BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah Pemerintah pusat dan pemerintah daerah selain berkewajiban menjamin keamanan produk obat dan makanan, saat ini juga mulai berupaya untuk menjamin kehalalan produk obat dan makanan. Di Indonesia, sejak tanggal 25 September 2014, telah diterbitkan Undang-undang Jaminan Produk Halal (UU JHP). Jaminan halal merupakan syarat keamanan bagi umat Muslim. Dalam kaitannya dengan produk obat, makanan dan kosmetika, halal berarti produk farmasetik, kosmetika, makanan, minuman yang diperbolehkan, legal dan sesuai hukum Islam yang dapat dikonsumsi oleh seorang Muslim. Komponen nonhalal salah satunya adalah turunan atau derivat babi yang banyak ditemui secara luas di banyak sediaan komersial. Derivat babi yang dimaksud adalah daging babi, lemak babi, serta gelatin yang berasal dari tulang dan kulit babi (Rohman dan Che Man, 2011). Gelatin adalah protein yang berasal dari hidrolisis kolagen. Sifat gelatin yang stabil, tebal dan lengket dimanfaatkan sebagai bahan pengikat dan pengental berbagai produk makanan seperti permen karet, permen lunak dan marshmallows (Jones, 1977). Gelatin di industri farmasi dimanfaatkan sebagai bahan pembuat cangkang kapsul, tablet, granul, suplemen makanan, dan lain-lain termasuk dalam proses coating obat (Jones, 2004). Meskipun gelatin yang diproduksi pabrik telah diberi label asal bahan utama, namun tetap dibutuhkan suatu jaminan tidak terjadinya kontaminasi dari derivat babi. Metode analisis yang dikembangkan 1
untuk menjamin deteksi dan kuantifikasi gelatin yang berasal dari babi sangat diperlukan. Hal ini dikarenakan raw material gelatin rawan terhadap kontaminasi silang dan pemalsuan (Riaz dan Chaudry, 2003). Deteksi dan kuantifikasi kandungan DNA sapi dan DNA babi sebagai bahan baku gelatin diperlukan bukan hanya karena alasan kepercayaan agama tetapi juga karena alasan kesehatan (Cai dkk., 2012). Alasan kepercayaan agama karena komunitas Muslim dan Yahudi dilarang mengonsumsi produk yang mengandung babi. Dari sisi kesehatan, adanya kekhawatiran terhadap penyakit bovine spongiform encephalopathy (BSE) yang disebabkan oleh hewan sapi, flu babi, dan reaksi alergi yang terjadi pada beberapa konsumen yang sensitif (Azira dkk., 2014). Bahan gelatin dan cangkang kapsul dalam proses produksinya mengalami denaturasi protein marker dengan temperatur dan ph yang ekstrim. Analisis dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) menawarkan alternatif uji untuk bahan yang mengalami proses produksi seperti tersebut di atas karena stabilitas DNA yang lebih baik dibandingkan metode analisis protein lainnya seperti metode enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Analisis PCR merupakan analisis berdasarkan sekuen DNA dengan menggunakan primer yang spesifik untuk berbagai spesies (Tasara dkk., 2005). Dalam analisis dengan PCR, primer berfungsi sebagai penginisiasi reaksi polimerisasi DNA sekaligus pembatas daerah yang akan diamplifikasi. Primer yang ideal memiliki urutan basa nukleotida yang tepat berpasangan dengan urutan basa target DNA yang akan diamplifikasi dan tidak menempel pada tempat 2
lainnya (Muladno, 2010; Sudjadi, 2008). Susunan primer yang benar merupakan hal yang penting bagi keberhasilan reaksi PCR (Wang dan Seed, 2006). Primer dengan target DNA mitokondria babi untuk autentikasi makanan telah dilakukan beberapa peneliti yaitu sekuen sitokrom b oleh Ali dkk. (2012) dan juga Sahilah dkk. (2012), sedangkan Karabasanavar dkk. (2014) menggunakan sekuen D-Loop. DNA mitokondria diturunkan secara maternal sehingga membuat DNA mitokondria unik dan dapat digunakan untuk membedakan antar individu (Durham dan Chinnery, 2006; Murugaiah dkk., 2009). SYBR Green dan probe TaqMan merupakan senyawa kimia yang paling banyak digunakan untuk memantau amplifikasi yang terjadi pada setiap siklus real time PCR. SYBR Green dinilai lebih mudah digunakan karena tidak perlu merancang probe (Bio-Rad, 2006). Soares dkk. (2013) telah berhasil mengembangkan metode SYBR Green real time PCR untuk mendeteksi dan kuantitasi DNA babi dalam produk daging