15 menit. Cairan dibuang, dan endapan RNA total disuspensikan dalam 500 µl TE (10 mm Tris ph 7,4, 1 mm EDTA) dan ditambahkan 1 x volume phenol ph 9, divorteks dan disentrifugasi pada x g pada suhu 20 o C selama 10 menit. Cairan bagian atas yang mengandung RNA total diambil, dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml dan diekstraksi kembali dengan 1 x volume fenol : kloroform : isoamilalkohol (25 : 24 : 1), divortek dan disentrifugasi pada kecepatan x g suhu 4 o C selama 10 menit. Cairan bagian atas diambil, dipindahkan ke tabung 1,5 ml yang baru kemudian ditambah dengan 0,25 volume 10 M LiCl dan diinkubasi pada suhu 30 o C selama 2,5 jam. Cairan disentrifugasi pada kecepatan x g, suhu 4 o C selama 15 menit. Endapan RNA total dibilas dengan 500 µl alkohol 70% dan disentrifugasi pada x g suhu 4 o C selama 5 menit. Endapan RNA total dikeringkan dengan vaccum dryer dan disuspensikan di dalam dh 2 O. Kualitas dan kuantitas RNA ditentukan dengan spektrometer UV pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Keutuhan RNA total dianalisis dengan elektroforesis pada gel agarose 1% di dalam larutan penyangga TAE 1x. Visualisasi RNA total dilakukan di atas UV transiluminator GelDoc (Labquip) setelah diwarnai dengan EtBr (0,5 µg/ml) selama 15 menit dan dibilas dengan air. Sintesis cdna total. Sintesis cdna total dilakukan dengan mencampurkan 1 µg RNA total, 10 pmol oligodt, dan ditambah dh 2 O untuk volume total reaksi 20 µl, kemudian inkubasi di 65 o C selama 5 menit dan 4 o C selama 5 menit. Ke dalam campuran ditambahkan 1x RT buffer, 1mM dntp, 40 U RNAse inhibitor, dan 100 U enzim ReverTraAce (Toyobo). Campuran diinkubasi 42 o C selama 30 menit, 99 o C 5 menit, dan 4 o C 5 menit. Isolasi fragmen cdna MmACT. Fragmen cdna MmACT diisolasi dengan PCR menggunakan degenerate primer untuk aktin tumbuhan [13], yaitu PlAc46S (ATGGTNGGNATGGGNCARAA) sebagai forward primer, dan PlAc245N (GTDATNACYTGNCCRTCNGG) dan PlAc284N (ATRTCNACRTCRCAYITCATDAT) sebagai reverse primer. Komposisi PCR untuk amplifikasi cdna MmACT adalah 1 µl cdna, 1x buffer taq, 4 mm dntp mix, 10 pmol primer forward, 10 pmol primer reverse, 2U enzim Taq DNA polymerase (Toyobo), dan dh 2 O dengan volume reaksi 20 µl. PCR dilakukan pada kondisi pra PCR 94 o C, 5 menit, denaturasi 94 o C, 30 detik, penempelan primer pada 52 o C, 30 detik, dan pemanjangan 72 o C, 1 menit, dengan 30 siklus, dan pasca PCR pada 72 o C, 5 menit, diikuti dengan 15 o C, selama 10 menit. Pengklonan fragmen cdna MmACT. Fragmen MmACT diligasikan dengan pgem-t Easy (Promega Inc.) dengan mencampur 1 µl hasil PCR, 25 ng pgem- T Easy, 1,5 U T4 DNA ligase dan 2,5 µl 2x rapidbuffer ligasi dan dh2o dalam volume total 5 µl, dan diinkubasi 1 jam dalam suhu ruang. Hasil ligasi diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α mengikuti prosedur [14].

