Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2005 OBSERVASI KUALITAS SPERMATOZOA PEJANTAN SIMMENTAL DAN PO DALAM STRAW DINGIN SETELAH PENYIMPANAN 7 HARI PADA SUHU 5 C (Observation on Sperm Quality of Simmental and PO in chilled Semen After Kept at 5 o C for 7 Days ) WULAN CAHYA PRATIWI, L. AFFANDHY dan D. PAMUNGKAS Loka Penelitian Sapi Potong, Jl. Pahlawan No. 2 Grati, Pasuruan 67184 ABSTRACT The aim of this study was to investigated the quality of chilling semen which was kept at 5 C for seven days. The Simmental (I 2, 900 kg of live weight) and PO (I 2, 530 kg of live weight) bulls were used for semen provision. The experiment was done in Local AI Center of Blora and Beef Cattle Research Station Laboratory. Through five collection, the volume Simmental s and PO s semen as 5,3 ± 1,4 ml/ejakulate and 9,0 ± 1,7 ml/ejakulate (respectively); progresive mass 3+ and 3-, ph 7.0; motility 86.0 ± 6.5% and 85,0 ± 5.0% (respectively); concentration of 1240.0 ± 242.1 million/cc and 926.7 ± 360.2 million/cc (respectively); the live sperm 90,5 ± 5.2% and 93.3 ± 6.0% (respectively). There were changes quality of chilling semen which was kept at 5 C for seven days. The motility was decreased from 79.0% (0 day) to 50.0% (day 7) on Simmental s semen. Like wise the motility of PO s semen was decrease from 82.5% (0 day) to 65.0% (day 7). The quality of chilling semen of Simmental s and PO s bulls which was kept at 5 o C for seven days can be used for inseminating. Key Words: Simmental and PO Bull, Chilling Semen, The Quality of Spermatozoa ABSTRAK Pengembangan semen cair di lapang membutuhkan pemantapan dalam proses pembuatannya terkait dengan perubahan kualitas spermatozoa. Penelitian ini bertujuan mengetahui perubahan kualitas spermatozoa hasil proses pembuatan semen dingin Sumber semen berasal dari pejantan Simmental (I 2, berat badan 900 kg) dan PO (I 2, berat badan 530 kg) masing-masing diproses di laboratorium BIBD/UPTD Dinas Pertanian Kabupaten Blora dan di laboratorium Reproduksi Lolit Sapi Potong Grati. Kualitas spermatozoa yang diamati pada kondisi segar, setelah proses pada 0 hari dan 7 hari penyimpanan suhu 5 o C dalam cooling unit. Hasil pengamatan semen segar pejantan Simmental dan PO (dalam lima kali koleksi) menunjukkan masing-masing: volume/eyakulat 5,3 ± 1,4 ml dan 9,0 ± 1,7 ml; gerak massa 3+ dan 3-; ph 7,0; motilitas 86,0 ± 6,5% dan 85,0 ± 5,0%; konsentrasi spermatozoa 1240,0 ± 242,1 juta/cc dan 926,7 ± 360,2 juta/cc, Live sperm 90,5 ± 5,2% dan 93,3 ± 6,0%. Terdapat perubahan kualitas spermatozoa pada proses penyimpanan baik pada 0 hari maupun 7 hari pada t 5 C. yakni penurunan motilitas spermatozoa asal pejantan Simmental dari 79,0% (0 hari) hingga 50,0% (7 hari); demikian halnya motilitas spermatozoa asal pejantan PO juga mengalami penurunan motilitas dari 82,5% (0 hari) hingga 65,0% (7 hari). Kualitas semen dingin asal pejantan Simmental dan PO hingga hari ke-7 penyimpanan masih layak untuk diinseminasikan. Kata Kunci: Pejantan Simmental Dan PO, Semen Dingin, Kualitas Spermatozoa PENDAHULUAN Peningkatan produktivitas sapi potong perlu didukung teknologi reproduksi terutama yang berhubungan dengan efesiensi dan pengelolaan reproduksi guna memperbaiki dan mempertahankan fertilitasnya. Perbaikan fertilitas yang lebih mudah diterapkan adalah dengan kontrol estrus dan waktu inseminasi yang tepat melalui teknologi inseminasi buatan (IB) dengan menggunakan semen cair (chilled semen) ataupun semen beku (frozen semen). Inseminasi Buatan (IB) merupakan teknologi alternatif yang cukup berhasil dan 200