olahan. Metode yang telah dikembangkan untuk analisis sumber gelatin adalah sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electroforesis (SDS-PAGE) yang dikombinasikan dengan teknik kemometrika principle component analysis (PCA) (Azira dkk., 2014), HPLC yang digabungkan dengan principle component analysis (PCA) dan kemometrika lainnya (Widyaninggar dkk., 2012; Raraswati dkk., 2013), Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy yang dikombinasikan dengan teknik PCA (Hashim dkk., 2010), ELISA (Venien dan Levieux, 2005), PCR dan Southern-hybridization menggunakan biochip (Sahilah dkk., 2012). Analisis dengan Real Time PCR juga dilakukan oleh peneliti 3
Demirhan dkk. (2012) dengan menggabungkan primer spesifik DNA genom babi dan Taq polimerase dalam satu kit (SureFood Animal ID Pork Sens kit). Isolasi DNA babi dilakukan dengan menggunakan kit DNA ekstraksi (SureFood PREP Animal system). Cai dkk. (2012) juga telah mengembangkan analisis menggunakan TaqMan real time PCR dari primer spesifik sekuen DNA genom sapi dan genom babi dalam gelatin dan cangkang kapsul. Pengembangan primer yang belum pernah dipublikasikan dari DNA mitokondria D-Loop babi menjadi salah satu tujuan penelitian ini. DNA mitokondria D-Loop babi menjadi target yang menjanjikan untuk amplifikasi PCR karena DNA tetap stabil meskipun telah terdegradasi (Karabasanavar dkk., 2014). Primer didapatkan dengan cara merancang suatu primer menggunakan software NCBI-Primer BLAST di website NCBI-Primer BLAST. Pada perancangan primer ini didapatkan 5 kandidat primer seperti pada Tabel 1. 4
Tabel 1. Kandidat primer dari daerah D-Loop pada DNA mitokondria babi Template/ No Urutan basa 1. AM040615/ 23-42 157-176 2. AF276935/ 170-190 336-354 3. D16483/ 112-131 243-261 4. D16483/ 108-128 268-289 5. D16483/ 28-48 81-102 Sekuen 5-3 CGTATGCAAACCAAAACGCC TGCACGACGTACATAGGGTT CGTGCATTAACTGCTAGTCCC CAAGCGGGTTGCTGGTTTC TGCAAACCAAAACGCCAAGT TGCACGACGTACATAGGGT CGTATGCAAACCAAAACGCCA GCTTATATGCATGGGGACTAGC AGGAGACTAACTCCGCCATCA AATGCTTGTTTTGGTTGCAGGG Panjang Tm % Produk ( C) GC SC S3C 154 58.94 50.0 6 1 59.11 50.0 7 0 185 59.07 52.38 6 1 60.01 57.89 5 0 150 59.75 45.0 4 1 58.43 52.63 7 2 182 60.60 47.62 6 0 58.73 50.0 6 2 75 60.34 52.38 4 1 60.75 45.45 4 0 Keterangan: F =forward, R =reverse, Tm =melting temperature, %GC =prosentase jumlah basa G dan C, SC =self complementarity, S3C =self 3 complementarity, A =adenine, T =thymine, G =guanine, C =cytosine. Untuk konfirmasi apakah primer tersebut spesifik terhadap mitokondria D-Loop babi atau tidak, maka dilakukan BLAST ulang seperti pada Lampiran 1. Tahap selanjutnya dipilih 2 primer yang akan dipergunakan seperti pada Tabel 2, dan dilakukan pemesanan ke PT. Genetika (Jakarta). Primer D-Loop 112 adalah sepasang primer spesifik yang dapat mengamplifikasi fragmen mitokondria D- Loop babi pada urutan basa ke 112-261, sedangkan sepasang primer D-Loop 108 adalah primer spesifik yang dapat mengamplifikasi fragmen mitokondria D-Loop babi pada urutan basa ke 108-289. 5
Tabel 2. Primer hasil rancangan dari daerah D-Loop pada DNA mitokondria babi Target fragmen Mitokondria D-Loop Primer D-Loop 112 D-Loop 108 Sekuen 5 -TGCAAACCAAAACGCCAAGT-3 5 -TGCACGACGTACATAGGGT-3 5 -CGTATGCAAACCAAAACGCCA-3 5 -GCTTATATGCATGGGGACTAGC-3 Panjang Produk 150 182 Keterangan: F =forward, R =reverse, A =adenine, T =thymine, G =guanine, C =cytosine. Berdasarkan latar belakang tersebut di atas maka dapat dibuat rumusan masalah sebagai berikut: 1. Perumusan Masalah 1. Apakah dua pasang primer yang telah dirancang dari daerah D-Loop mitokondria dan telah dilakukan prosedur BLAST dapat mengidentifikasi secara spesifik adanya DNA babi di antara DNA lainnya (sapi, ayam, tikus, kambing, dan ikan lele) dengan metode real time PCR? 2. Apakah primer yang dirancang dari daerah D-Loop mitokondria tersebut dapat digunakan untuk analisis DNA babi dalam cangkang kapsul komersial? 2. Keaslian Penelitian Penelitian untuk mendeteksi sumber gelatin yang pernah dilakukan diantaranya adalah kajian penggunaan metode FTIR spectroscopy yang dikombinasikan dengan teknik PCA. Model yang dikembangkan mampu untuk membedakan sumber gelatin dari sapi maupun babi. Karakterisasi komponen gelatin menggunakan daerah spektra FTIR 3290-3280 cm -1 dan pembuatan model kalibrasi untuk analisis kuantitatif dilakukan pada daerah spektra 1660-1200 cm -1. Hasil PCA terlihat dari plot Cooman s yang menunjukkan 6
