10 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Lapang Klinik Tanaman diklaten, Jawa Tengah dan Laboratorium Mikologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dari bulan Februari sampai Juli 2012. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu media persemaian dan penanaman padi berupa tanah dan kompos dengan perbandingan 1:1, biakan murni cendawan endofit hasil penelitian Nur asiah (2011) yaitu Nigrospora sp.1dan Acremonium sp. yang mempunyai korelasi negatif dengan serangan penggerek batang padi di lapangan, benih padi varietas Ciherang, media Potato Dextrose Agar (PDA), dan kelompok telur penggerek batang padi dari berbagai daerah di Klaten. Metode Penelitian Pembuatan Media Potato Dextrose Agar (PDA) Kentang sebanyak 200 g dikupas sampai bersih, dicuci, dan dipotong tipis. Potongan kentang dan akuades sebanyak 1000 ml direbus selama setengah jam dan disaring untuk diambil ekstraknya. Ekstrak kentang tersebut kemudian dimasak kembali, ditambahkan agar-agar putih sebanyak 15 g dan dekstrose sebanyak 20 g. Setelah mendidih campuran tersebut diangkat, dituang ke dalam labu erlenmeyer, ditutup kapas dan alumunium foil untuk disterilisasi ke dalam autoklaf. Pembuatan Media Beras Beras sebanyak 1 kg dicuci, direndam selama 24 jam dengan air bersih, ditiriskan sampai kering, dimasukkan ke dalam plastik tahan panas sebanyak 250
g beras/plastik, ditutup dengan pipa kecil dan kapas kemudian disterilisasi dalam autoklaf. 11 Perbanyakan Cendawan Endofit Biakan murni cendawan endofit Nigrospora sp.1 dan Acremonium sp. diremajakan kembali pada media PDA. Kegiatan dilakukan secara aseptik di laminar air flow. Biakan cendawan endofit pada PDA yang berumur ±10-14 hari dilubangi dengan menggunakan pelubang gabus kemudian menggunakan jarum inokulasi dipindahkan dalam media beras. Media beras tersebut diinkubasi selama ±14 hari dan diblender kering hingga menjadi tepung. Perlakuan Cendawan Endofit pada Benih Padi Benih padi varietas Ciherang direndam dalam air selama 24 jam untuk melunakkan kulit benih dan menjaga kelembabahan benih agar mudah berkecambah. Benih tersebut ditiriskan, diperam dengan tepung cendawan endofit sebanyak 10 g/kg benih padi dan didiamkan selama 24 jam dalam kondisi lembab dan gelap agar mudah berkecambah. Sebelum dilakukan penanaman, dilakukan terlebih dahulu pengujian terhadap perkecambahan benih yang telah diinokulasi cendawan endofit. Benih padi sebanyak 25 benih contoh diperam dalam cawan petri yang dilapisi kain gelap dan lembab. Setiap perlakuan memiliki tiga ulangan. Perlakuan yang diterapkan antara lain: inokulasi cendawan endofit Nigrospora sp.1, Acremonium sp., kombinasi Nigrospora sp.1 + Acremonium sp., dan kontrol (tanpa cendawan endofit). Pengamatan dilakukan terhadap persentase daya berkecambah benih yang telah diperam cendawan endofit selama 24 jam serta panjang akar dan tunas kecambah selama 48 jam. Daya perkecambahan dihitung dengan rumus: ni : jumlah benih contoh yang berkecambah N : jumlah benih contoh
12 Penanaman Benih Padi Tahapan dalam menanam padi antara lain persemaian dan pindah tanam. Benih yang telah diberi perlakuan disebar ke baki yang berisi media tanam berupa tanah dan kompos dengan perbandingan 1:1. Pengamatan bibit dilakukan setiap minggu pada 7 dan 21 hari setelah semai (HSS). Pengamatan dilakukan terhadap panjang akar dan tinggi bibit untuk melihat pengaruh cendawan endofit terhadap pertumbuhan tanaman padi. Bibit padi umur 21 HSS kemudian dipindah tanam ke ember yang berisi tanah dan kompos dengan perbandingan 1:1. Setiap ember ditanam dengan 10 tanaman padi. Masing-masing perlakuan memiliki 5 ulangan. Selain itu, penanaman juga dilakukan tanpa perlakuan larva penggerek batang padi untuk melihat pengaruh cendawan endofit terhadap pertumbuhan tanaman padi. Pengamatan dilakukan dengan menghitung tinggi tanaman dan jumlah anakan setiap minggunya pada 1, 2, 3, 4, dan 5 minggu setelah tanam (MST). Teknik budidaya yang dilakukan antara lain: pengolahan tanah, pemupukan, dan penyiangan gulma. Pengolahan tanah dilakukan dengan menjaga tanah agar selalu lembab. Pemupukan NPK dilakukan pada 21 HSS dan 3 MST sebanyak 2 g/ember. Pemupukan dilakukan untuk memberikan nutrisi bagi pertumbuhan tanaman padi. Penyiangan gulma dilakukan dengan mencabut gulma yang tumbuh di sekitar tanaman. Media tanam dalam ember kemudian ditutup menggunakan kurungan plastik agar terhindar dari kondisi ekstrim lingkungan dan hama/penyakit lain. Pengumpulan Kelompok Telur Penggerek Batang Padi Kelompok telur penggerek batang padi diambil dari berbagai daerah di Klaten, Jawa Tengah. Klaten merupakan daerah yang memiliki hamparan sawah padi yang sangat luas dengan sistem pola tanam padi yang beragam. Selain itu, serangan penggerek batang padi terjadi di Klaten sehingga peluang untuk mendapatkan kelompok telur lebih banyak. Kelompok telur yang telah diperoleh dari lapang kemudian disimpan dalam wadah plastik dan dipelihara hingga telur menetas menjadi larva. Sebelum diinfestasi, tanaman padi berumur 21 HSS, 1 MST, 2 MST, 3 MST, dan 4 MST disemprot dengan 5 g cendawan endofit/20 pot.