sudah diterima oleh peternak secara luas, karena aplikasinya murah dan cukup efektif dalam menunjang siklus reproduksi betina. Penggunaan IB dinilai bermanfaat untuk meningkatkan kinerja dan potensi ternak, mempermudah tes progeni dan meningkatkan jumlah keturunan dari pejantan yang telah terbukti mempunyai sifat-sifat unggul untuk tujuan produksi tertentu (HUNTER, 1982). Teknologi IB menggunakan semen beku telah dikenal di seluruh Indonesia. Permasalahan dalam penanganan semen beku yang sering dijumpai di lapang adalah: kesulitan dan keterlambatan dalam memperoleh nitrogen cair dan keterbatasan kontainer di lapang (HEDAH dan HERLIANTIEN, 1993). Dengan adanya kendala pada penggunaan semen beku di daerah maka dapat digunakan teknologi alternatif IB yang berupa semen cair. Semen cair dapat digunakan secara langsung untuk perkawinan sapi, baik untuk skala industri maupun pada peternakan rakyat. Hasil penelitian pembuatan bahan pengencer semen menunjukkan bahwa biaya bahan pengencer semen cair lebih murah daripada semen beku (RASYID et al., 2002). Penggunaan bahan pengencer dapat mempengaruhi kualitas spermatozoa terutama dalam proses pembuatan semen cair dan beku (HENDRI et al., 1999). Penggunaan pengencer adalah untuk menjamin kebutuhan fisik dan kimia spermatozoa sehingga kualitas spermatozoa dapat dipertahankan khususnya pada kemampuan untuk kapasitasi (PARTODIHARDJO, 1992). Fungsi pengencer menurut PARTODIHARDJO (1992) adalah: 1. Memperbanyak volume semen. 2. Melindungi spermatozoa dari cold shock. 3. Menyediakan zat makanan sebagai sumber energi bagi spermatozoa. 4. Menyediakan buffer untuk mempertahankan ph, tekanan osmotic dan keseimbangan elektrolit. Daya hidup spermatozoa selama penyimpanan dalam waktu lama pada suhu 5 0 C dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu kualitas semen segar, kestabilan suhu selama penyimpanan, ph pengencer dan lingkungan (TOELIHERE, 1993). Penggunaan pengencer tris aminomethan kuning telur terbukti lebih mampu mempertahankan kualitas spermatozoa dibandingkan dengan tris aminomethan tanpa kuning telur (SUSILAWATI, 2002). Penggunaan pengencer tris aminomethan pada semen cair karena keunggulannya dalam mempertahankan perubahan ph, tekanan osmotik, keseimbamngan elektrolit dan osmolaritas (HAFEZ, 1993). Penambahan kuning telur pada pengencer tris diperlukan karena di dalam kuning telur mengandung lipoprotein dan lesitin yang melindungi integritas sel sperma dari cold shock pada suhu penyimpanan 5 0 C. Daya tahan hidup spermatozoa lebih pendek di dalam lingkungan oksigen daripada dalam lingkungan nitrogen. Hal tersebut berkaitan dengan fungsi oksigen sebagai unsur oksidatif dalam proses metabolisme yang menghasilkan produk sisa oksidasi metabolisme yang membahayakan seperti hydrogen peroksida (SALISBURY dan VANDEMARK, 1985). Peroksida tersebut berperan utama dalam proses penuaan, memperpendek daya hidup spermatozoa, menginduksi perubahan struktur terutama pada daerah akrosom dan penurunan motilitas secara cepat (GAZALI dan TAMBING, 2002). Tujuan Penelitian ini adalah untuk mengetahui kualitas spermatozoa antara pejantan sapi potong Simmental