REPLIKASI DAN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Transkripsi

1 REPLIKASI DAN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Debbie S. Retnoningrum Sekolah Farmasi, ITB Pustaka: 1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, hal ; Groves MJ, 2006, hal Brown TA, 2006, hal 6-7;

2 DOGMA SENTRAL BIOLOGI MOLEKULER Replikasi dan PCR 2

3 REPLIKASI Replikasi adalah penggandaan DNA Sintesis 2 molekul DNA dari 1 molekul DNA Konsep pasangan basa Arah 5 ke 3 pada untai yang disintesis Dikatalisis oleh DNA polimerase Replikasi dan PCR 3

4 Komponen komponen Replikasi DNA Mulai pada origin of replication (ori) Protein pengikat DNA untai tunggal Helikase (pembuka untai) Primase (RNA polimerase) DNA polimerase Replikasi dan PCR 4

5 Replikasi DNA REPLIKASI DNA: Pemanjangan untai baru DNA dntp: datp, dttp, dgtp, dctp Dikatalisis oleh DNA polimerase Replikasi dan PCR 5

6 DNA Polimerase Prokariot Pol I Pol II Pol III Eukariot Pol-α Pol-β Pol-δ Pol-γ Pol-ε Fungsi Gap filling & DNA repair Gap filling & DNA repair Replikasi Replikasi lagging strand Gap filling & DNA repair Replikasi leading strand Replikasi pada mitokondria Gap filling & DNA repair Replikasi dan PCR 6

7 Polymerase Chain Reaction (PCR) Karry Mullis, penemu PCR Pemenang hadiah Nobel Replikasi dan PCR 7

8 SIKLUS PCR SIKLUS 1 SIKLUS 2 SIKLUS 3 T 94 o C 72 o C 55 o C WAKTU (DETIK) Replikasi dan PCR 8

9 SIKLUS PCR dan HASIL AMPLIFIKASI Replikasi dan PCR 9

10 Polymerase Chain Reaction (PCR) Replikasi dan PCR 10

11 KOMPONEN PCR cetakan DNA oligonukleotida pendek (primer) DNA polimerase termostabil :Taq Polymerase (Thermus aquaticus) & buffer dntp (datp, dttp, dctp dan dgtp) Replikasi dan PCR 11

12 Genom yang ditentukan urutannya Replikasi dan PCR 12

13 Contoh informasi pada data genbank Replikasi dan PCR 13

14 Amplifikasi DNA target dalam genom organisme Replikasi dan PCR 14

15 Amplifikasi DNA target dalam genom organisme Replikasi dan PCR 15

16 DETEKSI PRODUK PCR Replikasi dan PCR 16

17 Replikasi dan PCR 17

18 PCR untuk deteksi Patogen P1 GEN TARGET P2 PRODUK PCR: 490 pb TARGET HARUS SPESIFIK PATOGEN Replikasi dan PCR 18

19 PCR UNTUK DETEKSI PATOGEN DETEKSI Mycobacterium tuberculosis DNA TARGET: FRAGMEN TARGET IS6110 BERSALINAN TINGGI Bahan dahak DETEKSI Chlamydia trachomatis DNA TARGET: GEN MAJOR OUTER MEMBRANE PROTEIN = MOMP Bahan usap vagina (4), darah (5), mata (6) Replikasi dan PCR 19

20 MODIFIKASI PCR PCR-HIBRIDISASI (PRODUK PCR DIHIBRIDISASI DENGAN PELACAK) PCR multipleks Nested-PCR PCR-sekuensing Real-time PCR Replikasi dan PCR 20

21 PRINSIP HIBRIDISASI Hybridization Addition of probe Denaturation Replikasi dan PCR 21

22 PCR HIBRIDISASI DENGAN DETEKSI KOLORIMETRI lisis PCR deteksi kolorimetri Σ molekul target Σsinyal denaturasi substrat hibridisasi Replikasi dan PCR 22

23 DETEKSI KOLORIMETRI TMB H2O2 Avidin Biotin Horse radish peroxidase Produk PCR Pelacak Replikasi dan PCR 23

24 PCR MULTIPLEKS PASANGAN PRIMER UNTUK DNA TARGET > 1 CONTOH: Escherichia coli: GEN TARGET gen LT1, ST1, SLT1, SLT2, VT1, VT2, VTE 7 PASANGAN PRIMER 7 PRODUK PCR Replikasi dan PCR 24

25 HASIL PCR MULTIPLEKS S A B C D LT1 ST1 SLT1 SLT2 VT1 VT2 VTE Replikasi dan PCR 25

26 Contoh Hasil PCR multipleks Replikasi dan PCR 26

27 Nested-PCR GEN FLAGELIN S. typhi ST1 458 pb ST3 PCR pertama ST4 ST2 PCR kedua 343 pb Replikasi dan PCR 27

28 Replikasi dan PCR 28

29 PCR SEKUENSING Replikasi dan PCR 29

30 PCR REAL-TIME PCR KONVENSIONAL: TAHAP AMPLIFIKASI DAN DETEKSI TERJADI SECARA KONSEKUTIF PCR REAL-TIME TAHAP AMPLIFIKASI DAN DETEKSI TERJADI SECARA SIMULTAN Replikasi dan PCR 30

31 Deteksi pada PCR konvensional Replikasi dan PCR 31

32 Daerah deteksi real-time PCR Replikasi dan PCR 32

33 PELACAK HIBRIDISASI Replikasi dan PCR 33

34 PELACAK HIBRIDISASI Replikasi dan PCR 34

35 Contoh hasil realtime PCR Replikasi dan PCR 35