perbedaan yang jelas antara sampel gelatin yang berasal dari sapi maupun babi (Hashim dkk., 2010). Penelitian ini menggunakan gelatin murni dan tidak dalam cangkang kapsul. Metode PCR yang telah dikembangkan untuk analisis sumber gelatin dan produk-produknya dilaporkan oleh Sahilah dkk. (2012) yang meneliti kandungan DNA babi pada kapsul lunak dan kapsul keras yang dibeli di daerah Selangor, Malaysia pada bulan Juni tahun 2009 sampai dengan bulan Juli tahun 2010. Penelitian dilakukan dengan metode PCR dan juga metode multiplex PCR menggunakan tiga pasang primer yang selanjutnya dikonfirmasi dengan analisis southern hybridization. Primer diperoleh dari OLIPRO dengan target DNA mitokondria sitokrom b (cytb) dan gen actin. Dari hasil PCR, hanya terlihat amplifikasi daerah sitokrom b dengan sensitivitas sebesar 1 ng DNA genom per sampel. Hibridisasi dilakukan menggunakan OLIPRO porcine gene biochip, dan hasil yang diperoleh mempunyai tingkat sensitivitas sebesar 0,1 ng DNA genom per sampel. Penelitian mengenai analisis DNA babi dalam gelatin dan cangkang kapsul menggunakan metode real time PCR juga dilakukan oleh Cai dkk. (2012) yang meneliti DNA genom babi dan sapi dalam campuran gelatin dan cangkang kapsul menggunakan probe Taq Man yang mempunyai target daerah yang diamplifikasi spesifik pada DNA genom babi (forward: 5 -ATT TCC ATC CCA CAG CCC-3, reverse: 5 -AAC AGA TGC TGA CTC ACA GAC- 3, probe: 5 -CCC AAC CCC CAA ACT GTC TCC T-3 ) dan genom sapi (forward: 5 -CTA AGA TCA TGG CAT CAG GTC C-3, reverse: 5 -CCC 7
CAA AAT AAA GTC AGC CAC-3, probe: 5 -TCC ACT GTT TCC CCA TCT ATT TGC CA-3 ). Terdapat pula penelitian Demirhan dkk. (2012) yang menggunakan metode real time PCR untuk analisis asal gelatin dan gelatin dalam makanan dengan menggabungkan primer spesifik genom babi dan Taq polimerase dalam satu kit (SureFood Animal ID Pork Sens kit). Penelitian ini mengembangkan primer baru. Pada penelitian ini akan dikembangkan primer baru pada sekuen mitokondria D-Loop yang spesifik hanya untuk babi saja. Optimasi hasil rancangan primer dan pengembangan metode SYBR Green real time PCR dengan primer baru selanjutnya dilakukan konfirmasi pengujian spesifitas primer terhadap gelatin yang berasal dari babi, sapi, dan ikan lele. Pengujian sensitivitas dilakukan pada cangkang kapsul yang terbuat dari gelatin babi 100% dan campuran gelatin babi-sapi berbagai konsentrasi (sampai batas deteksi terendah yang masih dapat teramplifikasi). Uji keterulangan dilakukan pada cangkang kapsul yang terbuat dari campuran gelatin babi-sapi. 3. Urgensi Penelitian Penelitian ini sangat penting dalam kaitannya dengan metode analisis yang mampu mendeteksi dan mengkuantifikasi adanya DNA babi dalam sediaan farmasetik terutama cangkang kapsul untuk menjamin kehalalannya. Hampir 90% gelatin yang diproduksi berasal dari babi. Meskipun gelatin yang diproduksi harus berlabel namun tetap diperlukan jaminan kemurnian dan kemungkinan adanya kontaminasi silang dari bahan yang digunakan. Metode 8
analisis yang aplikatif sangat diperlukan untuk menjamin keaslian cangkang kapsul terutama dari kontaminasi silang maupun pemalsuan. B. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini secara umum adalah untuk mengembangkan metode analisa real time PCR untuk menentukan adanya DNA babi dalam cangkang kapsul. Secara rinci tujuan penelitian ini adalah: 1. Untuk menguji dua pasang primer dari daerah D-Loop mitokondria yang dirancang secara spesifik dan telah dilakukan prosedur BLAST untuk mengidentifikasi adanya DNA babi di antara DNA lainnya (sapi, ayam, tikus, kambing dan ikan lele) dengan metode real time PCR. 2. Untuk analisis DNA babi dalam cangkang kapsul komersial menggunakan primer yang telah dirancang dari daerah D-Loop mitokondria secara real time PCR. 9