dan PO yang disimpan hingga 7 hari pada suhu 5 C. MATERI DAN METODE Penelitian ini dilakukan di dua tempat yaitu di Laboratorium Balai Inseminasi Buatan Daerah (BIBD) Tunjungan Dinas Pertanian Kabupaten Blora, Jawa Tengah dan Laboratorium Loka Penelitian Sapi Potong Grati, Pasuruan, Jawa Timur. Materi yang digunakan adalah sapi pejantan dewasa Simmental (I 2, bobot badan 900 kg) dan PO (I 2, bobot badan 530 kg) masing-masing satu ekor. Penelitian ini dilakukan ulangan sebanyak 5 kali penampungan/proses pada masing-masing pejantan Simmental dan PO. Prosedur penelitian Sebelum dilakukan proses pembuatan semen cair terlebih dahulu dilakukan penampungan dan pemeriksaan kualitas semen segar yang meliputi volume, warna, 201
konsistensi, ph, gerakan massa, motilitas, persentase spermatozoa hidup, konsentrasi spermatozoa dengan hasil sesuai standar untuk proses pembuatan semen cair yaitu motilitas > 70%, gerakan massa > ++, sperma hidup > 70%, konsentrasi sperma >500 (juta/ml) (Tabel 1). Selanjutnya dilakukan proses pembuatan semen cair sebagai berikut: 1. Pembuatan pengencer tris aminomethan yang terdiri dari: Tris (3,028 g); Citric Acid (1,675 g); Fructose (1,250 g); Penicillin (0,0525 g); Streptomycyn (0,075 g). 2. Pembuatan pengencer A pada temperatur 35 C yang terdiri dari: tris aminomethan + 10% v/v kuning telur + 2,4% v/v gliserol. 3. Pembuatan pengencer B pada temperatur 35 C yang terdiri dari: tris aminomethan + 10% v/v kuning telur + 5,6% v/v gliserol. 4. Penambahan semen ke dalam pengencer A pada temperatur 35 C dengan konsentrasi spermatozoa 70 juta/cc. 5. Pendinginan pengencer A dan B dilakukan secara bertahap dengan mengatur suhu pada 35 C, kemudian diturunkan sampai 15 C, 10 C dan akhirnya sampai suhu 5 C. Pada tiap tahap penurunan suhu tersebut dilakukan penambahan pengencer B ke pengencer A. Sehingga total volume pengencer A = volume pengencer A awal + pengencer B. 6. Semen disimpan pada suhu 5 C selama 0 7 hari. 7. Evaluasi semen pada suhu 5 C dari 0 hari sampai dengan 7 hari yang meliputi ph, motilitas, spermatozoa hidup, mati dan abnormal. Analisis data Data kualitas semen segar dan semen cair dianalisis dengan uji beda rata-rata (Mean test) dan disampaikan secara deskriptif HASIL DAN PEMBAHASAN Simmental Simmental dalam lima kali penampungan menunjukkan hasil yang cukup baik (Tabel 1). Tabel 1 menunjukkan rataan volume semen mencapai 5,3 ± 1,4 ml/ejakulasi. Volume semen ini lebih rendah daripada volume semen yang dihasilkan oleh sapi turunan Simmental pada penelitian ANGGRAENY et al (2004) yaitu 5,8 ± 0,8 ml/ejakulasi. Rataan ph semen dari lima kali penampungan adalah 7,0 ± 0,0 dengan gerak massa 3+. Warna semen adalah cream dengan konsistensi kental. Konsentrasi sperma per ml 1240,0 ± 242,1 juta, sedangkan motilitasnya adalah 86,0 ± 6,5%. Rataan sperma hidup, mati dan abnormal masingmasing adalah 90,0 ± 5,2%; 8,9 ± 4,5% dan 1,2 ± 0,8%. Hal ini menunjukkan bahwa karakteristik semen pejantan sapi potong Tabel 1. Rataan kualitas semen segar pejantan sapi potong Simmental dan PO Parameter Kualitas semen segar Simmental Kualitas semen segar PO Volume (cc/ejakulat) 5,3 ± 1,4 9,0 ± 1,7 Warna Putih susu Putih susu Konsistensi Kental Sedang-kental Konsentrasi spermatozoa (juta/cc) 1240,0 ± 242,1 926,7 ± 360,2 Gerakan Massa 3 + + 3 PH 7,0 ± 0,0 7,0 ± 0,0 Motilitas 86,0 ± 6,5 85,0 ± 5,0 Spermatozoa hidup 90,0 ± 5,2 93,3 ± 6,0 Spermatozoa mati 8,9 ± 4,5 5,3 ± 5,0 Spermatozoa abnormal 1,2 ± 0,8 1,3 ± 1,5 202