13 Infestasi Larva Penggerek Batang ke Tanaman Infestasi larva dilakukan sebanyak lima kali pada tanaman padi umur 1 MST, 2 MST, 3 MST, 4 MST, dan 5 MST (Gambar 3). Hal ini bertujuan untuk melihat interaksi cendawan endofit dengan umur tanaman. 10 ekor larva instar 1 diinfestasi ke 10 batang padi. Setiap batang padi berisi 1 ekor larva. Larva dimasukkan ke dalam pelepah batang padi dengan menggunakan kuas dan diamati hingga larva bergerak masuk ke dalam batang. 0 MST 1 MST 2 MST 3 MST 4 MST 5 MST 6 MST S1 I1 P1 S = Semprot I = Infestasi P = Pengamatan S2 I2 P2 S3 I3 P3 S4 I4 P4 Gambar 3 Diagram Alur Infestasi Larva S5 I5 P5 Pengaruh cendawan endofit terhadap penggerek batang padi dapat diamati melalui ketahanan hidup larva. Pengamatan dilakukan setiap 7 hari setelah infestasi. Batang padi dicabut dan dibersihkan dari akar dan daun. Pelepah batang padi dibedah satu persatu. Pengamatan dilakukan terhadap persentase larva hidup dengan mencatat jumlah larva hidup dan mengukur panjang tubuh lava. Persentase larva hidup dihitung dengan menggunakan rumus: Reisolasi Cendawan Endofit Reisolasi cendawan endofit dari batang padi bertujuan untuk melihat kemampuan kolonisasi cendawan endofit pada batang padi. Reisolasi dilakukan dengan mengambil batang padi tidak terserang penggerek umur 21 HSS dan 6
14 MST. Batang padi dipisahkan dari pelepah, daun, dan akarnya kemudian dicuci dengan akuades hingga bersih. Batang padi yang diambil antara ruas ke-3 dan ke- 4 batang bawah di bawah tangkai malai. Dua ruas batang padi tersebut dipotong tiga bagian dengan panjang 3 cm. Reisolasi dilakukan di laminar air flow. Potongan batang padi disterilisasi permukaan dengan akuades, alkohol 70% selama 1 menit, NaOCl 1% selama 1 menit, dibilas kembali dengan akuades dua tahap, dan dikeringanginkan. Batang padi tersebut diisolasi pada media PDA kemudian diinkubasi selama 1 minggu, kemudian cendawan endofityang tumbuh diamati dan dihitung. Pemurnian dilakukan dengan memindahkan cendawan endofit Nigrospora sp. dan Acremonium sp. yang tumbuh ke media PDA baru yang terdiri dari satu isolat. Kolonisasi cendawan endofit dihitung dengan rumus: n : jumlah contoh yang terinfeksi cendawan endofit ke-i N: jumlah contoh Cendawan diidentifikasi dengan menggunakan compound microscope perbesaran 400x. Identifikasi dilakukan dengan melihat struktur mikroskopik cendawan endofit yaitu konidia atau spora, konidiofor, serta percabangan konidiofornya. Identifikasi cendawan endofit dapat dilakukan dengan kunci identifikasi Barnett & Hunter (1988). Rancangan Percobaan dan Analisis Data Percobaan disusun dalam rancangan faktorial dengan 2 faktor. Faktor pertama yaitu cendawan endofit dengan 4 taraf antara lain: Nigrospora sp.1, Acremonium sp., kombinasi cendawan endofit Nigrospora sp.1 + Acremonium sp. dan kontrol (tanpa endofit). Faktor kedua yaitu umur tanaman saat infestasi larva dengan 5 taraf antara lain: 1 MST, 2 MST, 3 MST, 4 MST, dan 5 MST. Masingmasing perlakuan memiliki 5 ulangan. Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis sidik ragam menggunakan Statistical Analysis System (SAS) v9 dan Minitab 14. Perlakuan yang berpengaruh diuji lanjut dengan uji Duncan pada taraf α = 0.05.