3 MAKARA, SAINS, VOL. 14, NO. 2, NOVEMBER 2010: Seleksi E.coli yang mengandung vektor rekombinan. E. coli galur DH5α yang mengandung pgemt-easy rekombinan diseleksi menggunakan seleksi resistensi terhadap ampisilin dan seleksi biru putih. Konfirmasi koloni putih mengandung vektor rekombinan yang tersisipi fragmen MmACT menggunakan PCR koloni dan memotong plasmid rekombinan dengan enzim EcoR1 (Promega Inc.). Pengurutan DNA dan analisis urutan DNA. Pengurutan DNA dilakukan dengan menggunakan automatid DNA sequencer (ABI Prism 3700 squencer, Perkin Elmer, USA). Analisis kesejajaran cdna MmACT dilakukan menggunakan program BLAST [15]. Analisis phylogenetik dilakukan dengan menggunakan program MEGA4 [16]. 3. Hasil dan Pembahasan Isolasi RNA total. RNA total dari M.malabathricum telah berhasil diisolasi dari daun muda. Berdasarkan pengukuran spektrofotometer, rasio OD260/OD280 dari RNA total adalah 1,91 yang menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi mempunyai kemurnian yang tinggi dari kontaminan protein. Elektroforesis RNA total untuk analisis keutuhannya menunjukkan adanya duapita RNA yang dominan. Kedua pita ini adalah RNA ribosomal (rrna) 28S dan 18S. Hasil ini menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi ini mempunyai keutuhan yang tinggi sehingga sangat baik digunakan sebagai cetakan (template) untuk sintesis cdna total. Isolasi fragmen cdna MmACT melalui PCR. PCR dengan cdna total sebagai cetakan dan primer degenerate PlAc46S dan PlAc245N menghasilkan fragmen cdna berukuran sekitar 600 pb dan dengan primer PlAc46S dan PlAc284N menghasilkan 750 pb (Gambar 1). Fragmen ini selanjutnya dinamakan fragmen MmACT (aktin M. malabathricum). PCR dgn primer reverse PIAc245N menghasilkan fragmen cdna yang lebih pendek (600 pb) dibanding primer reverse PIAc284N (750 pb), menunjukkan bahwa letak primer PIAc245 N lebih kearah hulu (ujung 5 ) dibanding primer PIAc284N. Hasil ini sesuai dengan posisi primer yang digunakan pada struktur umum gen aktin Arabidopsis thaliana yang menunjukkan bahwa primer PIAc254N berada lebih kearah hulu dari primer PIAc284N [13]. Pengklonan fragmen MmACT kedalam plasmid pgem-t Easy. Fragmen cdna kandidat MmACT yang berukuran sekitar 600 pb dan 750 pb telah diligasikan dengan plasmid pgem-t Easy di tengah gen lacz. Hasil ligasi telah diintroduksikan kedalam E. coli galur DH5α dan diseleksi di media seleksi yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG. E.coli yang tumbuh di media seleksi mengandung plasmid, sementara koloni yang berwarna putih mengandung plasmid rekombinan, dan koloni yang berwarna biru mengandung plasmid non-rekombinan. Adanya sisipan fragmen MmACT di tengah lacz menyebabkan gen lacz yang menyandi β-galactosidase(β-gal) yang mengubah substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru, tidak diekspresikan sehingga E. coli yang mengandung plasmid rekombinan menjadi berwarna putih. Empat koloni putih, yaitu masing-masing dua koloni dari klon rekombinan yang tersisipi fragmen 600 pb dan dua koloni dari klon rekombinan yang tersisipi 750 pb dikonfirmasi dengan PCR. PCR terhadap koloni putih menghasilkan fragmen DNA yang berukuran 600 pb dan 750 pb (Gambar 2). Hasil ini menunjukkan bahwa koloni putih mengandung fragmen MmACT. Untuk memastikan bahwa fragmen MmACT tersisip di dalam plasmid pgem-t Easy, DNA plasmid telah diisolasi dari koloni putih. Pemotongan terhadap DNA plasmid rekombinan dengan enzim EcoR1 yang mengapit daerah penyisipan menghasilkan dua fragmen, yaitu fragmen DNA berukuran 3000 pb dan 600 pb untuk klon rekombinan yang tersisipi fragmen cdna 600 pb, dan untuk plasmid yang tersisipi fragmen cdna berukuran 750 pb, menghasilkan fragmen DNA 3000 pb dan 750 pb. Fragmen DNA berukuran 3000 pb adalah vektor pgm- T Easy, sementara pita yang berukuran 600 pb dan 750 pb merupakan fragmen MmACT (Gambar 3). Hasil ini menunjukkan bahwa ke empat fragmen MmACT telah berhasil disisipkan kedalam pgem-t Easy. 1 2 Gambar 1. Fragmen MmACT Hasil PCR Menggunakan Primer PlAc46S dan PlAc245N (1), dan Primer PlAc46S dan PlAc284N (2) Gambar 2. PCR Koloni dari Fragmen Target 750 pb (1 & 2) dan 600 pb (3 & 4)