Simmental dalam kisaran normal sehingga dapat diproses lebih lanjut untuk pembuatan semen cair. TOELIHERE (1993) menyatakan bahwa kisaran normal volume semen sapi antara 5 7 ml, konsentrasi 1000 1800 juta sel/ml, motilitas sebesar 65% dan nilai rata-rata spermatozoa yang mati berkisar 20%, sedangkan untuk pembuatan semen cair standar yang harus dipenuhi adalah gerakan massa ++ sampai dengan +++, motilitas > 70%, konsentrasi sperma > 750 juta/ml ejakulat dengan konsistensi sedang sampai dengan kental dan warna putih kekuningan hingga cream (AFFANDHY et al., 2004). PO PO dalam lima kali penampungan menunjukkan hasil yang cukup baik (Tabel 1). Rataan volume semen mencapai 9,0 + 1,7 ml/ejakulasi. Volume semen ini lebih tinggi daripada rataan volume semen sapi PO dalam kondisi peternakan rakyat (6,1 ± 0,2) (AFFANDHY et al., 2003). Rataan ph semen dari lima kali penampungan adalah 7,0 + 0,0 dengan gerak massa +++. Warna semen adalah cream dengan konsistensi sedang sampai kental. Konsentrasi per ml 926,7 ± 360,2 juta, sedangkan motilitasnya adalah 85,0 ± 5,0%. Rataan sperma hidup, mati dan abnormal masing-masing adalah 93,3 ± 6,0%; 5,3 ± 5,0% dan 1,3 ± 1,5%. GARNER dan HAFEZ (1993) menyatakan bahwa volume normal semen per ejakulasi berkisar 5 8 ml dan konsentrasi semen dengan metode penampungan menggunakan vagina buatan adalah berkisar 800 2000 juta/ml. Dengan demikian dapat dinyatakan bahwa rataan kualitas semen segar pejantan sapi potong PO tersebut dalam kisaran normal dan layak digunakan untuk pembuatan semen cair yang disimpan pada 5 C. Standar/patokan Lolit Sapi Potong terhadap kualitas semen yang dapat diproses lebih lanjut adalah semen tersebut mempunyai gerak massa minimal ++; dimana ciri-ciri gerakan cepat seperti mendung yang berputar (PARTODIHARJO, 1992). Kualitas semen pada suhu 5 C Rataan kualitas semen pejantan Simmental hingga hari ketujuh masih dalam batas normal walaupun mengalami penurunan motilitas, yaitu dari 79,0 ± 4,2 (0 hari) hingga 50,0 ± 0,0 (7 hari) (Tabel 2). Begitu pula dengan rataan motilitas semen pejantan PO hingga hari ketujuh pada 5 C juga menunjukkan penurunan dari 82,5 ± 6,6% (0 hari) hingga 65,0 ± 7,1% (7 hari) (Tabel 3). Walaupun demikian, penurunan motilitas spermatozoa pada penyimpanan 0 hari hingga 7 hari pada suhu 5 C baik pada semen pejantan Simmental maupun PO tidak berbeda nyata (P > 0,05). Hal ini seiring dengan penurunan kuantitas spermatozoa hidup pada semen pejantan Simmental maupun PO, yakni masing-masing menurun sebanyak 28,1 dan 6,4% dari kondisi 0 hari hingga 7 hari pada 5 C. Rataan persentase spermatozoa hidup pejantan Simmental mengalami penurunan dari 86,0 ± 4,8 (0 hari) hingga 57,9 ±16,7 (7 hari) (Tabel 2); sedangkan pada pejantan PO menurun dari 85,4 ± 7,0 (0 hari) hingga 79,0 ± 8,5 (7 hari) (Tabel 3). Rataan persentase spermatozoa mati pada semen pejantan Simmental maupun PO mengalami kenaikan (Tabel 2 dan 3) masingmasing yaitu 11,9 ± 4,9 dan 12,5 ± 7,2 (0 hari) naik menjadi 40,3 ± 16,2 dan 20,5 ± 7,8 (7 hari). Walaupun demikian penurunan kuantitas spermatozoa hidup tidak berbeda nyata (P > 0,05) antara semen pejantan Simmental maupun PO. Penurunan motilitas dan kuantitas spermatozoa hidup pada semen sapi Simmental