4 166 MAKARA, SAINS, VOL. 14, NO. 2, NOVEMBER 2010: Analisis fragmen MmACT. Pengurutan DNA terhadap ke empat fragmen MmACT menghasilkan urutan DNA (sequence) yang berbeda antara satu sisipan dengan sisipan lainnya. Hal ini terjadi karena primer yang digunakan untuk isolasi MmACT adalah primer degenerate yang memungkinkan menghasilkan fragmen DNA yang urutan nukleotidanya berbeda. Selain itu, aktin juga disandi oleh multigene family pada tanaman [17,18]. Pada A. thaliana, famili gen aktinnya terdiri dari 10 gen yang berbeda, delapan diantaranya adalah gen fungsional dan dua gen adalah pseudogen [13]. Dari kapas 15 gen aktin (GhACT) telah berhasil diisolasi [17]. Ke empat sisipan yang berbeda ini selanjutnya disebut MmACT1, MmACT2, MmACT3, dan MmACT4. Pengurutan nukleotida fragmen MmACT1 dan MmACT2 menghasilkan 617 pb yang menyandi 192 asam amino, sementara MmACT3 dan MmACT4 735 pb yang menyandi 231 asam amino. Ke empat fragmen cdna MmACT ini memiliki 78%-99% kemiripan nukleotida (Tabel 1) dan ke empat MmACT memiliki kemiripan asam amino sekitar 98%-100%. Analisis kesejajaran lokal berdasarkan urutan nukleotida dengan bank data di GenBank dengan program BLAST (basic local alignment search tool) menunjukkan bahwa fragmen MmACT1 dan MmACT2 memiliki kemiripan 83% dengan bagian aktin 7 P. trichocarpa, MmACT3 memiliki kemiripan 83% dengan aktin 5 P. trichocarpa (XM_ ), dan MmACT4 memiliki kemiripan 87% dengan aktin 9 P. trichocarpa (XM_ ). Adanya kesamaan yang tinggi (83%%-87%) fragmen MmACT dengan urutan nukleotida gen aktin tanaman lain yang telah lebih dahulu diisolasi (bank data) menunjukkan bahwa fragmen MmACT yang telah diisolasi dari M. malabathricum adalah kandidat gen aktin. Ke empat fragmen MmACT ini telah didaftar kandidat bank data GenBank/EMBL/DDBJ, masingmasing dengan nomor aksesi AB500686, AB500687, AB500688, dan AB Ke empat fragmen gen aktin ini adalah gen aktin yang pertama diisolasi dari M. malabathricum. Gen aktin ini sangat penting untuk analisis ekspresi gen di dalam M. malabathricum, khususnya untuk analisis ekspresi gen secara kuantitatif Analisis ekspresi gen secara kuantitatif dengan qrt- PCR memerlukan gen referensi sebagai kontrol internal. Gen aktin sudah digunakan sebagai kontrol internal untuk analisis qrt-pcr pada kentang [5], kedelai [6], padi [7], dan C. intybus [8]. Analisis ekspresi semua gen di dalam M. malabathricum dapat menggunakan ke empat gen MmACT ini. Analisis kesejajaran local berdasarkan urutan asam amino menunjukkan bahwa asam amino MmACT memiliki kemiripan yang tinggi dengan aktin P. trichocarpa, bahkan MmACT4 memiliki kemiripan 100% dengan bagian gen aktin 9 P. trichocarpa. Untuk melihat hubungan genetik MmACT dengan aktin dari tanaman lain, analisis phylogenetik yang berdasarkan pada urutan asam amino telah dilakukan (Gambar 4). Sementara A. thaliana mengelompok dengan yang lain pada ketidakmiripan lebih dari 2%. Hasil ini semakin menguatkan bahwa fragmen cdna yang diisolasi dari M. malabathricum adalah fragmen gen aktin. Berdasarkan struktur umum gen aktin A. thaliana [13] maka MmACT yang diisolasi dalam penelitian ini terletak di daerah antara ekson 2 dan ekson 3 (Gambar 5). Posisi MmACT diantara ekson 2 dan ekson 3 ini sangat penting dalam mendesain primer aktin yang digunakan untuk verifikasi keberhasilan cdna yang Tabel 1. Persentase Kemiripan Nukleotida antar cdna MmACT cdna MmACT1 MmACT2 MmACT3 MmACT1 100 MmACT MmACT MmACT MmACT4 PtACT9 GhACT1 OsACT ZmACT MaACT AtACT1 PtACT5 MmACT1 MmACT2 MmACT3 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 ketidakmiripan Gambar 3. Verifikasi DNA Plasmid Rekombinan Target 600 pb (1 & 2) dan 750 pb (3 & 4) dengan Enzim Restriksi EcoR1 Gambar 4. Hubungan Pylogenetik antara Aktin M. malabathricum (Mm), Populus trichocarpa (Pt), Gossypium hirsutum (Gh), Arabidopsis thaliana (At), Oryza sativa (Os), Zea mays (Zm) dan Musa acuminate AAA Group (Ma). Angka Menunjukkan Ketidakmiripan