maupun PO yang sejalan dengan lamanya penyimpanan dapat disebabkan oleh adanya asam laktat sisa metabolisme sel yang menyebabkan kondisi medium menjadi semakin asam Kondisi ini dapat bersifat racun bagi spermatozoa yang akhirnya menyebabkan kematian sperma (SUGIARTI et al., 2004). Faktor luar yang mempengaruhi metabolisme spermatozoa antara lain keadaan spermatozoa di dalam alat kelamin betina, konsentrasi spermatozoa, kerapatan O 2 dan gas CO 2, konsentrasi ion dan efek cahaya (RULIANSYAH, 1984). Spermatozoa yang mati akan menyerap warna dan berwarna gelap, sedangkan yang hidup mempunyai warna yang transparan, saat 203
diberi pewarnaan eosin negrosin. Hal ini terjadi karena membran plasma masih berfungsi baik. Membran plasma utuh mutlak harus dimiliki oleh spermatozoa agar dapat memfertilisasi oosit, karena selain berfungsi melindungi secara fisik organel-organel sel, membran plasma juga mengatur keluar masuknya zat-zat makanan serta keseimbangan elektrolit intra dan ekstraseluler. Apabila membran plasma rusak maka proses metabolisme sel akan terganggu dan berakibat kematian sperma (SUGIARTI et al., 2004). Tabel 2. Rataan kualitas semen cair pejantan sapi potong Simmental pada suhu 5 C di BIBD Tunjungan Dinas Pertanian Kabupaten Blora Parameter Kualitas semen cair 0 hari 7 hari ph 7,5 ± 0,0 7,5 ± 0,0 Motilitas 79,0 ± 4,2 50,0 ± 0,0 Spermatozoa hidup 86,0 ± 4,8 57,9 ± 16,7 Spermatozoa mati 11,9 ± 4,9 40,3 ±16,2 Spermatozoa abnormal 1,4 ± 0,4 1,9 ± 1,8 Tabel 3. Rataan kualitas semen cair pejantan sapi potong PO pada suhu 5 C di Lolit Sapi Potong, Grati - Pasuruan Parameter Kualitas semen cair 0 hari 7 hari ph 7,5 ± 0,0 7,5 ± 0,0 Motilitas 82,5 ± 6,6 65,0 ± 7,1 Spermatozoa hidup 85,4 ± 7,0 79,0 ± 8,5 Spermatozoa mati 12,5 ± 7,2 20,5 ±7,8 Spermatozoa abnormal 1,9 ± 0,2 0,5 ± 0,7 Persentase abnormalitas antara semen sapi Simmental dan PO yang disimpan pada suhu 5 C tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (P > 0,05). Nilai abnormalitas kedua jenis semen tersebut masih dalam kisaran normal semen yang subur dan dapat dipakai untuk Inseminasi Buatan. Hal ini sesuai dengan pendapat TOELIHERE (1993) yang menyatakan bahwa abnormalitas kurang dari 20% masih dapat dipakai untuk inseminasi. Jika abnormalitas sperma sapi mencapai 35%, maka hal itu nenunjukkan ketidaksuburan dari pejantan tersebut. Tabel 2 dan 3 menunjukkan bahwa penyimpanan pada suhu 5 0 C dan lamanya waktu penyimpanan sampai hari ketujuh tidak mempengaruhi kenaikan abnormalitas baik pada semen pejantan Simmental maupun PO. Hasil ini dipengaruhi oleh kualitas sperma yang dihasilkan oleh kedua bangsa sapi tersebut mempunyai kualitas yang baik dan layak digunakan dalam pembuatan semen cair. KESIMPULAN 1. Evaluasi terhadap kualitas spermatozoa sapi Simmental dan PO dalam kondisi segar menunjukkan hasil yang sesuai dengan standar untuk diproses lebih lanjut menjadi semen cair. 2. Kualitas spermatozoa pejantan sapi Simmental dan PO dalam penyimpanan pada 5 C selama 7 hari menunjukkan penurunan dari kondisi segar baik pada persentase motilitas, spermatozoa hidup. Namun penurunannya itu masih diatas batas normal dan layak untuk diinseminasikan pada sapi induk. SARAN Diperlukan penelitian lebih lanjut penyebab rendahnya persentase motilitas dan spermatozoa hidup semen pejantan sapi Simmental dan PO pada penyimpanan pada 5 C selama 7 hari. DAFTAR PUSTAKA ANGGRAENY, Y.N., L. AFFANDHY dan A. RASYID. 2004. Efektivitas substitusi pengencer Tris- Sitrat dan Kolesterol menggunakan air kelapa dan kuning telur terhadap kualitas semen beku sapi potong. Pros. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor, 4 5 Agustus 2004. Puslitbang Peternakan. Bogor. hlm. 49 56. 204