5 MAKARA, SAINS, VOL. 14, NO. 2, NOVEMBER 2010: UTR 120 nt Ekson 1 Ekson 2 Ekson 3 Ekson 4 TAA Poly A ATG Gambar 5. Posisi Fragmen MmACT dalam Struktur Umum Gen Aktin A. thaliana [13] bebas dari kontaminasi DNA genom [11]. Sepasang primer yang didisain berdasarkan dua daerah ekson yang berbeda yang mengapit daerah intron dapat digunakan untuk mengetahui keberhasilan sintesis dan kemurnian cdna karena amplifikasi dengan cetakan cdna yang murni menghasilkan ukuran yang berbeda dibandingkan dengan menggunakan cetakan cdna yang terkontaminasi oleh DNA genom. cdna yang murni akan menghasilkan fragmen DNA yang ukurannya lebih pendek dibandingkan dengan yang terkontaminasi DNA genom karena hasil amplifikasi cdna yang murni tidak mengandung intron. 4. Simpulan 1 Empat fragmen cdna aktin dari M. malabthricum yang berhasil diisolasi berukuran 617 pb (MmACT1, MmACT2) dan 735 pb (MmACT3, MmACT4). Ke empat fragmen cdna MmACT ini memiliki kemiripan nukleotida sekitar 78%-99% dan kemiripan asam amino sekitar 98%-100%. Analisis hubungan phylogenetik berdasarkan urutan asam amino aktin menunjukkan bahwa ke empat fragmen MmACT ini mengelompok dengan ACT P. tricocharpa. Fragmen MmACT terletak diantara ekson 2 dan ekson 3 pada struktur umum gen aktin A.thaliana. Ke empat fragmen MmACT ini telah didaftarkan di bank data GenBank/EMBL/DDBJ dengan nomor aksesi AB500686, AB500687, AB500688, dan AB UcapanTerimaKasih 2 3 PIAc46S PIAc245N MmACT1;MmACT2 MmACT3;MmACT4 PIAc 284N 3 UTR 200 nt Terima kasih disampaikan kepada Proyek Hibah Kompetensi dari Ditjen Pendidikan Tinggi (DIKTI), Kementerian Pendidikan Nasional yang telah membiayai penelitian ini dengan judul: Isolasi dan ekspresi gen dalam rangka perakitan tanaman yang toleran terhadap cekaman asam dan aluminium, dan Program Sandwich DIKTI yang telah memberikan kesempatan kepada Saleha Hannum untuk melakukan penelitian di Nara Institute of Science and Technology Jepang. DaftarAcuan [1] M. Vantard, L. Blanchoin, Curr. Opin. Plant. Biol. 5 (2002) 502. [2] C.A. Blessing, G.T. Ugrinova, H.V. Goodson, Trends. Cell. Biol. 14 (2004) 435. [3] L.U. Gilliland, L.C. Pawloski, M.K. Kandasamy, R.B. Meagher, Plant. J. 33 (2003) 319. [4] L.L. Tu, X.L. Zhang, D.Q. Liu, S.X. Jin, J.L. Cao, L.F. Zhu, F.L. Deng, J.F. Tan, C.B. Zhang, Chinese Sci. Bull. 52/22 (2007) [5] N. Nicot, J. F. Hausman, L. Hoffmann, D. Evers, J. Exp. Bot. 56/421 (2005) [6] B. Jan, B. Liu, Y. Bin, W. Hou, C. Wu, T. Han, BMC Mol. Biol. 9/59 (2008) [7] J.L. Zhang, D.H. Liu, Z.H. Wang, C. Yu, J.H. Cao, C.T. Wang, D.M. Jin, Asian J. Plant Sci. 8 (2009) 285. [8] A. Maroufi, E.V. Bockstaele, M.D. Loose, BMC Mol. Biol. 11 (2010). [9] T. Watanabe, M. Osaki, Tree Physiology 22 (2002) 785. [10] Suharsono, S. Firdaus, U.W. Suharsono, Makara Sains 12 (2008) 102. [11] Suharsono, N. Trisnaningrum, L.D. Sulistyaningsih, U. Widyastuti, Biotropia 16 (2009) 28. [12] Muzuni, D. Sopandie, U.W. Suharsono, Suharsono. J. Agron. Indonesia 38 (2010) 67. [13] J.M. McDowell, S. Huang, E.C. McKinney, Y.Q. An, R.B. Meagher, Genetics 142 (1996) 587. [14] Suharsono, Hayati 9 (2002) 67. [15] S.F. Altschul, T.L. Madden, A.A. Schaffer, J. Zhang, W. Miller, Nucleic Acids Res. 25 (1997) [16] K. Tamura. J. Dudley, M. Nei, S. Kumar, Mol. Biol. Evol. 24 (2007) [17] X.B. Li, X.P. Pan, X.L. Wang, L. Cai, W.C. Yang, The Plant Cell 17 (2005) 859. [18] Y. Feng, Q. Liu, Q. Xue, J. Plant Physiol. 163 (2006) 67.