AFFANDHY. L., D. PAMUNGKAS, A. RASYID dan P. SITUMORANG. 2003. Uji fertilitas semen cair dan beku pada pejantan sapi potong lapang. Laporan Penelitian. Loka Penelitian Sapi Potong. AFFANDHY, L., D. PAMUNGKAS, dan D. T. RAMSIATI. 2004. Pembuatan semen cair pada sapi potong. Juknis. Loka Penelitian Sapi Potong, Grati. hlm. 11. GARNER, D.L. and E.S.E HAFEZ. 1993. Spermatozoa and Seminal Plasma. In: Reproduction in Farm Animal. HAFEZ, E.S.E. (Ed.) Six Edition. LEA and FEBIGER. Philadelpia. GAZALI, M. dan S. N. TAMBING. 2002. Kriopeservasi sel spermatozoa. Hayati 9: 27 32. HAFEZ, E.S.E. 1993. Reproduction in Farm Animals. 6 th Edition. Lea Febiger. Philadelphia. pp. 440 443. HEDAH, D. dan HERLIANTIEN. 1993. Handling Semen Beku. Pros. Pertemuan Pembahasan Hasil Penelitian Seleksi Bibit Sapi Madura Guna Meningkatkan Mutu Sapi Madura. Sub Balitnak, Grati, 8 September 1993. HENDRI, JASWANDI dan M. MUNDANA. 1999. Pengaruh pembekuan spermatozoa, penambahan caffeine dan heparin dalam media Brockett Oliphant terhadap angka fertilisasi in vitro pada sapi. J. Penelitian Andalas. 11(29): 34 37. HUNTER, R.H.F. 1982. Reproduction on farm animal. School of Agriculture University of Edinburgh. Longman, London and New York. PARTODIHARDJO. 1992. Ilmu Reproduksi Hewan. Cetakan ketiga. Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Penerbit Mutiara Sumber Wijaya, Jakarta Pusat. RASYID, A., L. AFFANDHY, P. SITUMORANG, D. B. WIJONO, T. SUGIARTI dan Y. N. ANGGRAENY. 2002. Evaluasi Kualitas dan Pengolahan Semen pada Sapi Potong. Laporan Loka Penelitian Sapi Potong, Grati. RULIANSYAH. 1984. Penggunaan air kelapa sebagai pengencer semen pada ternak. Skripsi. Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. SAILI, T. 1999. Efektivitas penggunaan albumen sebagai medium separasi dalam upaya merubah rasio alamiah spermatozoa pembawa kromosom X dan Y pada sapi. Tesis. Program Pasca Sarjana. Institut Pertanian Bogor. SALISBURy, G.W. dan H.L. VAN DENMARK. 1985. Fisiologi reproduksi dan inseminasi buatan pada sapi. Penterjemah Prof. Drs. R. Djanuar. Gajahmada University Press. Yogyakarta. SITUMORANG, P. 2002. Pengaruh Kolesterol terhadap daya hidup dan fertilitas spermatozoa sapi. JITV 7(4): 251 258. STEVENSON, J. S., M.W. SMITH, J.R. JAEGER, L.R. CORAH and D. G. LEFEVER. 1996. Detection of estrus by visual observation and radiotelementry beef heifers. J. Anim. Sci. 74: 729 735. SUGIARTI, T., E. TRIWULANNINGSIH, P. SITUMORANG, R.G. SIANTURI dan D.A. KUSUMANINGRUM. 2004. Penggunaan katalase dalam produksi semen dingin sapi. Pros. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor, 4 5 Agustus 2004. Puslitbang Peternakan, Bogor. hlm. 215 220. SUSILAWATI, T. 2002. Perbedaan kualitas spermatozoa hasil seleksi jenis kelamin pada sapi menggunakan gradien putih telur pada pengencer tris dan tris kuning telur. J. Ilmiah Peternakan dan Perikanan (PROTEN), Universitas Muhammadiyah Malang: 195 203. TOELIHERE, M. R. 1993. Inseminasi Buatan pada Ternak. Cetakan ke 10. Penerbit Angkasa Bandung. 205